水稻tMAPKKK5基因在改良水稻产量性状方面的应用的制作方法

本发明属于转基因技术领域，涉及改良水稻产量性状方法，具体涉及水稻tmapkkk5基因在改良水稻产量性状方面的应用。

背景技术：

据资料显示，水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界有约2/3的人口以水稻为主食。在全球范围内耕地面积逐渐减少的情况下，提高水稻单位产量将能满足日益增长的人口对粮食的需求，具有重要的现实意义。目前国内外利用转基因改良作物经济性状的技术与方法主要是根据已知的功能基因与表型性状的关系,采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植物,以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良.。

有研究发现，在真核生物细胞中，mapk级联途径与细胞周期有多方面的关系。基于现有技术的基础，本申请的发明人通过对实验室已有的rrm2转基因高产水稻植株进行基因芯片分析，发现转基因植株中rrm2基因与mapk级联途径和细胞周期有关，rrm2可能通过mapk级联途径影响细胞周期从而调控产量性状；本发明选取rrm2转基因高产水稻植株芯片分析结果中表达量上升25倍的tmapkkk5，利用转基因方法将其克隆到表达载体,然后导入农作物细胞,以期获得重要经济性状发生改良的转基因再生植株。

技术实现要素：

本发明目的在于基于现有技术的现状，提供一种改良水稻产量性状方法，具体涉及水稻tmapkkk5基因在改良水稻产量性状方面的方法。

具体的，本发明提供了水稻tmapkkk5基因在改良水稻产量性状方面的应用，其中，利用水稻tmapkkk5基因转化籼稻品种，以改良水稻的产量性状；本发明的实施例中，将水稻tmapkkk5基因转化处理籼稻品种9311，使籼稻桂朝二号的生长势和产量性状获得明显改善。

本发明进行了水稻tmapkkk5基因的分离、克隆与转基因功能研究实验；

1)tmapkkk5基因与蛋白结构组成

水稻tmapkkk5基因，genbank登录号为ak106496，该登陆基因序列全长2624bp，其中调控区长1349bp，编码区长1275bp，序列如seq.idno1.所示；全长cds由3个外显子组成，正常编码的cdna长1275bp，序列如seq.idno2.所示；编码424个氨基酸，序列如seq.idno3.所示。

水稻tmapkkk5基因结构如图1所示；

2)tmapkkk5基因表达载体的构建

采用pcambia1304(centerfortheapplicationofmolecularbiologyofinternationalagriculture,canberra,act,australia)为表达载体，将籼稻9311的tmapkkk5基因插入到pcambia1304载体35s组成型启动子下游，得到含tmapkkk5基因的表达载体，其结构图如图2所示；

3)tmapkkk5基因转化实验

采用具有高级别产量性状的籼稻9311为转基因受体，构建tmapkkk5基因过表达的转基因植株；将籼稻9311成熟种子去壳消毒后接种在脱分化植物组织培育基上诱导愈伤组织，在愈伤组织诱导2-3周后，采用基因枪微弹轰击法，将含tmapkkk5基因的经纯化的pcambia1304质粒dna导入籼稻9311愈伤组织细胞，在添加30ppm潮霉素的ms培养基上连续培养3-4周筛选抗性细胞系，然后将筛选的细胞系转移到分化培养基诱导长芽和生根；

4)转化处理试管苗移载及转化植株后代的分子检测

将tmapkkk5基因转化处理的籼稻9311试管苗移载田间，并在分蘖期取叶片提取dna采用pcr扩放技术进行分子检测，于2012年冬获得阳性t0代植株，2013年夏，在海南岛加代繁殖，获得转基因t1代，共计4个株系；

5)tmapkkk5基因转化籼稻9311转基因植株的pcr检测

目的基因在籼稻9311对照植株中虽然表达，但是表达水平较低，同时本发明通过使用跨越表达载体启动子(籼稻9311对照植株中不存在)和插入片段的检测引物，可以检测转基因植株是否转入了目标序列；

检测结果显示，目的片段在籼稻9311对照株中不表达，而在转基因植株中表达(如图3所示)；

6)tmapkkk5转9311植株转基因的rt检测

结果显示，目的基因tmapkkk5在转基因植株中与对照相比表达量上升(如图4所示)；

7)tmapkkk5转基因t4代群体产量性状的调查与统计

将tmapkkk5转基因t3代于2015年冬播种于海南三亚南滨农场试验田，每个小区种植30株，行株距为6寸×6寸，每行10株，重复2次，同时设立籼稻9111对照，在成熟期统计各小区20个单株的株高，主穗长，穗粒数，千粒重计算平均值，统计结果(如表1所示)显示，与对照相比，tmapkkk5转基因植株的株高，主穗长，总粒数，分蘖数，平均穗粒数，千粒重及理论产量性状优于对照：株高增高约14.9％，主穗长增长约12.7％，总粒数增多约53.5％，分蘖增加约30％，平均穗粒数增加17％，千粒重增加约13.7％，理论产量提高约72.9％。

表1

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为水稻tmapkkk5基因结构。

图2为水稻tmapkkk5基因的表达载体结构图。

图3为水稻tmapkkk5基因转化野生稻籼稻9311转基因植株的pcr检测。

图4为水稻tmapkkk5基因在转基因植株与对照中表达量的比较。

图5为水稻tmapkkk5转基因植株与对照千粒重比较。

图6为水稻tmapkkk5转基因植株与对照在二叶期形态对比。

图7为水稻tmapkkk5转基因植株与对照在两叶一心时期形态对比。

图8为水稻tmapkkk5转基因植株与对照在成熟期植株生长势比较。

具体实施方式

实施例1

1)选择tmapkkk5基因全长orf及其上游10bp及下游30bp区段，采用pcr方法从籼稻9311中将其扩增，并合成插入接头克隆到植物表达载体pcambia1304，获得tmapkkk5基因表达载体pcambia1304/tmapkkk5。

2)诱导水稻愈伤组织培养基

(1)诱导及继代培养基：ms+2mg/l2,4-d；

(2)高渗培养基：ms+2mg/l2,4-d+46.67g/l山梨醇+46.67g/l甘露醇；

(3)第一轮筛选培养基：ms+2mg/l2,4-d+30mg/l潮霉素；

(4)第二轮筛选培养基：ms+2mg/l2,4-d+50mg/l潮霉素；

(5)分化培养基：ms+3mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+50mg/l潮霉素；

(6)生根壮苗培养基：1/2ms+0.1mg/lnaa；

其中，上述步骤中所述的培养基均含30g/l蔗糖+2.5g/lagar，ph5.8；

所述的愈伤诱导、继代、筛选培养条件为26-28℃暗培养，分化、生根壮苗为26-28℃及16小时光周期；

3)愈伤组织诱导与处理

(1)取授粉后12-15天的未成熟9311种子，在无菌条件下，先用70％乙醇浸洗10min，转入0.1％升汞浸泡20min，无菌水清洗3次；

(2)在无菌条件下剥离幼胚，接种于愈伤诱导培养基上，26-28℃暗培养约20天后切芽，继代一次；

(3)在继代培养基中挑选生长旺盛、淡黄色的愈伤30-50块(每块3mm左右)，置于高渗培养基上中央，排成直径约2.5cm的圆圈内，培养约4-5h后用于转化；

4)基因枪转化

(1)基因枪:为从宁波新芝科技有限公司购置的高压气体基因枪,型号:gj-1000；

(2)微粒子弹制备；

(3)称取60mg钨粉(直径约1um)，加入到1.5ml灭菌离心管中，再加入1ml无水乙醇，振荡1min，于10000rpm离心10s，弃上清，重复洗一次后，将金粉悬浮于1ml无菌水中现用或-20℃保存；

(4)吸取50ul钨粉悬浮液于1.5ml离心管，依次加入5ugdna、50ul2.5mcacl2、20ul0.1m亚精胺，振荡5分钟，10000rpm离心20s，弃上清，以140ul无水乙醇漂洗两次，加入60ul无水乙醇，悬浮待用；

5)轰击受体材料

(1)将基因枪放于超净工作台上，用70％酒精擦净真空室，并将可裂膜、载粒膜、金属挡网(均购于宁波新芝科技有限公司)于70％酒精中消毒30分钟，然后用无菌滤纸吸干或吹净残余酒精；

(2)打开电源开关，真空泵及氦气瓶阀；

(3)将可裂膜装入固定、旋紧；

(4)取10ul包被dna的钨粉无水乙醇悬浮液，均匀涂布于载粒膜中心，放在超净台上吹干；

(5)将载有微弹的载粒膜及挡网装入微弹发射装置，使有颗粒的一面朝下；

(6)将培养皿放在托盘上，使愈伤集中于培养皿中央；

(7)打开气瓶，调节压力1100psi；

(8)抽真空，当真空度达到需要值时，将vac键转到hold位置；

(9)轰击，每皿轰击2次(第一次轰击后将培养皿旋转90度后进行第二次轰击)，按放气键使真空表读数回零，取出样品，轰击后于高渗培养基上继续培养12-16h；

6)转化愈伤组织筛选

(1)将打枪后高渗培养基上的愈伤转入不含筛选剂的诱导培养基上恢复生长5-7天；

(2)将愈伤转到含30mg/l潮霉素的筛选培养基上，均匀摆放，暗培养14-17天进行第一次抗性筛选；

(3)将抗性愈伤转入含50mg/l潮霉素的筛选培养基上，暗培养8-12天进行第二次抗性筛选；

7)转化植株筛选与检测

(1)将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天；

(2)待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室；

(3)分别采用pcr扩增检测侯选的转化植株,共获得8株含有转化片段的阳性植株。

经实验，结果证实，本发明将水稻tmapkkk5基因导入籼稻基因组中，能明显改良水稻的产量性状。

本发明涉及的序列

seqidno.1：

aaaaaaattcgcccaaatggcgggggtcgtcgtcgtcgtcttcgtctccgatccccctctcctcatccgcctccacccctcacatcgccattgccactgtgatcactagggtttcgcgctgctcctccaggtaaggattcgctcgccttcgccgatgcggtggtggaagcgctcggtctccccttccccgtccccgtcctcttcgtccgcgtccgcgtccacgcccgcgtccccggcgcgggcctcgacctcccgcgttggcggcggtgtccccagccgccgccgggatgtggtggggtttggttggggtggggggagtgatccgcagccgcggttgaccaggcagaggcggctgcggcacgtcgacgacatcgaggtcggggtctcggcgctcgggctggattcctccccctcgcccgccgcgccctcgtcgtgcccctccagtagggattcggtggggttcggcctcctgaccgcgagctccacgccgatctcgaggaccgcgagtaacatggaggtggcgccgccgaggtcgtcgtcgtctcccgtgctgctgccgcacccgctgcccctgcccgatgagggggactcgccctgccgcggctccgggagatccctcccgtcgcccaagctattcgaaggagactgcaacgggtcggccgtggagtcgaacttgctcggggtttccgagatcgggagcgacagagcatcgttgtttccgagagtgatggctaagacggtgcaaaaaaaccctgagcatggtgacttgcgatcaaatggcacaaatgggattaactgtggacaacggaggaaggcatttaaagagaaattacaggataagagctcagctgaaacattgacattcagattgaacatacccgctaaaagtgctccaagcagtggattttcaagccctgtacagagtcctcgaagactgagtagtgtagactttttgtccactgcaacatccacccaaggtgccaatttatcgtcagcgcagtcagtctggtctcctgatctatatggatcttcacctcgttgtgcgtcacctgaaaaaattatgggtagtcaggagcgatctcctcgctccagtccattgagaagccctgttctaagatcaaaaaacccaagtgcacctccttcaccaatgcatccaaagttgttcccggagaaccatgtttctcgtcctgagggcaatgggagtgtaaatttccatccattacccctcccacccgcctctgtaagcccaaagcagacgaattttagtcaccagccagttccaaaagttgatgcaccctcaatggctggtcagtggcaaaaaggaaagctcattggcagtggaacatttggatgtgtatatgaggccgccaataggtatgcaaatgcattttatatagcattatgtttgctggatcatcttaaagtttgaacatttcatctggcatctaacgtacagacacactggagctctgtgtgccatgaaagaggtcaacataattcccgatgatgctaaatcagctgagtctctcaagcaattggagcaggtttggccttgtgttattagtatcagtttgtaagaacatagatgatggatgatgtttattctgcagtgatggtattatcaaatactattctctgatgtgtctgtttcccacaacagaataccttttctcttactttgaggattaaatattattattactatcctcaagtacatattagtttctagcatgcatatcacttttttgaacttggtcgtataatgttattgtaactctgcttgagtactctcctcttctataattatatctaaagattatgtaagttctgcccttgctctttttgactggatctcactttgtttcaggaaataaaatttcttagtcaattcaagcatgaaaacatagtgcagtactacggcagtgaatatgtaagttctcatgtgccaaattgaggtgatattatgcgctagttattaatgtatccaatgatcatctggatactttgcagattgaagatcgattctacatatacctggaatatgttcaccctggttcaattaataaatatgttaatcaacattgtggagcaatgacagaatcagtaatccgcagcttcacccgccatatacttaaaggccttgcctttttacatagtcagaagattatgcataggtaaccttttctcttttttctgtttcatttgtttaactaataatggccatctcactatgtgaaagttttcttgaacttaccttttgttcagctcttttagatggtctccttttattttttacatgtagagatttcttcatcctatttctgtgccattttggtttctattgtttgtttatgtttttgtgttttctcaagcttattttgtatttgtacccacattcatcttatagctgattcagatcccacaaatttaaaaaattggactccattttggattccagtagatttttgaattggctagaatatgattccaattcaaatatttatgtttggatgagtggaattataacaatgaatcaactcagaaaaaagtgtttggatgttgagattgggatcatagccagaatcctacctaggcattgcatcggatgcaaaatcaaagtaatc

seqidno.2：

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seqidno.3：

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