基因引物组合和单细胞基因序列提取液试剂盒的制作方法

本发明涉及一种基因引物的组合以及包含该组合的试剂盒。更确切的说，是一种基因引物组合和单细胞基因序列提取液试剂盒。属于医用检测领域。

背景技术：

现有技术中要提取分析单个细胞存在技术上难题。一个细胞约重6皮克，细胞里的dna或rna仅仅处在皮克(picograms)级的水平，远远达不到现有测序仪的最低上样需求，必须先对单细胞内的微量核酸分子进行扩增，而且必须保证尽可能少地出现技术误差，以便开展后续的测序及其他研究。

针对传统pcr方法、荧光定量pcr、实时荧光定量pcr、多次退火环状循环扩增技术、dop-pcr，lm-pcr、pep-pcr、mda、pwga等方法单独用于检测单细胞时，这些扩增技术由于单个细胞只能提供两个模板dna，存在其局限性，并不能完全准确地提取出单细胞的dna。

为此，需要设计一种基因引物的组合和单细胞基因序列提取液试剂盒，借助基因多位点循环置换孵育扩增技术(gmct)方法能有效提取目的基因序列，为下游分析提供充足的实验材料。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中缺少有效的基因引物的组合和单细胞基因序列提取液试剂盒。本发明中，针对基因测序单个细胞只能提供两个模板dna特点，设计多个靶基因实现有效检测，并设计单细胞基因序列提取液试剂盒，有效提取单个细胞dna；采用基因多位点循环置换孵育扩增技术原理，设计多个靶基因，利用dna聚合酶进行基因多位点循环置换预孵育，再进行pcr扩增提取目的基因序列，为下游分析提供充足的实验材料。本发明通过如下技术方案达到：

一种基因引物的组合，其特征在于：包括六条基因引物，

所述第一引物的序列为：cagcgatgattacagtccagc；

所述第二引物的序列为：acaggccatgcacagagaga；

所述第三引物的序列为：cgggtaagggtactggcctt；

所述第四引物的序列为：gctgatctctgagtttcgcatt；

所述第五引物的序列为：cgttgatgggcggtaagtg；

所述第六引物的序列为：acaaacaactcccctcctcttg。

一种单细胞基因序列提取液试剂盒，包括引物、taq酶系，其特征在于：

所述引物为上述基因引物组合，引物与taq酶系分装于a1、a2、b3提取混合液管内；

其中a1提取混合液由下列组分组成：2.5μl的10pmol/μl引物，引物终浓度为30～900nm、25μl的dna聚合酶dntp缓冲液混合物终浓度1×、20.5μl的无菌去离子水；

a2提取混合液由下列组分组成：2.5μl的15pmol/μl引物，引物终浓度为30～900nm、25μl的phi29dna聚合酶dntp缓冲液混合物终浓度1×,20.5μl的无菌去离子水；

b3提取混合液由下列组分组成：2.5μl的25pmol/μl引物，引物终浓度为30～900nm，25μl的taq酶系dntp缓冲液混合物终浓度1×,20.5μl无菌去离子水。

本发明有益效果

本发明的基因引物组合，针对单细胞含量少只能提供两个模板dna而引起的提取困难问题，通过利用基因引物组合，大大提高其对单细胞基因序列提取液试剂盒的灵敏度，最终实现准确提取单细胞dna的效果。本发明不会形成二聚体的引物，操作方便快捷基因序列提取不超过4小时。单管置换,重复性好。

本发明能够为下游分析提供充足的实验材料，特别是取自早期胚胎的细胞数量稀少而珍贵，无法用传统技术开展研究的一些难以获取的、珍贵的临床细胞样本。现通过单细胞基因序列提取液试剂盒并采用基因多位点循环置换孵育扩增技术(gmct)方法，从单细胞基因组学研究中获得大数据。通过对病变组织和健康组织里特定细胞的基因序列比较分析，寻找其中的差异，了解与疾病相关的特异性基因表达改变情况，满足基因测序、实时荧光定量pcr检测等要求，具有广泛的临床应用前景，具有显著的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为基因多位点循环孵育原理图；

图2为基因多位点循环置换孵育原理图；

图3为基因多位点循环置换孵育扩增原理图；

图4为染色体核酸检测试剂盒的第一引物对和探针pcr荧光扩增原理图；

图5为核酸扩增荧光检测结果分析阴性图；

图6为核酸扩增荧光检测结果分析阳性图。

具体实施例

以下本实施例结合附图具体阐述本发明：

一种基因引物组合，其特征在于：包括六条基因引物，

所述第一引物的序列为：cagcgatgattacagtccagc；

所述第二引物的序列为：acaggccatgcacagagaga；

所述第三引物的序列为：cgggtaagggtactggcctt；

所述第四引物的序列为：gctgatctctgagtttcgcatt；

所述第五引物的序列为：cgttgatgggcggtaagtg；

所述第六引物的序列为：acaaacaactcccctcctcttg。

一种单细胞基因序列提取液试剂盒，包括引物、taq酶系，其特征在于：所述引物为上述基因引物组合，引物与taq酶系分装于a1、a2、b3提取混合液管内；

其中a1提取混合液由下列组分组成：2.5μl的10pmol/μl引物，引物终浓度为30～900nm、25μl的dna聚合酶dntp缓冲液混合物终浓度1×、20.5μl的无菌去离子水；

a2提取混合液由下列组分组成：2.5μl的15pmol/μl引物，引物终浓度为30～900nm、25μl的phi29dna聚合酶dntp缓冲液混合物终浓度1×,20.5μl的无菌去离子水；

b3提取混合液由下列组分组成：2.5μl的25pmol/μl引物，引物终浓度为30～900nm，25μl的taq酶系dntp缓冲液混合物终浓度1×,20.5μl无菌去离子水。

单细胞基因序列提取液试剂盒

本试剂盒适用于从单个胚胎分裂球、极体、单细胞、精子、血清、血浆、体液或组织液中提取基因序列,提取的基因序列可直接用于各种下游操作，包括基因测序，实时荧光定量pcr检测等。

检验原理

本试剂盒利用基因多位点循环置换孵育扩增技术(gmct),设计多(n)个靶基因，利用dna聚合酶进行基因多位点循环置换预孵育，再进行pcr扩增提取基因序列。

使用本品提供的提取试剂对样本进行处理和核酸提取，以本品中提供的提取液配制成反应管，将提取的核酸加入反应管，使用荧光定量pcr仪进行孵育，

主要组成成份

储存条件及有效期

经包装后的试剂盒(包含核酸提取试剂、a1反应混合液管、a2反应混合液管、b3反应混合液管)保存于—20±5℃环境下，有效期6个月。避免反复冻融。冻融次数不超过4次。试剂开瓶后，在室温条件下放置时间不应超过8小时。运输采用干冰(或者冰袋)保持低温，运输时间不应超过4天。

适用仪器abiprism7300abiprism7500,lightcycler480,da7600

样本要求

1适用标本类型：单个胚胎分裂球、极体、单细胞、精子、血清、血浆、体液或组织.

2标本采集：

2.1血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥试管，室温放置分钟，血标本可自然凝集释出血清，或直接使用水平离心机，1500转离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。

2.2血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含乙二胺四乙酸二钾(edta-2k)或无创基因管，立即轻轻颠倒试管混合10次，充分混匀，分钟后，1500转离心5分钟，吸取上层血浆，转移至1.5ml灭菌离心管。

2.3通过流式分选，缓冲液稀释和显微操作等方式获得的单细胞均可利用本试剂盒进行提取基因序列。虽然活细胞提取的结果较为理想，但本试剂盒对于经过多聚甲醛固定或激光微切割的样品，同样适用。

3标本保存和运送：所采集的标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶，无创基因管采集的标本可常温运送。

操作流程

第一步：0.2薄壁管，加入5μldna提取液(na0h100mmol/l、edta1.5mmol/l、tristonx-10050mmol/l、1％np-40、tris-hc1(ph＝8.0)50mmol/l)。

第二步：加入单细胞或微量模板。

第三步：8000转离心5秒。

第四步：100℃5分钟。

第五步：0.2薄壁管中加入a1提取混合液5μl。

第六步：8000转离心5秒，上机。

设置a1条件：

第七步：a1实验结束，取出0.2薄壁管高速12000转离心5分钟。

第八步：0.2薄壁管中加入a2提取混合液30μl。

第九步：8000转离心5秒，上机。

设置a2条件：

第10步：a2实验结束，取出0.2薄壁管高速12000离心5分钟。

第11步：0.2薄壁管中加入b3提取混合液35μl。

第12步：8000转离心5秒，上机。

设置b3条件：

第13步：b3实验结束，取出0.2薄壁管高速12000离心5分钟，提取的dna片段可直接用于各种下游操作，包括基因测序，实时荧光定量pcr检测等。

pcr前，请进行8000转离心5秒，以保证反应体系中的液体混合均匀。完成样本核酸提取后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于—20℃待用(24小时内)。

将dna扩增产物与预扩增试剂分开储存；所有的下游分析处理，如dna纯化、测序前的准备工作，请在另一实验室中进行。如果在标本处理中没有控制好交叉污染，可能出现假阳性。

实验完毕用10％次氯酸或75％酒精处理工作台和移液器，然后用紫外线灯照射30分钟。

使用该单细胞基因序列提取液试剂盒，实验证明：使用单细胞基因序列提取液试剂盒从56例单细胞中提取基因序列，样本编号r160501-r160556，用染色体核酸检测试剂盒来鉴定提取效果，结果56例单细胞染色体基因呈阳，平均为(165000.00±80.00)拷贝/毫升；其它提取液处理单细胞29例，样本编号r160557-r160586，用染色体核酸检测试剂盒来鉴定提取效果，结果29例单细胞染色体基因呈阴；结论该单细胞基因序列提取液试剂盒能有效提取单细胞基因序列。

样本数据显示如下：

以下为染色体核酸检测试剂盒成分表：

所述探针的序列为：acgcggctggtggatcagtgct；

所述第一引物对中的正向引物的序列为ttatgagcgcgaagcaaacg；

所述第一引物对中的反向引物的序列为：ccgtgggtggtctttaccg。

染色体核酸检测试剂盒的检验原理

本试剂盒利用荧光pcr技术，以chromosome基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样本核酸纯化之后，通过pcr对chromosomedna进行快速检测。使用本试剂盒提供的核酸提取试剂对临床样本进行处理和核酸提取，以试剂盒中提供的pcr检测试剂配制成pcr反应管，将提取的核酸加入pcr反应管，使用荧光定量pcr仪进行pcr扩增，并检测荧光信号，仪器软件自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(ct值)实现对未知样本的定性检测。

【pcr扩增适用仪器】abiprism7300abiprism7500,lightcycler480,da7600

【样本要求】

1适用标本类型：血清、血浆、体液或组织。

2标本采集：

2.1血清一用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥试管，室温放置血标本可自发安完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500转离心5min：吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。

2.2血浆用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含乙二胺四乙酸二钾

(edta-2k)或无创基因管，立即轻轻颠倒试管混合10次，充分混匀，后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管。

3标本保存和运送：所采集的标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃，可存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶，无创基因管的标本常温运送。

【检验方法】

1dna提取---样本制备区

将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、chromosome强阳性临界阳性质控品进行同步处理。

1.12次离心的方法分离血浆：4℃,1,600转离心10min分离血浆勿触动白膜层；4℃,16,000转离心10min仔细吸取上清50μ1样品，加入100μ1dna提取液i，用振荡器剧烈振荡混匀10秒，8000转离心数秒。100℃恒温处理10±1min；

1.212，000转离心5min，备用。

2pcr试剂准备---试剂准备区

直接使用chromosome反应混合液管。

3加样---样本制备区

往上述chromosome反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、chromosome阴性质控品、chromosome强阳性质控品、chromosome临界阳性质控品和阳性定量参考品的上清各5μl。盖紧管盖，8，000转离心数秒后转移至扩增检测区。

4pcr扩增---扩增和产物分析区

4.1abiprism7500仪器设置---7300参照此操作

4.1.1打开“setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控(ntc)、阳性质控以及未知样本(unknow)、阳性定量参考品(standard)，并在“samplename”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：reporterdyel：fam，quencherdyel：none；reporterdye2：vic，quencherdye2：none；passivereference：rox。

4.1.2打开instrument窗口，设置循环条件如下：94℃2min，93℃45秒→55℃60秒→10个循环，93℃40秒→55℃55秒→30个循环，保存档，运行。

4.2lightcycler480仪器设置

4.2.1打开软件后，选择“newexperiment”，设置检测模式为“multicolorhydrolysisprobe”，检测通首为fam，vic。

4.2.2设置循环条件：

4.2.3选择“sampleeditor”，设定样品的名称、类型，在“standardconcentration”框中输入阳性定量参考品浓度，设置完成后，保存文件，运行程序。

4.3da7600仪器设置

4.3.1打开软件后，在设置程序参数接口中，设置扩增程序和温度设置，条件如下：

4.3.2点击样本参数接口，按样本对应顺序设置阴性质控(ntc)、阳性质控以及未知样本(unk)，并在“样本名称”一栏中设置样本名称：阳性定量参考品在“样品类型”中选择“标准”，“标准浓度”中输入浓度。探针染料类型选择：fam和hex。

4.3.3设置完成后，保存文件，运行程序。

5结果分析

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节baseline的start值、end值以及threshold值(使用者可根据实际情况自行调整，start值可以在end值可设在在log图谱窗口设置threshold的value值，使基线位于扩增曲线指数期，设置阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击analysis自动获得分析结果，在report接口察看结果，记录未知样本数值(c)。

6质量控制

阴性质控品：全部阴性

阳性质控品：全部阳性，弱阳性质控品检测值允许范围1×10²～5.0×10²copy/ml；

阳性定量参考品：均为阳性，且0.97≤|r|≤1(correlation数值即为r)

以上要求需在同一实验中同时满足，否则，本次实验无效，全部实验应重新进行。

7结果判断

7.1如果在fam检测信道扩增曲线无明显对数增长期或ct值等于30，在vic检测信道扩增曲线有对数增长期，则判样品的chromosomedna浓度小于检测灵敏度。

7.2如果在fam检测信道扩增曲线有对数增长期且ct值＜30，则按以下方法判断：

若样品的c＜100，则该样品的chromosomedna浓度＜100copy/ml；

若样品的100≤c≤1.00×10⁸，则该样品的chromosomedna浓度＝ccopy/ml；

若样品的c＞1.00×10⁸，则该样品的chromosomedna浓度＞5×10⁶copy/ml。如果需要精确定量结果，可将样品阴性质控品稀释到线性范围后再检测。则该样品的chromosomedna浓度＝(c×稀释倍数)copy/ml。

8检验结果的解释

1每次实验均需检测阴性质控品，chromosome强阳性质控品，chromosome临界阳性质控品，质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判定。

2阳性结果判定标准：在fam检测信道扩增曲线有对数增长期且ct值＜30。

3阴性结果判定标准：在fam检测通首扩增曲线无明显对数增长期或ct值等于30，在vic检测信道扩增曲线有对数增长期。

9产品性能

根据临床试验结果显示，本试剂盒的灵敏度为1×10²copy/ml，线性范围为本试剂盒与对照试剂的总符合率为100％；对血清和血浆两种类型样本检测结果无差异。

样本经过单细胞基因序列提取液试剂盒提取后，优选方式为通过染色体核酸检测试剂盒进行扩增鉴定，也可以采取其他方法鉴定。

以上内容仅为优选下的实施例方案，不因此而限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

sequencelisting

<110>胡松

<120>基因引物组合和单细胞基因序列提取液试剂盒

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工序列

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