本发明属于基因工程领域，具体涉及一种蔗糖磷酸化酶突变体及其应用。
背景技术：
蔗糖磷酸化酶(ec2.4.1.7)属于糖基转移酶第13家族(gh13)，其在体内催化蔗糖分子的可逆磷酸化(以磷酸基作为葡萄糖的受体，产物为α-d-葡萄糖-1磷酸和d-果糖)。由于该酶的分步反应机理及其活性位点的特殊结构，反应中的葡糖基受体除磷酸基外，还可以是抗败血酸、氢醌、橙皮苷、甘油等其他具有生物活性的分子。这些生物活性分子的糖基化可提高其稳定性、增加其可溶性、增强乃至赋予其新的生理活性。相应的糖基化产物可作为食品或化妆品的功能性添加物，因而具有巨大的应用价值和市场前景。
α-葡糖基甘油又称2-甘油葡萄糖苷，结构式如式(ⅰ)所示。1-甘油葡萄糖苷的结构式如式(ⅱ)所示。2-甘油葡萄糖苷可以上调水孔蛋白(aquaporin)的表达，对皮肤具有“滋润保湿”的生理效果，可作为化妆品的功能性添加，具有较大的市场需求。2-甘油葡萄糖苷的保湿效果优于1-甘油葡萄糖苷。以蔗糖和甘油为原料，在蔗糖磷酸化酶的作用下可以生产2-甘油葡萄糖苷。但现有技术中存在的问题是，生成2-甘油葡萄糖苷的同时，伴随着大量副产物1-甘油葡萄糖苷的生成。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种蔗糖磷酸化酶突变体及其应用。
本发明提供的一种蛋白质，是将蔗糖磷酸化酶第341位氨基酸残基由亮氨酸(l)替换为其它氨基酸残基得到的。
本发明提供的蛋白质可为basp/l341d蛋白。所述basp/l341d蛋白为将蔗糖磷酸化酶第341位氨基酸残基由亮氨酸(l)替换为天冬氨酸(d)得到的突变体蛋白。
本发明提供的蛋白质可为basp/l341r蛋白。所述basp/l341r蛋白为将蔗糖磷酸化酶第341位氨基酸残基由亮氨酸(l)替换为精氨酸(r)得到的突变体蛋白。
所述蔗糖磷酸化酶具体可为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖磷酸化酶功能的由序列1衍生的蛋白质；
(a3)来源于青春双歧杆菌且与序列1所示蛋白质具有90％以上同一性的蛋白质。
编码basp/l341d蛋白的基因也属于本发明的保护范围。编码basp/l341d蛋白的基因具体可为如下(b1)或(b2)或(b5)或(b6)。
编码basp/l341r蛋白的基因也属于本发明的保护范围。编码basp/l341r蛋白的基因具体可为如下(b3)或(b4)或(b5)或(b6)。
(b1)编码区为将序列表的序列2所示的双链dna分子第1021-1023位核苷酸由“ctc”突变为“gac”的dna分子。
(b2)将序列表的序列2所示的双链dna分子第1021-1023位核苷酸由“ctc”突变为“gac”的dna分子。
(b3)编码区为将序列表的序列2所示的双链dna分子第1021-1023位核苷酸由“ctc”突变为“cgc”的dna分子。
(b4)将序列表的序列2所示的双链dna分子第1021-1023位核苷酸由“ctc”突变为“cgc”的dna分子。
(b5)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的dna序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子。
(b6)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码所述蛋白质的dna分子。
上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有编码basp/l341d蛋白的基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系菌属于本发明的保护范围。将含有编码basp/l341d蛋白的基因的重组菌命名为重组菌basp/l341d。重组菌basp/l341d具体可为将重组质粒pbad-basp/l341d导入大肠杆菌bw25113得到的重组菌。重组质粒pbad-basp/l341d为在载体pbad/hisb的多克隆位点(例如xhoi和psti酶切位点之间)插入编码basp/l341d蛋白的基因得到的重组质粒。
含有编码basp/l341r蛋白的基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系菌属于本发明的保护范围。将含有编码basp/l341r蛋白的基因的重组菌命名为重组菌basp/l341r。重组菌basp/l341r具体可为将重组质粒pbad-basp/l341r导入大肠杆菌bw25113得到的重组菌。重组质粒pbad-basp/l341r为在载体pbad/hisb的多克隆位点(例如xhoi和psti酶切位点之间)插入编码basp/l341r蛋白的基因得到的重组质粒。
本发明还保护basp/l341d蛋白在生产2-甘油葡萄糖苷中的应用。
本发明还保护重组菌basp/l341d在生产2-甘油葡萄糖苷中的应用。
本发明还保护basp/l341d蛋白在以蔗糖和甘油为原料生产2-甘油葡萄糖苷中的应用。
本发明还保护重组菌basp/l341d在以蔗糖和甘油为原料生产2-甘油葡萄糖苷中的应用。
本发明还保护basp/l341r蛋白在生产2-甘油葡萄糖苷中的应用。
本发明还保护重组菌basp/l341r在生产2-甘油葡萄糖苷中的应用。
本发明还保护basp/l341r蛋白在以蔗糖和甘油为原料生产2-甘油葡萄糖苷中的应用。
本发明还保护重组菌basp/l341r在以蔗糖和甘油为原料生产2-甘油葡萄糖苷中的应用。
本发明还保护一种生产2-甘油葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：以蔗糖和甘油为原料，在basp/l341d蛋白的作用下，得到2-甘油葡萄糖苷。
本发明还保护一种生产2-甘油葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：以蔗糖和甘油为原料，在重组菌basp/l341d的作用下，得到2-甘油葡萄糖苷。
所述方法包括如下步骤：培养重组菌basp/l341d并在培养过程中进行l-阿拉伯糖诱导，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体、甘油和蔗糖，进行反应，得到2-甘油葡萄糖苷。菌体、甘油和蔗糖的质量配比为：10：200：200。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/l、甘油200g/l、蔗糖200g/l。菌体质量为湿重。所述缓冲体系为ph6.0的磷酸盐缓冲液。所述反应的条件具体为：30℃、80rpm振荡60h。
所述方法具体包括如下步骤：在液体lb培养基中培养重组菌basp/l341d至od600nm＝0.6-0.8(具体可为0.7)，然后加入l-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100ml，30℃、200rpm振荡培养12小时，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体、甘油和蔗糖，进行反应，得到2-甘油葡萄糖苷。菌体、甘油和蔗糖的质量配比为：10：200：200。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/l、甘油200g/l、蔗糖200g/l。菌体质量为湿重。所述缓冲体系为ph6.0的磷酸盐缓冲液。所述反应的条件具体为：30℃、80rpm振荡60h。
本发明还保护一种生产2-甘油葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：以蔗糖和甘油为原料，在basp/l341r蛋白的作用下，得到2-甘油葡萄糖苷。
本发明还保护一种生产2-甘油葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：以蔗糖和甘油为原料，在重组菌basp/l341r的作用下，得到2-甘油葡萄糖苷。
所述方法包括如下步骤：培养重组菌basp/l341r并在培养过程中进行l-阿拉伯糖诱导，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体、甘油和蔗糖，进行反应，得到2-甘油葡萄糖苷。菌体、甘油和蔗糖的质量配比为：10：200：200。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/l、甘油200g/l、蔗糖200g/l。菌体质量为湿重。所述缓冲体系为ph6.0的磷酸盐缓冲液。所述反应的条件具体为：30℃、80rpm振荡60h。
所述方法具体包括如下步骤：在液体lb培养基中培养重组菌basp/l341r至od600nm＝0.6-0.8(具体可为0.7)，然后加入l-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100ml，30℃、200rpm振荡培养12小时，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体、甘油和蔗糖，进行反应，得到2-甘油葡萄糖苷。菌体、甘油和蔗糖的质量配比为：10：200：200。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/l、甘油200g/l、蔗糖200g/l。菌体质量为湿重。所述缓冲体系为ph6.0的磷酸盐缓冲液。所述反应的条件具体为：30℃、80rpm振荡60h。
本发明通过在来源于青春双歧杆菌的野生型蔗糖磷酸化酶的第341位氨基酸残基引入点突变，显著的提高了其以蔗糖和甘油为原料生产2-甘油葡萄糖苷的特异性，降低了副产物1-甘油葡萄糖苷的产量。本发明对于2-甘油葡萄糖苷的生产领域具有重大的应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的磷酸盐缓冲液均为50mm的pbs缓冲液。对于同一条件参数下的不同次反应的色谱图来说，目标峰保留时间会有一定的误差范围，一般相差0.1min内可以视为误差。2-甘油葡萄糖苷标准品：百灵威，货号j60-h943140。实施例中，菌体重量均为湿重。
青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)：cgmcc1.2190。载体pbad/hisb：invitrogen公司，产品目录号为v430-01。大肠杆菌bw25113：biovectorntccinc，货号为355297。
实施例1、构建重组菌
一、构建重组菌basp
1、提取青春双歧杆菌的基因组dna。
2、以步骤1得到的基因组dna为模板，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物。
f1：5’-gcctggtgccgcgcggcagcctcgagatgaaaaacaaggtgcag-3’；
r1：5’-cagctgcagaccgagctcaccctgcagtcaggcgacgacaggcggattg-3’。
3、取步骤2得到的pcr扩增产物，采用限制性内切酶xhoi和psti进行双酶切，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶xhoi和psti双酶切载体pbad/hisb，回收约4000bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pbad-basp。
根据测序结果，对重组质粒pbad-basp进行结构描述如下：将载体pbad/hisb的xhoi和psti酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列2所示的双链dna分子。序列表的序列2所示的dna分子编码序列表的序列1所示的basp蛋白。
6、将重组质粒pbad-basp导入大肠杆菌bw25113，得到重组菌basp。
二、构建重组菌basp/l341d
1、以重组质粒pbad-basp为模板，采用f2和r2组成的引物对引入单点突变，得到重组质粒pbad-basp/l341d。
f2：5’-tccaatgacgacctctaccaggtcaacag-3’；
r2：5’-gaggtcgtcattggatgcggcggcgccag-3’。
根据测序结果，对重组质粒pbad-basp/l341d进行结构描述如下：将重组质粒pbad-basp中序列表的序列2所示的双链dna分子第1021-1023位核苷酸由“ctc”突变为了“gac”。突变后的dna分子编码basp/l341d蛋白。与basp蛋白相比，basp/l341d蛋白的差异仅在于将basp蛋白第341位氨基酸残基由亮氨酸(l)突变为了天冬氨酸(d)。
2、将重组质粒pbad-basp/l341d导入大肠杆菌bw25113，得到重组菌basp/l341d。
三、构建重组菌basp/l341r
1、以重组质粒pbad-basp为模板，采用f3和r3组成的引物对引入单点突变，得到重组质粒pbad-basp/l341r。
f3：5’-tccaatcgcgacctctaccaggtcaacag-3’；
r3：5’-gaggtcgcgattggatgcggcggcgccag-3’。
根据测序结果，对重组质粒pbad-basp/l341r进行结构描述如下：将重组质粒pbad-basp中序列表的序列2所示的双链dna分子第1021-1023位核苷酸由“ctc”突变为了“cgc”。突变后的dna分子编码basp/l341r蛋白。与basp蛋白相比，basp/l341r蛋白的差异仅在于将basp蛋白第341位氨基酸残基由亮氨酸(l)突变为了精氨酸(r)。
2、将重组质粒pbad-basp/l341r导入大肠杆菌bw25113，得到重组菌basp/l341r。
四、构建重组菌pbad
将载体pbad/hisb导入大肠杆菌bw25113，得到重组菌pbad。
实施例2、应用重组菌制备2-甘油葡萄糖苷
分别将重组菌basp、重组菌basp/l341d、重组菌basp/l341r或重组菌pbad进行以下步骤：
1、取重组菌的单克隆，接种至液体lb培养基，37℃、220rpm振荡培养至od600nm＝0.7(实际应用中，od600nm＝0.6-0.8均可)。
2、完成步骤1后，在培养体系中加入l-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100ml，30℃、200rpm振荡培养12小时。
3、完成步骤2后，取整个培养体系，4℃、6000rpm离心15min，收集菌体沉淀。
4、制备反应体系。
反应体系由步骤3得到的菌体沉淀、甘油、蔗糖和ph6.0的磷酸盐缓冲液组成。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/l、甘油200g/l、蔗糖200g/l。
反应条件：30℃、80rpm振荡60h。
5、完成步骤4后，取反应体系，检测其中的2-甘油葡萄糖苷的含量，具体步骤如下：
(1)取反应体系，12000rpm离心2min，收集上清液。
(2)用蒸馏水稀释步骤(1)得到的上清液，得到上样液。
(3)取步骤(2)得到的上样液，采用高效液相色谱法检测2-甘油葡萄糖苷含量。hplc系统：agilent1260；色谱柱：watersamide柱(34.6×150mm,3.5μm)；流动相由800体积份乙腈和200体积份1‰氨水组成；
进样量10μl；柱温30℃；流速1ml/min；rid检测器检测。
在上述色谱条件下，2-甘油葡萄糖苷标准品的出峰位置为8.141min，1-甘油葡萄糖苷标准品的出峰位置为9.108min。
用2-甘油葡萄糖苷标准品建立2-甘油葡萄糖苷含量与峰面积的标准曲线方程如下：y＝29060x(r2＝0.9999)；其中x为hplc色谱图中的峰面积，y为2-甘油葡萄糖苷浓度，单位为g/l。
用1-甘油葡萄糖苷标准品建立1-甘油葡萄糖苷含量与峰面积的标准曲线方程如下：y＝29060x(r2＝0.9999)；其中x为hplc色谱图中的峰面积，y为1-甘油葡萄糖苷浓度，单位为g/l。
重组菌basp完成步骤4的反应体系中，2-甘油葡萄糖苷的浓度为45g/l(10次重复试验的平均值)，1-甘油葡萄糖苷的浓度为30g/l(10次重复试验的平均值)，2-甘油葡萄糖苷与1-甘油葡萄糖苷的产量比为1.5:1。
重组菌basp/l341d完成步骤4的反应体系中，2-甘油葡萄糖苷的浓度为60g/l(10次重复试验的平均值)，1-甘油葡萄糖苷的浓度为21g/l(10次重复试验的平均值)，2-甘油葡萄糖苷与1-甘油葡萄糖苷的产量比为2.86:1。
重组菌basp/l341r完成步骤4的反应体系中，2-甘油葡萄糖苷的浓度为55g/l(10次重复试验的平均值)，1-甘油葡萄糖苷的浓度为17g/l(10次重复试验的平均值)，2-甘油葡萄糖苷与1-甘油葡萄糖苷的产量比为3.24:1。
重组菌pbad完成步骤4的反应体系中2-甘油葡萄糖苷的浓度为0g/l(10次重复试验的平均值)，1-甘油葡萄糖苷的浓度为0g/l(10次重复试验的平均值)。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>蔗糖磷酸化酶突变体及其应用
<130>gncyx171491
<141>2017-08-25
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>504
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
metlysasnlysvalglnleuilethrtyralaaspargleuglyasp
151015
glythrilelyssermetthraspileleuargthrargpheaspgly
202530
valtyraspglyvalhisileleuprophephethrpropheaspgly
354045
alaaspalaglypheaspproileasphisthrlysvalaspgluarg
505560
leuglysertrpaspaspvalalagluleuserlysthrhisasnile
65707580
metvalaspalailevalasnhismetsertrpgluserlysglnphe
859095
glnaspvalleualalysglyglugluserglutyrtyrprometphe
100105110
leuthrmetserservalpheproasnglyalathrglugluaspleu
115120125
alaglyiletyrargproargproglyleuprophethrhistyrlys
130135140
phealaglylysthrargleuvaltrpvalserphethrproglngln
145150155160
valaspileaspthraspserasplysglytrpglutyrleumetser
165170175
ilepheaspglnmetalaalaserhisvalsertyrileargleuasp
180185190
alavalglytyrglyalalysglualaglythrsercysphemetthr
195200205
prolysthrphelysleuileserargleuargglugluglyvallys
210215220
argglyleugluileleuilegluvalhissertyrtyrlyslysgln
225230235240
valgluilealaserlysvalaspargvaltyraspphealaleupro
245250255
proleuleuleuhisalaleuserthrglyhisvalgluprovalala
260265270
histrpthraspileargproasnasnalavalthrvalleuaspthr
275280285
hisaspglyileglyvalileaspileglyseraspglnleuasparg
290295300
serleulysglyleuvalproaspgluaspvalaspasnleuvalasn
305310315320
thrilehisalaasnthrhisglygluserglualaalathrglyala
325330335
alaalaserasnleuaspleutyrglnvalasnserthrtyrtyrser
340345350
alaleuglycysasnaspglnhistyrilealaalaargalavalgln
355360365
phepheleuproglyvalproglnvaltyrtyrvalglyalaleuala
370375380
glylysasnaspmetgluleuleuasnlysthrasnasnglyargasp
385390395400
ileasnarghistyrtyrserthralagluileaspgluasnleulys
405410415
argprovalvallysalaleuasnalaleualalyspheargasnglu
420425430
leuaspalapheaspglythrphesertyrthrthrprothraspthr
435440445
serileserphethrtrpargglygluthrserglualathrleuthr
450455460
phegluprolysargglyleuglyvalaspasnthrthrprovalala
465470475480
metleuglutrphisaspseralaglyasphisargseraspaspleu
485490495
ilealaasnproprovalvalala
500
<210>2
<211>1515
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
atgaaaaacaaggtgcagctcatcacttacgccgaccgccttggcgacggcaccatcaag60
tcgatgaccgacattctgcgcacccgcttcgacggcgtgtacgacggcgttcacatcctg120
ccgttcttcaccccgttcgacggcgccgacgcaggcttcgacccgatcgaccacaccaag180
gtcgacgaacgtctcggcagctgggacgacgtcgccgaactctccaagacccacaacatc240
atggtcgacgccatcgtcaaccacatgagttgggaatccaagcagttccaggacgtgctg300
gccaagggcgaggagtccgaatactatccgatgttcctcaccatgagctccgtgttcccg360
aacggcgccaccgaagaggacctggccggcatctaccgtccgcgtccgggcctgccgttc420
acccactacaagttcgccggcaagacccgcctcgtgtgggtcagcttcaccccgcagcag480
gtggacatcgacaccgattccgacaagggttgggaatacctcatgtcgattttcgaccag540
atggccgcctctcacgtcagctacatccgcctcgacgccgtcggctatggcgccaaggaa600
gccggcaccagctgcttcatgaccccgaagaccttcaagctgatctcccgtctgcgtgag660
gaaggcgtcaagcgcggtctggaaatcctcatcgaagtgcactcctactacaagaagcag720
gtcgaaatcgcatccaaggtggaccgcgtctacgacttcgccctgcctccgctgctgctg780
cacgcgctgagcaccggccacgtcgagcccgtcgcccactggaccgacatacgcccgaac840
aacgccgtcaccgtgctcgatacgcacgacggcatcggcgtgatcgacatcggctccgac900
cagctcgaccgctcgctcaagggtctcgtgccggatgaggacgtggacaacctcgtcaac960
accatccacgccaacacccacggcgaatccgaagcagccactggcgccgccgcatccaat1020
ctcgacctctaccaggtcaacagcacctactattcggcgctcgggtgcaacgaccagcac1080
tacatcgccgcccgcgcggtgcagttcttcctgccgggcgtgccgcaagtctactacgtc1140
ggcgcgctcgccggcaagaacgacatggagctgctgaacaagacgaataacggccgcgac1200
atcaatcgccattactactccaccgcggaaatcgacgagaacctcaagcgtccggtcgtc1260
aaggccctgaacgcgctcgccaagttccgcaacgagctcgacgcgttcgacggcacgttc1320
tcgtacaccaccccgaccgacacgtccatcagcttcacctggcgcggcgaaaccagcgaa1380
gccacgctgacgttcgagccgaagcgcggtctcggtgtggacaacactacgccggtcgcc1440
atgttggaatggcatgattccgcgggagaccaccgttcggatgatctgatcgccaatccg1500
cctgtcgtcgcctga1515