本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种针对胰腺癌的car-t细胞制备方法。
背景技术：
胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1％，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌早期的确诊率不高，手术死亡率较高，而治愈率很低。本病发病率男性高于女性，男女之比为1.5～2:1，男性患者远较绝经前的妇女多见，绝经后妇女的发病率与男性相仿。胰腺癌的病因尚不十分清楚。其发生与吸烟、饮酒、高脂肪和高蛋白饮食、过量饮用咖啡、环境污染及遗传因素有关；近年来的调查报告发现糖尿病人群中胰腺癌的发病率明显高于普通人群；也有人注意到慢性胰腺炎病人与胰腺癌的发病存在一定关系，发现慢性胰腺炎病人发生胰腺癌的比例明显增高；另外还有许多因素与此病的发生有一定关系，如职业、环境、地理等。
胰腺癌临床表现取决于癌的部位、病程早晚、有无转移以及邻近器官累及的情况。其临床特点是整个病程短、病情发展快和迅速恶化。最多见的是上腹部饱胀不适、疼痛。虽然有自觉痛，但并不是所有病人都有压痛，如果有压痛则和自觉痛的部位是一致的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种针对胰腺癌的car-t细胞制备方法，该方法提供了一种行之有效的胰腺癌治疗方法，并且有效降低患病复发几率。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种针对胰腺癌的car-t细胞制备方法，该方法包括如下步骤：
s1、采集患者外周血，提取外周血单个核细胞；
s2、将s1中得到的外周血单个核细胞用pbs洗涤，弃去上清液，取细胞沉淀中加入gt551重悬；
s3、将s2中得到的外周血单个核细胞以1x106个/孔接种于24孔板中，于每孔中加入培养液和60iu/mlil-2，培养24-36h，之后每孔板中加入20-40μlpersongentm生物膜；
s4、每隔16-18h将s3中培养的细胞分孔一次，每孔补充培养液1-2ml，每隔36-48h补充persongentm生物膜10-15μl，持续培养16-18d；
s5、将慢病毒对s4中的t细胞进行转染并扩增培养，获得car-t细胞。
进一步地，所述s1中的具体步骤为，采集患者外周富集血，滤除白细胞后缓慢移入装有淋巴细胞分离液的离心管中，用密度梯度离心法离心，吸取白膜层，得到外周血单个核细胞。
进一步地，s2中所述培养液成分为rpmi1640中加入10％fbs。
进一步地，s2中重悬后调整细胞浓度为2-2.5x106。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种针对胰腺癌的car-t细胞的制备方法，该方法通过采集胰腺癌患者外周血得到单个核细胞，并将核细胞接种于加入有persongentm生物膜的24孔板中，通过体外培养得到t细胞，并用病毒感染的方法得到car-t细胞，得到的car-t细胞可以通过细胞制剂注射进入胰腺癌患者体内，该方法提供了一种行之有效的胰腺癌治疗方法，并且有效降低患病复发几率。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种针对胰腺癌的car-t细胞制备方法，该方法具体步骤如下：
实施例1
s1、采集患者外周富集血，滤除白细胞后缓慢移入装有淋巴细胞分离液的离心管中，用密度梯度离心法离心，其中离心参数为2000r/min，20℃，15min，吸取白膜层，得到外周血单个核细胞；
s2、将s1中得到的外周血单个核细胞用pbs洗涤，弃去上清液，取细胞沉淀中加入gt551重悬，调整细胞浓度为2x106；
s3、将s2中得到的外周血单个核细胞以1x106个/孔接种于24孔板中，于每孔中加入培养液和60iu/mlil-2，置于37℃，5％co2培养箱中培养中培养24h，之后每孔板中加入20μlpersongentm生物膜；
其中，所述培养液成分为rpmi1640中加入10％fbs；
s4、每隔16h将s3中培养的细胞分孔一次，每孔补充培养液1-2ml，每隔36h补充persongentm生物膜10μl，持续培养16d；
s5、将慢病毒对s4中的t细胞进行转染并扩增培养，获得car-t细胞。
实施例2
s1、采集患者外周富集血，滤除白细胞后缓慢移入装有淋巴细胞分离液的离心管中，用密度梯度离心法离心，其中离心参数为2200r/min，25℃，20min，吸取白膜层，得到外周血单个核细胞；
s2、将s1中得到的外周血单个核细胞用pbs洗涤，弃去上清液，取细胞沉淀中加入gt551重悬，调整细胞浓度为2.5x106；
s3、将s2中得到的外周血单个核细胞以1x106个/孔接种于24孔板中，于每孔中加入培养液和60iu/mlil-2，置于37℃，5％co2培养箱中培养中培养36h，之后每孔板中加入40μlpersongentm生物膜；
其中，所述培养液成分为rpmi1640中加入10％fbs；
s4、每隔18h将s3中培养的细胞分孔一次，每孔补充培养液2ml，每隔48h补充persongentm生物膜15μl，持续培养16-18d；
s5、将慢病毒对s4中的t细胞进行转染并扩增培养，获得car-t细胞。
实施例3
s1、采集患者外周富集血，滤除白细胞后缓慢移入装有淋巴细胞分离液的离心管中，用密度梯度离心法离心，其中离心参数为2100r/min，22℃，18min，吸取白膜层，得到外周血单个核细胞；
s2、将s1中得到的外周血单个核细胞用pbs洗涤，弃去上清液，取细胞沉淀中加入gt551重悬，调整细胞浓度为2.3x106；
s3、将s2中得到的外周血单个核细胞以1x106个/孔接种于24孔板中，于每孔中加入培养液和60iu/mlil-2，置于37℃，5％co2培养箱中培养中培养30h，之后每孔板中加入30μlpersongentm生物膜；
其中，所述培养液成分为rpmi1640中加入10％fbs；
s4、每隔17h将s3中培养的细胞分孔一次，每孔补充培养液1.5ml，每隔40h补充persongentm生物膜12μl，持续培养16-18d；
s5、将慢病毒对s4中的t细胞进行转染并扩增培养，获得car-t细胞。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。