本发明涉及一种链霉素菌种育种领域，特别是一种链霉素菌种的化学诱变育种方法，具体地是，一种链霉素菌种亚硝基胍诱变育种和耐自身链霉素梯度培养的化学诱变育种领域。
背景技术：
：链霉素菌种：灰色链霉菌。链霉素在人用方面主要用于结核病的治疗，在农用方面对细菌性病效果较好，但近年工业化生产的发酵水平徘徊不前。微生物的育种技术主要有诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程等。其中，诱变育种能够提高突变率，在较短的时间内活动更多的优良变异类型，产生自然界原来没有的或一般常规方法无法获得的新类型、新性状、新基因，能够打破基因连锁，提高重组率，在dna水平上，诱变育种往往会导致比同源或异源转基因更大的转变。因此，诱变育种是目前应用最多也是最经济实用的育种方法，是对育种手段不足的一种有益补充。诱变育种可以采用物理方法如紫外诱变，也可以采用化学诱变。物理诱变主要是利用各种射线在一定剂量水平上对生物活体材料进行照射，造成生物细胞内染色体的畸变，其特点是对染色体伤害较大，这是早期诱变的主流形式。化学诱变是通过一定浓度范围的化学诱变剂对活体进行处理造成生物细胞内dna的损伤和错误修复等，产生突变体，具备易操作，剂量易控制，对基因组损伤小，突变率高。由于物理和化学的诱变方法所产生的突变是随机的尽管基因突变频率较高，但突变无方向性，并不能确保增加正向突变的频率。技术实现要素：本发明旨在克服上述缺陷，解决了链霉素菌种常规育种工作中存在的育种途径少，育种效率低等问题，本发明提供的化学诱变育种方法，具有处理成本低廉，方法简便容易操作及突变效率高有一定方向性等明显优势。本发明提供的一种链霉菌的化学诱变育种方法，其特征在于：采用诱变剂对链霉菌进行诱变，经含有链霉素的梯度平皿的培养后，通过摇瓶筛选获得遗传稳定的高产菌株。从而达到化学诱变育种的目的。本发明的技术方案能一次性地用复合方法处理链霉菌，能够有效地提高孢子的死亡率和诱变效果，有利于菌株提高生产水平，稳定生产。进一步地，本发明的链霉菌的化学诱变育种方法，还具有如下特点：即、上述诱变剂为亚硝基胍。进一步地，本发明的链霉菌的化学诱变育种方法，还具有如下特点：即、具体工艺步骤如下所示：步骤1、诱变育种步骤1-1、选取斜面孢子制成孢子悬浮液；每毫升缓冲液中含孢子数量10的8次方到9次方左右。在1-1的步骤中，取材一般选择外观均匀，白色，丰满的斜面；步骤1-2、将诱变剂与孢子悬浮液混合后，诱变30-240分钟；步骤1-3、将步骤1-2诱变后的孢子悬浮液涂布于含有链霉素的梯度平皿培养基中培养至菌落长好；在上述材料的诱变处理步骤中，优选在无菌条件下，将斜面孢子制备成孢子悬浮液，采用一定浓度的亚硝基胍处理一定时间，稀释后涂布在含有链霉素的梯度平皿中，保持一定的温度进行培养。具体的浓度、处理和培养的时间可根据菌株或不同处理剂的特性进行调整。步骤1-4、选取长好的单菌落，接种至斜面培养基上培养至长好；步骤2、筛选步骤2-1、取步骤1-4中长好的孢子接种到种子培养基中，摇床培养20-120小时；步骤2-2、取步骤2-1中长好的种子接种到发酵培养基中，摇床培养120-210小时；步骤2-3、筛选得到高产的菌株。在上述步骤中，关于突变株的筛选方法为：通过与空白对照(未被诱变处理)或同组之间进行对比，选择效价高的菌株。进一步地，本发明提供的一种链霉菌的化学诱变育种方法，还具有这样的特征：即、上述诱变剂与孢子悬浮液的比例关系为：每毫升的孢子悬浮液中添加入0.1-2毫克的亚硝基胍。进一步地，本发明提供的一种链霉菌的化学诱变育种方法，还具有这样的特征：即、上述含有链霉素的梯度平皿培养基为梯度浓度为5-25mg/ml的耐链霉素浓度平皿培养基。进一步地，本发明提供的一种链霉菌的化学诱变育种方法，还具有这样的特征：即、上述含有链霉素的梯度平皿培养基的制作方法为：步骤一、在无菌条件下，将斜面培养皿一侧抬高，与桌面形成1-25°的夹角，倒入斜面培养基，待凝固后放回水平位置；步骤二、倒入含链霉素的斜面培养基，放置冷凝后即成含有链霉素的梯度培养皿；其中，步骤一和二中，上述斜面培养基和含链霉素的斜面培养基的体积比为1:1-2；步骤二中，上述含链霉素的斜面培养基中，链霉素与斜面培养基比例关系为：每毫升斜面培养基中溶解5-100毫克链霉素。在本发明的梯度平皿法中，利用培养皿的一侧至另一侧铺有药物浓度呈梯度分布的琼脂培养基，以筛选相应抗药性突变株的方法。培养基内的药物浓度呈线性梯度，一端浓度高，另一端浓度低。若在梯度平皿上涂布经过诱变的菌悬液，经培养后，某些突变的菌株就可以在适当药物浓度的培养基表面生长，然后选择在较高浓度下生长的菌株，分离培养即可得到抗药性突变株。进一步地，本发明提供的一种链霉菌的化学诱变育种方法，还具有这样的特征：即、上述斜面培养基可选择任何常规培养基，优选采用由如下质量百分比的组分混合制造而成：葡萄糖0.1-2.0％、蛋白胨0.1-1.45％、氯化钠0.1-1.5％、豌豆浸出液10-25％、洋菜1-4.6％、水余量；上述种子瓶培养基可选择任何常规培养基，优选采用由如下质量百分比的组分混合制造而成：黄豆饼粉1-5.5％、葡萄糖1-5.8％、碳酸钙0.1-1.6％、硫酸铵0.2-1.25％、氯化钠0.1-1.0％、磷酸二氢钾0.1-1.0％、水余量；上述发酵瓶培养基可选择任何常规培养基，优选采用由如下质量百分比的组分混合制造而成：黄豆饼粉2.0-5.75％、葡萄糖5-15％、碳酸钙0.1-1.2％、硫酸铵0.1-1.2％、氯化钠0.1-0.8％、磷酸二氢钾0.01-0.15％、水余量。进一步地，本发明提供的一种链霉菌的化学诱变育种方法，还具有这样的特征：即、在步骤1-2中，诱变的条件为：20-35℃，震荡频率200-300r/min；在步骤1-3中，培养的条件为：20-35℃，5-20天；在步骤1-4中，培养的条件为：20-35℃，5-20天；在步骤2-1中，摇床培养的条件为：20-35℃，摇床转速100-300rpm；在步骤2-2中，摇床培养的条件为：20-35℃，摇床转速100-400rpm。进一步地，本发明提供的一种链霉菌的化学诱变育种方法，还具有这样的特征：即、还包括复筛工序；上述复筛工序为至少一次，其具体工艺为：将步骤2-3获得的菌株，制备成冷冻管，将冷冻管孢子接种到斜面培养基上培养至菌落长好后；重复步骤2-1到步骤2-3至少一次。一般来说，选择镜检菌丝体生长有力粗壮，发酵瓶单位较出发菌株提高且该菌株经多次复筛后，能获得遗传稳定的优良菌株。进一步地，本发明提供的一种链霉菌的化学诱变育种方法，还具有这样的特征：即、将实验过程中梯度平皿的培养方法替换为平皿培养方法。本发明的作用和效果：本发明涉及的一种链霉素菌种的化学诱变育种方法中，采用了化学诱变和梯度培养的相结合的方式，利用化学诱变对基因组损伤小，突变效率高，处理成本低，简单易行容易操作的特性，以及梯度平皿法的诱变效率高、操作简便、所用仪器设备少、成本低的特性来实现了，高效的获得遗传稳定性的高产菌株用于生产的目的。具体地，在本发明中采用亚硝基胍等化学诱变剂对链霉菌进行处理，利用菌株对自身链霉素的耐药性和梯度平皿上的培养，获得有方向的突变菌株，加快筛选工作的进程，通过摇瓶筛选获得遗传稳定性的高产菌株用于生产。特别地，在优选方案中，本发明采用超强诱变剂亚硝基胍处理链霉素菌种，从诱变剂浓度、诱变时间进行了研究，为获得高产稳定菌株提供一条有效途径。此外，在本发明的研究中发现通过亚硝基胍对链霉素菌种诱变处理，能提高突变效率，减少对基因组的损伤。同时采用耐链霉素自身抗性培养，能有效增加正向正突变几率，保证了诱变后新菌株的自身耐受性和稳定性，高产效果明显。当两者配合应用于本发明的研究中，能有效提高菌株的遗传稳定性，和获得高产菌株的比例，相较于单独采用亚硝基胍处理和单独采用梯度培养方式，能提高其生产效率220-280％左右，此外其品质优良率也提高了150-270％左右。此外，在本发明的方案中，针对链霉素菌种不同出发菌株按照本文提供的方法进行化学诱变处理，都可以实现遗传变异。在实际操作中，可根据不同的出发菌株调整处理剂量以达到取得稳定的高产菌株的满意效果。例如：对链霉素菌种不同出发菌株制备的孢子悬浮液，通过调整不同浓度的化学诱变剂来获得对应的诱变结果，并通过平皿梯度培养基耐自身培养，最终能够筛选出稳定、高产的菌株。此外，在实际菌种选育工作中，兼顾死亡率和正负突变率的变化，采用本发明的方法，还可同时根据自己的育种目标，确定适宜的诱变剂浓度和处理时间，平皿培养好后，即可进行单菌落挑选。具体实施方式一、材料准备：a.出发菌株：外观白色均匀，丰满，无杂菌的生产用斜面。b.斜面/平皿培养基：饮用水、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.45％、氯化钠0.5％、豌豆浸出液15％、洋菜2.6％。(根据实际使用的需要，上述培养基还可调整为：葡萄糖0.1-2.0％、蛋白胨0.1-1.45％、氯化钠0.1-1.5％、豌豆浸出液10-25％、洋菜1-4.6％、水余量)c.种子瓶培养基：饮用水、黄豆饼粉3.5％、葡萄糖3.8％、碳酸钙0.6％、硫酸铵0.65％、氯化钠0.35％、磷酸二氢钾0.5％。(根据实际使用的需要，上述培养基还可调整为：黄豆饼粉1-5.5％、葡萄糖1-5.8％、碳酸钙0.1-1.6％、硫酸铵0.2-1.25％、氯化钠0.1-1.0％、磷酸二氢钾0.1-1.0％、水余量)d.发酵瓶培养基：饮用水、黄豆饼粉4.75％、葡萄糖8％、碳酸钙0.625％、硫酸铵0.625％、氯化钠0.3125％、磷酸二氢钾0.08％。(根据实际使用的需要，上述培养基还可调整为：黄豆饼粉2.0-5.75％、葡萄糖5-15％、碳酸钙0.1-1.2％、硫酸铵0.1-1.2％、氯化钠0.1-0.8％、磷酸二氢钾0.01-0.15％、水余量)e.缓冲液：ph6的磷酸缓冲液。f.孢子悬浮液：在无菌条件下，取上述缓冲液10ml加入已长好的斜面，用接种棒轻轻将培养基表面的孢子刮下，混匀备用。g.亚硝基胍处理液：分别称取10—20mg亚硝基胍，溶于孢子悬浮液中，分别为1000ug/ml、1500ug/ml、2000ug/ml共3个浓度的亚硝基胍处理液。h.梯度平皿培养基：称取适量链霉素溶于已灭菌的斜面培养基中摇匀。在无菌条件下将培养皿一侧抬高5mm，倒入约15ml无链霉素的斜面培养基，待凝固后放回水平位置，再倒入等体积上述含链霉素的斜面培养基，放置冷凝后即成梯度培养皿。实施例1：诱变育种步骤一：将称好的10—20mg的亚硝基胍分别与10ml孢子悬浮液混匀，分别制成1000、1500、2000ug/ml共三个浓度水平，27℃震荡250r/min，诱变60、90、120min。用无菌水终止诱变。(根据不同的孢子还可对浓度进行调整为100-10000ug/ml不等，其诱变的时间也可调整为30-240分钟不等。)步骤二：将经亚硝基胍诱变的孢子悬浮液稀释后，涂布于平皿培养基，27℃培养10天，至菌落长好，统计菌落数，计算诱变结果。亚硝基胍对链霉素菌株致死率的影响见表一。表一、亚硝基胍对链霉素菌株致死率的影响步骤三：将经亚硝基胍诱变的孢子悬浮液稀释后，涂布于含有链霉素的梯度平皿培养基，27℃培养10天，至菌落长好。梯度方法能用于提高该试验的效率。单菌落挑选：挑选步骤二与步骤三中长好的单菌落，接种至斜面培养基，27℃培养7天。其中每个实验条件选取20个单菌落。实施例2：初筛步骤一、菌种种子瓶培养：在750ml三角瓶中装入80ml种子培养基，灭菌冷却后，取上述诱变后长好的孢子接种到种子培养基中，在27℃，250rpm摇床上培养50—72小时，然后接种到发酵瓶。(根据不同的菌种和处理条件，摇床培养的条件可在：20-35℃，摇床转速100-300rpm中进行选择)步骤二、菌种发酵瓶培养：在750ml三角瓶中装入50ml发酵瓶培养基，灭菌冷却后，按5％的接种量将长好的种子接种到50ml发酵瓶培养基中，在27℃，250rpm摇床上培养168小时，取样测定效价。(根据不同的菌种和处理条件，摇床培养的条件可在：20-35℃，摇床转速100-400rpm中进行选择)亚硝基胍处理及耐链霉素梯度培养对链霉素发酵单位的影响见实验结果表二。表二：亚硝基胍处理及耐链霉素梯度培养对链霉素发酵单位的影响从上表可以看出，各浓度范围、各诱变处理时间相同的条件下，复合处理的方案明显优于未复合处理的方案。将初筛获得的高产菌株，制备冷冻管，将冷冻管孢子接种到斜面培养基上，27℃培养7天。实施例3：复筛步骤一、菌种种子瓶培养：在750ml三角瓶中装入80ml种子培养基，灭菌冷却后，取上述冷冻管接种的斜面培养基上长好的孢子接种到种子培养基中，在27℃，250rpm摇床上培养50—72小时，然后接种到发酵瓶。步骤二、菌种发酵瓶培养：在750ml三角瓶中装入50ml发酵瓶培养基，灭菌冷却后，按5％的接种量将长好的种子接种到50ml发酵瓶培养基中，在27℃，250rpm摇床上培养168小时，取样测定效价。复筛三次。挑选出效价高于对照，且遗传稳定的菌株79#用于生产。该突变株79#初、复筛相对效价见表三。表三：复筛相对效价表菌株初筛复筛一复筛二复筛三79#122.2％114.5％115.4％117.3％对照100％100％100％100％当前第1页12