一种莲房固载微生物及其制备方法和应用与流程

本发明属于材料和环境技术领域，具体涉及一种莲房固载微生物及其制备方法和应用。

背景技术：

莲房是莲的成熟花托，主要有多酚、生物碱、蛋白质、糖类、脂肪、纤维素，原花青素和维生素等化学物质组成，具有抗氧化能力和止血化瘀和泄湿的功效。目前，已经有利用其提取原花青素(李佳桥等，2016)和制作酥性饼干(连成杰等，2006)的研究报道，但实际上随着近年来莲子产业规模的扩大，主要副产物莲房被随意丢弃焚烧造成资源浪费和环境污染，亟待对其进行资源化利用以避免环境污染。

另外，由于人类活动的加剧产生了大量的含铬镉等重金属的废水、废渣和废气，导致了大量的水体和土壤环境的镉铬等重金属污染(vitietal.,2013)。铬常见的氧化数有+3和+6，其中，cr(vi)可溶性强，易迁移，毒性大，能致癌、致畸、致突变(bagchietal.,2002)，cr(iii)可溶性小，不能穿过生物膜，易与其它离子形成沉淀，毒性小(franciscoetal.,2002)，cr(vi)的毒性比cr(iii)高约100倍(ehrlich，2002)。废水中cr(vi)是主要的存在形式，因而，将cr(vi)转化成cr(iii)是常见的有效去除铬和减少铬污染的方法。可溶性镉容易被植物吸收，然后通过食物链进入人体,少量的镉持续进入人体会对组织器官造成损伤,在肾脏、肝脏、肺脏、骨骼、生殖系统、心血管系统、胃肠系统、胰脏表现出明显病变(柳絮,2007)。因而，减少可溶性镉的含量能有效减少镉的危害。铬镉的去除的方法很多，其中，生物法因其投资少运行费用低次级污染少而备受关注。本申请提供一种低成本的生物质材料莲房作为载体固定微生物来去除重金属的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，目的是在于提供一种以生物质材料莲房作为载体固定微生物从而去除重金属的方法，由本方法所制备的莲房固载微生物材料具有十分优异的特性，其对含cr(vi)和/或cd(ii)溶液中重金属离子具有十分优异的去除能力，应用前景十分广阔。

为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为：

一种莲房固载微生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)莲房的准备：收集莲房置于55℃烘箱，烘干至恒重，再用粉碎机粉碎，过60目筛，得粉末备用；

(2)莲房固载微生物：a.按体积分数为1％的标准接种处于对数生长期的wh16-1菌液于100ml的lb培养基中，然后加入0.5～2g莲房并置于37℃、160r/min的摇床中培养12h，最后离心、洗净颗粒物，真空冷冻干燥即得所述莲房固载微生物颗粒。

或者本发明的技术方案还可以如下：

一种莲房固载微生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)莲房的准备：收集莲房置于55℃烘箱，烘干至恒重，再用粉碎机粉碎，过60目筛，得粉末备用；

(2)莲房固载微生物：a.按体积分数为1％的标准接种处于对数生长期的wh16-1菌液于100ml的lb培养基中，并置于37℃、160r/min的摇床中培养12h后，离心，弃去上清液，再加25ml新鲜培养液；b.将0.5～2g莲房和1～3g海藻酸钠加入上述菌液中并搅拌使其充分混合；c.将步骤b所得混合液注入质量浓度为2～4％的氯化钙100g溶液中，静置固化6～24h后倾倒出液体，并用生理盐水洗净颗粒物，真空冷冻干燥即得所述莲房固载微生物颗粒。

另外，本发明还要求保护由上述方法制备得到的莲房固载微生物。

以及保护所述莲房固载微生物的应用，其应用具体为：取一定量的莲房固载微生物颗粒置于含一定量的cr(vi)和/或cd(ii)的培养基中，振摇，一定时间后取样，离心过滤，测其上清液中剩余的cr(vi)和cd(ii)含量，根据处理前后cr(vi)和/或cd(ii)的浓度差计算莲房固载微生物对cr(vi)和cd(ii)的去除量。

与现有技术相比，本发明提供的莲房固载微生物，具有以下的明显有益效果：

(1)本发明创造性的采用莲子产业副产物莲房作为固载材料，一方面莲房廉价易得，另一方面也实现了废弃物的再利用，极大的节约了资源，避免了因其被废弃而产生的污染；

(2)本发明采用的莲房一方面含有大量的纤维素，特别适合微生物的固载，另一方面，莲房含有大量的营养物质如蛋白质、糖类、脂肪等，为微生物的生长提供了十分有利的环境条件，并且莲房中还含有大量具有还原性的物质(抗氧化性的物质)如含约7.8％原花青素，能够将cr(vi)进行还原，从而与微生物一起起到去除重金属的作用；

(3)本发明海藻酸钠溶液加入多价金属离子就会交联成网状凝胶；将微生物，莲房与海藻酸钠溶液混匀，用针头喷入钙盐溶液中,即可制成珠状凝胶，将微生物和莲房包裹固定成珠状，有利于回收再利用。

(4)本发明所制备的莲房固载微生物对cr(vi)和cd(ii)重金属具有十分优异的去除效果，且远高于游离微生物，其中在4天内对500mg/lcr(vi)和50mg/lcd(ii)的去除率分别为95.32％和80.33％，且无二次污染；并且本发明工艺简单，具有很好的实用价值和应用前景。

附图说明

图1-1为实施例1中莲房固载微生物和微生物菌wh16-1对300mg/l含cr(vi)溶液的去除结果；

图1-2为实施例1中莲房固载微生物和微生物菌wh16-1对500mg/l含cr(vi)溶液的去除结果；

图2为实施例2中莲房固载微生物、莲房以及微生物菌wh16-1对500mg/l含cr(vi)溶液的去除结果；

图3为实施例3中莲房海藻酸钠固载微生物的贮存稳定性结果；

图4-1为实施例4中莲房海藻酸钠固载微生物和微生物菌wh16-1对9mg/l含cd(ii)溶液的去除结果；

图4-2为实施例4中莲房海藻酸钠固载微生物和微生物菌wh16-1对50mg/l含cd(ii)溶液的去除结果；

图5为实施例5中莲房海藻酸钠固载微生物及微生物菌wh16-1对cd(ii)的去除重复性实验结果；

图6-1为实施例6中莲房海藻酸钠固载微生物和微生物菌wh16-1对9mg/lcd(ii)和300mg/lcr(ⅵ)混合溶液中cd(ii)的去除结果；

图6-2为实施例6中莲房海藻酸钠固载微生物和微生物菌wh16-1对9mg/lcd(ii)和300mg/lcr(ⅵ)混合溶液中cr(ⅵ)的去除结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种莲房固载微生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)莲房的准备：收集莲房置于55℃烘箱，烘干至恒重，再用粉碎机粉碎，过60目筛，得粉末备用；

(2)莲房固载微生物：a.将体积分数为1％生长对数期的wh16-1菌液接种于100ml的lb培养基中，并置于37℃、160r/min的摇床中培养12h后，离心，弃去上清液，再加25ml新鲜培养液；b.将步骤a所得液体中加入0.5g步骤(1)的莲房粉末以及25g质量分数为4％的海藻酸钠溶液，搅拌使其充分混合均匀；c.将步骤b所得混合液注入质量浓度为2％的氯化钙溶液100g中，静置固化24h后倾倒出液体，并用生理盐水洗净颗粒物，真空冷冻干燥即得所述莲房固载微生物颗粒。

取上述莲房固载微生物1.6g于含不同浓度的cr(vi)(重铬酸钾)的100ml培养基，间隔一定时间后取样，离心过滤样品，用二苯碳酰二肼(dpc)分光光度法测上清液中剩余的cr(vi)含量。以含相同菌数的100ml的wh16-1的菌液为对照，每组实验三个平行。根据处理前后cr(vi)的浓度差计算莲房固载微生物对cr(vi)的去除量。实验结果表明，游离微生物在4天内对300和500mg/lcr(vi)去除率分别为80.13％和59.12％，莲房海藻酸钠固载微生物在4天内对300和500mg/lcr(vi)去除率分别为100％和80.48％。实验结果如图1所示。

实施例2

一种莲房固载微生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)莲房的准备：收集莲房置于55℃烘箱，烘干至恒重，再用粉碎机粉碎，过60目筛，得粉末备用；

(2)莲房固载微生物：a.将质量分数为1％生长对数期的wh16-1菌液接种于100ml的lb培养基中，加入0.5g的莲房并置于37℃、160r/min的摇床中培养12h；之后离心、真空干燥即得所述莲房固载微生物颗粒。

取上述莲房固载微生物于含500mg/l的cr(vi)(重铬酸钾)的100ml培养基，间隔一定时间后取样，离心过滤样品，用二苯碳酰二肼(dpc)分光光度法测上清液中剩余的cr(vi)含量。以含相同菌数的100ml的wh16-1的菌液和单独的莲房为对照组，每组实验三个平行。根据处理前后cr(vi)的浓度差计算莲房固载微生物对cr(vi)的去除量。实验结果表明，莲房、微生物及莲房固载微生物在4天内对500mg/lcr(vi)的去除率为48.06％、59.12％和95.32％。实验结果如图2所示。

实施例3

莲房海藻酸钠固载微生物的贮存稳定性测定实验：

莲房海藻酸钠固载微生物制备与实施例1相同。

将菌数相同量10¹⁰cfu/ml的游离菌粉和莲房海藻酸钠固载微生物颗粒在常温干燥环境中贮存3个月后，分别取莲房海藻酸钠固载微生物1.6g和含相同菌数的游离菌粉于100ml的lb培养基中，置于37℃、160r/min的摇床中培养12h后，用稀释涂板法测溶液中的菌数，游离菌粉和莲房海藻酸钠固载微生物颗粒计数结果分别为：0和4×10⁵cfu/ml。

取常温干燥保存了一定时间的莲房海藻酸钠固载微生物1.6g(干重)于100ml的培养基中，加重铬酸钾使其含500mg/lcr(vi)，三天后取样，样品经离心过滤后，用二苯碳酰二肼(dpc)分光光度法测上清液中剩余的cr(vi)含量，每组实验设计三个平行。结果表明，莲房海藻酸钠固载微生物具有很好的贮存稳定性，贮存1、2、3、4个月后对500mg/lcr(vi)分别是82.47％、80.59％、76.80％、73.6％。实验结果如图3所示。

实施例4

莲房海藻酸钠固载微生物及其对cd的去除实验：

莲房海藻酸钠固载微生物制备与实施例1相同。

取制备的莲房海藻酸钠固载微生物颗粒1.6g(干重)于含一定量浓度的氯化镉的100ml的培养基中，一定温度下振摇，并隔一段时间取样，样品经离心过滤后取上清液用原子吸收光谱仪测定镉的含量。以含相同菌数的100ml的wh16-1的菌液为对照，每组实验三个平行，根据处理前后cd(ii)的浓度差计算莲房固载微生物对cd(ii)的去除量。结果表明，游离微生物在3天内对9mg/l和50mg/lcd(ii)去除率分别为68.43％和0.5％；莲房固载微生物在4天内对9mg/l和50mg/lcd(ii)去除率分别为92.96％和80.33％。实验结果如图4所示。

实施例5

莲房海藻酸钠固载微生物的重复性测定实验：

莲房海藻酸钠固载微生物制备与实施例1相同。

取莲房海藻酸钠固载微生物1.6g(干重)于含9mg/lcd(ii)的100ml的lb培养基中，三天后取样，离心过滤样品，并用原子吸收分光光度法测其上清液中剩余的镉含量和镉的去除量，然后根据剩余镉的浓度补加加入一定量的氯化镉和新鲜培养20mllb培养液，使其cd(ii)的终浓度到9mg/l，并以含相同菌数的wh16-1的冻干菌粉为对照，每组实验设计三个平行。实验结果表明，冻干菌粉及莲房固载微生物在重复使用6个周期(18天)内对cd(ii)去除量分别为4.03％和70.36％。实验结果如图5所示。

实施例6

莲房海藻酸钠固载微生物对cd(ii)、cr(ⅵ)混合液的去除

莲房海藻酸钠固载微生物制备与实施例1相同。

取冻干的固定化小球多少0.8g于50ml的lb培养液中，加入一定的氯化镉和重铬酸钾溶液使其终浓度分别为9mg/lcd(ii)和300mg/lcr(ⅵ)，放置于37℃，160r/min摇床中。每隔一定时间后取一次样，每组三个平行，测溶液中剩余cd、cr(vi)的含量。并用同菌数的游离菌做对照，每组实验设计三个平行。结果表明，游离微生物在80h内对9mg/lcd(ii)和300mg/lcr(ⅵ)去除率分别为51.68％和65.09％；莲房固载微生物在80h内对9mg/lcd(ii)和300mg/lcr(ⅵ)混合溶液中cd(ii)和cr(ⅵ)的去除率分别为83.19％和97.46％。实验结果如图6所示。

最后需要说明的是：以上实施例不以任何形式限制本发明。对本领域技术人员来说，在本发明基础上，可以对其作一些修改和改进。因此，凡在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围之内。