一种改良酚抽提总RNA的方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种改良酚抽提总rna的方法。

背景技术：

随着分子生物学的不断发展，高质量rna样品是很多实验的关键所在。而一些实验如逆转录pcr(rt-pcr)、基因芯片等，更需要高纯度高质量的rna样品。稳定高效的rna提取方法对于相关实验研究至关重要。

最为经典的抽提rna的方法当属“酚抽提法”，然而，目前学术界对于酚抽提过程中ph值的定义并不明确，甚至有些错误的认识。《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔著，科学出版社2002，第1587页提到所谓酚相的ph值，但实际上酚是一种有机溶剂，并非水溶液，所以酚相的ph值是没有意义的。

一种常用于抽提rna的“酸性酚”，是使用固定ph值的酸性缓冲液(醋酸钠或者柠檬酸钠缓冲液)对水饱和酚进行反复的平衡，直至最终平衡之后的水相缓冲液ph值不再变化。这种“酸性酚”制备十分费时费力，而且在实际使用中，这种“酸性酚”对于去除rna样品中基因组dna的残留效果也并不稳定。

如何利用酚抽提方法，在合适的条件下精准地将dna和rna分离，成为了目前亟待解决的问题。

技术实现要素：

基于以上背景，本发明提供了一种改良酚抽提总rna的方法，通过裂解细菌菌体、第一次酚抽提获得总核酸，再使用ph值为3.85±0.10的酸性醋酸钠溶液与总核酸混合，最后通过第二次酚抽提纯化出不含基因组dna的总rna。

本发明采取的技术方案为：

一种改良酚抽提总rna的方法，包括如下步骤：

a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料；

b)加入与重悬液体积相同的裂解液，室温裂解3-5分钟，或65℃裂解0.5-1分钟；

c)加入与a)b)两步中溶液总体积相等的酚抽提液1，反复振荡混匀；12000r/min离心10-15分钟；吸取上清液；

d)向c)步骤所得上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇，上下反复颠倒，待充分沉淀；12000r/min离心10分钟；弃上清；

e)向d)步骤所得的沉淀中加入洗涤液，洗涤1～2次，再用超纯水溶解沉淀，所得即为总核酸溶液。

f)取e)步骤中的总核酸溶液，加入与总核酸溶液等体积的酸性醋酸钠溶液，以及等体积的氯化钠溶液；

g)加入同f)步骤中溶液等体积的酚抽提液2，反复混匀之后，12000r/min离心5-10分钟；吸取上清液；

h)向g)步所得的上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇，颠倒混匀，待沉淀完全后，12000r/min离心10分钟；弃上清；

i)加入洗涤液洗涤一次后，加入超纯水溶解沉淀，所得即为rna样品。

步骤a)中，所述重悬液为超纯水；所述生物材料为细菌菌体，菌体与重悬液的质量/体积比为20-50mg/100μl，以避免菌体过多造成纯化困难和菌体过少导致产物得率下降。

步骤b)中，所述裂解液为十二烷基硫酸钠溶液，其重量浓度为2±0.2％。选用十二烷基硫酸钠溶液作为裂解液裂解较为简单，且优于其他一些裂解法，比如异硫氰酸胍+酚作为裂解液的裂解。

步骤c)中，所述酚抽提液1为水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1组成的混合液，此种比例是抽提总核酸的最佳比例，可避免在抽提过程中核酸的损失。

步骤e)中，所述洗涤液为75±5％乙醇溶液，选用75±5％乙醇溶液作为洗涤液既能有效洗涤去除盐分等杂质，同时又能避免样品在洗涤的过程中过多损失。

步骤f)中，所述酸性醋酸钠溶液为醋酸钠和醋酸组成的混合溶液，其ph为3.85±0.10；其中，醋酸钠和醋酸的摩尔浓度均为50mmol/l，

步骤f)中，所述氯化钠溶液浓度为150±0.1mol/l，此浓度的氯化钠溶液一方面可以为总核酸溶液提供一定的离子强度，又有利于提高步骤h)中乙醇沉淀rna的效率。

步骤g)中，所述酚抽提液2为水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为125:24:1组成的混合溶液，此种比例最适合提取rna，并能更有效吸附去除基因组dna。

本发明公开的改良酚抽提总rna的方法，采用十二烷基硫酸钠作为裂解试剂裂解生物材料，先利用第一次酚抽提法抽提样品的总核酸，总核酸中包含总rna和基因组dna，并去除生物材料的其他杂质。然后在总核酸中加入酸性醋酸钠溶液，创造酸性的水相环境，使部分核酸可被酚抽提液吸附。酚相所吸附的核酸分子量的大小与水相环境的ph值密切相关。当水相ph值较低时，大量核酸会分配到酚相当中。随着水相ph值的不断提高，分配到水相中的rna不断增多。当水相ph值更高时，基因组dna也会被抽提出来。

利用这一现象，本发明选择了ph值为3.85±0.10的酸性醋酸钠溶液，在第二次酚抽提时将总rna纯化出来，而将基因组dna分配到酚相去除。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.总rna的提取过程简单，无需使用dna酶消化去除总核酸中的基因组dna；

2.提取得到的总rna样品的纯度高，样品中残留基因组dna较少；

3.根据本发明公开的方法提取得到的rna的扩增能力较强。

附图说明

图1为实施例1和实施例2中的方法提取得到的rna的电泳结果。m：dnamarkervii；泳道1-10，从左向右分别为所加醋酸钠ph值：3.13、3.51、3.85、4.21、4.56、4.83、5.36、5.73、6.35、7.20；泳道12，抽提rna所用总核酸。

图2为实施例3中实时定量pcr检测本法提取rna样品以及其他方法所得rna样品中残留基因组dna的含量。

图3为实施例4中实时定量pcr检测本法提取rna样品以及其他方法所得rna样品的扩增能力。

具体实施方式

实施例1

a)挑取平板划线培养大肠杆菌菌株dh5α单菌落，至100mllb液体培养基，37度过夜振荡培养。离心收获菌液。1.5ml菌液离心所得菌体用100μl超纯水进行重悬，所述菌体的质量为20-50mg；

b)加入100μl重量浓度为2±0.2％的十二烷基硫酸钠溶液，充分混匀，室温裂解3分钟。

c)加入200μl酚抽提液1，所述酚抽提液1为水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1组成的混合液，反复振荡混匀；12000r/min离心10-15分钟；吸取上清液200μl；

d)将c)步骤所得上清液中加入400μl无水乙醇，轻柔地颠倒混匀，待沉淀完全后，12000r/min离心10分钟；弃上清；

e)将d)步骤所得rna沉淀用75±5％乙醇溶液洗涤两次，加入100μl的超纯水溶解。所得即为总核酸溶液；

f)取e)步骤中的总核酸溶液50μl，加入50μl酸性醋酸钠溶液和50μl150±0.1mol/l氯化钠溶液；所述酸性醋酸钠溶液为醋酸钠和醋酸组成的混合溶液，其ph为3.85±0.10；

g)加入150μl酚抽提液2，所述酚抽提液2为水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为125:24:1组成的混合溶液，反复混匀之后，12000r/min离心10分钟；吸取上清液140μl；

h)向g)步所得的上清液中加入280μl无水乙醇，轻柔地颠倒混匀，待沉淀完全后，12000r/min离心10分钟；弃上清；

i)加入75±5％乙醇溶液洗涤一次后，加入50μl超纯水重悬沉淀，所得沉淀即为rna样品。

如图1所示：第3泳道为通过该方法纯化得到的rna，具有3条完整的核糖体rna条带(23s、16s、5s)，不含有基因组dna。

实施例2：

本法与使用不同ph醋酸钠溶液酚抽提rna结果的比较：

重复实施例1中a)至e)步骤；分别取e)步骤中的总核酸溶液50μl，相应加入50μlph3.13-7.20的50mmol/l醋酸钠溶液，50μl氯化钠溶液；重复g)至i)步骤，即得到rna样品，其电泳检查结果如图1所示。

从图1中可以看出，当缓冲液ph值小于等于3.51时，纯化出来的样品仅包含部分rna；当缓冲液ph大于等于4.21值时，纯化出核酸样品包含有基因组dna；当缓冲液ph等于3.85时，即实施例1中公开的方法，纯化的样品包含完整的总rna，且不含基因组dna。

实施例3：

基因组dna残留检测：

取实施例1中i)步中所得总rna样品1微克，以及trizol法和酚抽提法所得rna样品，采用rna酶处理后，采用基因组特异性引物扩增。根据与标准样品的域循环数的对比，标准样品为已知拷贝数的大肠杆菌基因组dna，可见本法所得样品残留基因组dna最少，约每微克10⁴拷贝。采用trizol法和酚抽提法所得样品残留基因组dna分别约为每微克10⁵拷贝和10⁷拷贝，如图2所示。

实施例4：

rna扩增能力检测：

取实施例1中i)步中所得总rna样品，以及对相同质量菌体样品采用trizol法和酚抽提法提取的rna样品，分别经dnasei处理后，分别作为模板，使用amv逆转录酶进行逆转录。逆转录所得cdna作为模板进行实时定量pcr反应。所用引物为大肠杆菌pgi基因的特异性引物，其引物序列为pgil：gccgttactctttgtggtc-3；pgir：gcgggttatgggtgatag。根据与标准样品的域循环数的对比，标准样品为已知拷贝数的目的基因cdna片段。可见本法和酚抽提法所提取的rna扩增能力较强，而trizol法所提取的rna扩增能力较弱，说明trizol法不适合提取细菌样品的rna，结果如图3所示。

上述参照实施例对一种改良酚抽提总rna的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。