一种辣根过氧化物酶的固定化方法及其应用与流程

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种过氧化物酶的固定化方法及其应用。

背景技术：

酶作为一种生物催化剂，具有催化高效性、高选择性、反应条件温和等特点，能够应用于多种行业。但是天然酶容易失活、稳定性差、回收率低等特点，限制了它的多种应用。

固定化酶技术是用物理或化学手段．将游离酶限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收使用的一种技术。与游离酶相比，固定化酶有以下优点：(1)容易与底物分离，可重复使用；(2)酶解反应中酶用量减少，降低了成本；(3)可进行连续性生产，提高了生产效率，适于工业化应用。固定化酶的制备原则：1)维持酶的催化活性及专一性；2）固定化酶应该具有一定的稳定性；3）酶与载体有一定的结合程度；4）采用适当的载体。固定化酶的载体，常见的种类：1）壳聚糖及其改性；2）纤维素及其衍生物；3）有机合成聚合物；4）凝胶材料；5）磁性微粒。

随着环境污染日益严重，人们需要开发出一种高效、快速、能连续高效处理污染物且无二次污染的技术。伴随着固定化酶技术的发展，其在治理环境方面显示出巨大的优越性。污水处理中常用到的酶有辣根过氧化物酶以及漆酶等。固定辣根过氧化物酶对污水处理中的含酚类化合物有良好的催化效果。此外，辣根过氧化物酶具有制备简单、价格便宜、比活性高且能适应较宽范围的污染物浓度等特点。

酶的固定化可以用多种多样的载体，介孔材料因为具有均一可调的孔径、比表面积大、孔道规则、骨架稳定、易于表面功能化等优点，目前被广泛用于酶蛋白质的固定化，充当生物催化剂载体。介孔二氧化硅纳米颗粒具有一定的空腔及分布均一的纳米尺度的孔径，利于酶分子的装载及固定化；此外还具有化学惰性，不影响酶的催化反映。

基于以上背景，本发明设计了用氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒固定辣根过氧化物酶，用于污水中苯酚类化合物的催化降解，目前尚未有此类报道。

技术实现要素：

本发明针对游离酶在催化反应中的易失活、稳定性差、回收率低等不足，提供了用氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒作为固定化载体，达到装载量大、保护酶的催化活性、易回收等特点，用于污水中酚类化合物的去除。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种辣根过氧化物酶的制备方法，固定化载体为氨基化修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒，固定化方法为物理吸附法，即辣根过氧化物酶通过物理吸附的方法进入氨基化修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒孔道内部。

其中，所述介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为250-350nm，介孔孔径为8-9.5nm。

所述氨基化修饰后的介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为250-350nm，并与氨基化之前相比，粒径并未发生太大改变；介孔孔径为7-8nm，与氨基化之前相比，孔径有所减小。

氨基化之前，介孔二氧化硅纳米颗粒对辣根过氧化物酶的吸附量为24-26mg/g，氨基化之后的介孔二氧化硅纳米颗粒对辣根过氧化物酶的吸附量为35-37mg/g。

所述固定化辣根过氧化物酶的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）将3.36ml氨水与75ml乙醇混合均匀，反应5min后将0.21ml甲醛、0.15g间苯二酚加入，反应7h后，逐滴加入0.65ml原硅酸四乙酯，反应结束后，将得到的材料用乙醇离心、清洗三遍，真空烘干整晚，将材料进行550℃煅烧6h，得到介孔二氧化硅纳米颗粒；

（2）得到的介孔二氧化硅纳米颗粒为白色粉末。将得到的白色粉末，溶解在超纯水中，并加热至沸腾，反应2h，离心，并置于真空干燥箱中干燥；取已经活化好的介孔二氧化硅纳米颗粒0.2g，加入2ml3-氨丙基三乙氧基硅烷，并置于20ml甲苯中，80℃冷凝回流12h；反应结束后，将反应液离心，并用无水乙醇离心、清洗三次，得到了氨基化之后的介孔二氧化硅纳米颗粒；

（3）在ph为7.4，10mmpbs缓冲液中加入2mg氨基化介孔二氧化硅纳米颗粒与10ml辣根过氧化物酶，室温搅拌24h，得到固定化的辣根过氧化物酶。

本发明的有益效果在于：本发明以氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒作为载体，包覆了一定量的辣根过氧化物酶，且对辣根过氧化物酶进行固定化，与游离酶相比，提高了辣根过氧化物酶的稳定性、回收性，不影响其催化活性，提高了其在污水处理中的应用。

附图说明

图1为氨基化前后介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径图。

图2为氨基化前后介孔二氧化硅纳米颗粒对辣根过氧化物酶的吸附量。

图3为ph对游离酶和固定化酶的影响。

图4为双氧水与2,4-二氯苯酚的比例对固定化酶的影响。

图5为固定化酶的可回收率测试。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

首先合成介孔二氧化硅纳米颗粒，按照如下方法：将3.36ml氨水与75ml乙醇混合均匀，反应5min后将0.21ml甲醛、0.15g间苯二酚加入，反应7h后，逐滴加入0.65ml原硅酸四乙酯，反应结束后，将得到的材料用乙醇离心、清洗三遍，真空烘干整晚，将材料进行550℃煅烧6h，得到介孔二氧化硅纳米颗粒。得到的介孔二氧化硅纳米颗粒为白色粉末。将得到的白色粉末0.2g，溶解在超纯水中，并加热至沸腾，反应2h，离心，并置于真空干燥箱中干燥。取已经活化好的介孔二氧化硅纳米颗粒，加入2ml3-氨丙基三乙氧基硅烷aptes，并置于20ml甲苯中，80℃冷凝回流12h。反应结束后，将反应液离心，并用无水乙醇离心、清洗三次，即得到了氨基化之后的介孔二氧化硅纳米颗粒。测试氨基化前后的介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径，如图1所示，氨基化前后，介孔二氧化硅纳米颗粒粒径并未发生太大改变。

辣根过氧化物酶溶解在pbs（ph7.4）中，并且设置一定的梯度，使辣根过氧化物酶在pbs中的浓度为0.1mg/ml至0.5mg/ml，分别将2mg的介孔二氧化硅纳米颗粒和氨基化介孔二氧化硅纳米颗粒，置于辣根过氧化物酶浓度（0.1mg/ml—0.5mg/ml）不同的pbs缓冲液中。室温孵育24h后，将反应液离心，且通过考马斯亮蓝法测定载体吸附的辣根过氧化物酶含量，并绘制出相应的折线图，如图2。

应用例1

将2,4-二氯苯酚的浓度设定在0-200mg/ml的范围内，并分别将30mg游离酶和固定在氨基化介孔二氧化硅纳米颗粒的30mg辣根过氧化物酶加入到2,4-二氯苯酚溶液中。将0-300mg/ml过氧化氢吸入到混合物中时，反应开始。游离酶和固定化辣根过氧化物酶在ph3.0〜9.0的最适ph如图3所示。在固定化过程中，ph是酶活性的重要影响因素之一。在测试的ph范围内，固定化酶比游离酶更稳定。游离酶的最佳ph为6.0，而固定化酶为7.0。

应用例2

将2,4-二氯苯酚的浓度设定在0-200mg/ml的范围内，将固定在氨基化介孔二氧化硅纳米颗粒的酶加入到2,4-二氯苯酚溶液中，并且改变溶液中双氧水与2,4-二氯苯酚的比例。当双氧水与2，4-二氯苯酚的比例为1时，固定化辣根过氧化物酶对2,4-二氯苯酚具有较高的清除率，如图4所示。

应用例3

与游离酶不同，固定化的辣根过氧化物酶可以与反应溶液分离并重新使用。固定化酶的剩余催化活性用可回收率表示。如图5所示，随着循环次数的增加，固定化hrp的活性降低。七个循环后，酶活性降至其初始活性的20％。五次循环重复试验后，一半以上的酶活性丧失，苯酚去除效率降低到较低水平。