一种通过基因编辑创制高花青素紫黑果番茄材料的方法与流程

文档序号：17050608发布日期：2019-03-05 20:03阅读：1466来源：国知局

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因编辑创制高花青素紫黑果番茄材料的方法。

背景技术：

花青素是一类广泛存在于植物体内的类黄酮类色素。因其极强的抗氧化性能力，在防治心血管疾病和乳腺癌方面疗效显著。花青素的生物合成受myb家族转录因子调控。根据结构域差异，myb转录因子可分为r2r3-myb和r3-myb等亚家族。r2r3-myb一般激活花青素合成途径，而r3-myb一般抑制花青素合成途径，两者在调控花青素合成方面是相互拮抗的。

番茄是重要的果实类蔬菜作物，但绝大多数栽培番茄果实不含有花青素，而一些野生种番茄果实有花青素积累。目前人们已从野生种番茄中分离多个与果实花青素积累有关的遗传位点，包括来自智利番茄(solanumchilense)的显性遗传位点aft、来自类番茄(solanumlycopersicoides)的显性遗传位点abg以及来自契斯曼尼番茄(solanumcheesmaniae)的隐性遗传位点atv。aft和abg位于10号染色体，它们很可能是普通栽培番茄ant1或an2的等位基因，编码r2r3-myb类转录因子。而atv位于7号染色体，可能是普通栽培番茄solyc07g052490基因的等位基因，编码r3-myb类转录因子。通过与上述野生种的杂交，人们已将这三个位点转育到普通栽培番茄中，获得了含有单个和多个位点的遗传材料。遗传学数据表明：单个aft或abg基因位点对果实花青素的积累贡献不大，相应材料(分别名为aft材料和abg材料)果皮部位只有少量花青素积累，呈浅紫色点状分布；而单独含有atv位点的材料与普通栽培番茄无异，果皮不积累花青素。但同时聚合aft(或abg)和atv两个位点的材料，果皮部位会积累大量的花青素，果实呈紫黑色。可见atv与aft(或abg)存在互作。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种创制高花青素番茄材料的方法。

本发明提供的创制高花青素番茄材料的方法，包括如下步骤：利用crispr/cas9系统对含有aft位点的番茄材料基因组中的花青素合成调控基因solyc07g052490进行编辑，进而使所述solyc07g052490功能丧失，得到高花青素番茄材料；

所述crispr/cas9系统中包括两个sgrna，分别命名为sgrna1和sgrna2；

所述sgrna1和所述sgrna2识别的靶序列均为所述含有aft位点的番茄材料基因组中编码solyc07g052490蛋白的dna片段或部分片段。

上述高花青素紫黑果番茄材料为花青素含量高于所述含有aft位点的番茄材料的番茄材料。

上述方法中，所述sgrna1和所述sgrna2均特异性靶向solyc07g052490基因第2外显子；

所述sgrna1识别的靶序列为序列2所示的dna分子；

所述sgrna2识别的靶序列为序列3所示的dna分子。

上述方法中，所述编辑的方法为将向所述含有aft位点的番茄材料中导入表达所述sgrna1的编码基因、所述sgrna2的编码基因和cas9蛋白的编码基因的载体。

上述方法中，所述sgrna1的编码基因为序列4第7260-7354位所示的dna分子；所述sgrna2的编码基因为序列4第7496-7590位所示的dna分子；所述cas9蛋白的编码基因为序列4第2753-6856所示的dna分子。

在本发明的具体实施例中，表达所述sgrna1的编码基因、所述sgrna2的编码基因和cas9蛋白的编码基因的载体为重组载体pagm4723::cr-solyc07g052490。所述重组载体pagm4723::cr-solyc07g052490的核苷酸序列如序列4所示，依次包括t-dna区的lb识别序列(序列4第12391-12415位)、用于启动抗性筛选基因nptii表达的nos启动子、抗性筛选基因nptii(序列4第362-1156位)、用于终止抗性筛选基因nptii表达的ocs终止子、用于启动cas9蛋白的编码基因表达的35s启动子、cas9蛋白的编码基因(序列4第2753-6856位)、用于终止cas9蛋白的编码基因表达的nos终止子，用于启动sgrna1的编码基因表达的拟南芥u6启动子(atu6)、sgrna1的编码基因、用于启动sgrna2的编码基因表达的拟南芥u6启动子(atu6)、sgrna2的编码基因、t-dna区的rb识别序列(序列4第7695-7719位)。其中，sgrna1的编码基因如序列4第7260-7354位所示，sgrna1的靶点序列为序列4第7260-7278位所示；sgrna2的编码基因如序列4第7496-7590位所示，sgrna2的靶点序列为序列4第7496-7514位所示。

所述编辑的具体步骤如下：将所述重组载体pagm4723::solyc07g052490导入农杆菌lba4404，得到重组菌；再将所述重组菌转化含有aft位点的番茄材料外植体，然后在含1mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素核苷、ph为5.8的ms固体培养基中，于25±1.5℃、光照强度100-200lx下共培养48小时；再转入含有1.0mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素、200mg/l特美汀和75mg/l卡那霉素、ph为5.8的ms固体培养基中，于25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有200mg/l特美汀和50mg/l卡那霉素、ph为5.8的ms固体培养基中，在25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至生根，即为t0代再生番茄植株。

所述方法还包括筛选solyc07g052490基因纯合突变体的步骤。由于番茄是二倍体植株，当cas9发挥作用开始剪切特定的solyc07g052490基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，solyc07g052490纯合突变体是指两条同源染色体的solyc07g052490基因发生了相同的突变的植株。所述筛选的方法具体如下：采用序列6和序列7所示的引物对t0代再生番茄植株进行pcr扩增和测序。和野生型植株相比，靶点1(sgrna1识别的靶序列)、靶点2(sgrna2识别的靶序列)或两靶点间dna片段出现核苷酸缺失或插入的t0代再生番茄植株为solyc07g052490基因被编辑的植株。电泳条带单一且较野生型植株小的t0代再生番茄植株即为solyc07g052490基因纯合突变植株。

上述高花青素番茄材料为高花青素紫黑果番茄材料。

上述方法中，所述含有aft位点的番茄材料为含有aft位点的品种，具体可以为la1996，也可为其它含有aft位点的材料。利用上述方法，本发明获得的solyc07g052490基因纯合突变体(番茄紫果材料)为4号solyc07g052490基因纯合打靶植株，其为将野生型番茄la1996的两条同源染色体的solyc07g052490基因第673-766位缺失，且保持野生型番茄la1996的基因组其他序列不变后得到的植株。该植株果实的果皮为紫黑色。

本发明的第二个目的是提供一种非转基因高花青素番茄材料的获得方法。

本发明的非转基因番茄材料的获得方法包括如下步骤：将上述方法获得的高花青素番茄材料自交，得到自交子代，选择solyc07g052490基因纯合突变(两条同源染色体的solyc07g052490基因发生了相同的突变)且不携带外源dna片段的自交子代，即为非转基因高花青素番茄材料。

所述选择的方法如下：将核苷酸大片段缺失的solyc07g052490基因编辑植株进行自交，并收获种子，再将所得种子进行播种；待长出真叶后，采用序列6和序列7所示的引物对其solyc07g052490基因片段进行pcr克隆和电泳，电泳条带单一且较野生型植株小的为solyc07g052490基因纯合突变植株；采用dcas9-f(5’-tcaactgagcaaagacacct-3’)和dcas9-r(5’-ctcgtacagcagagagtgtt-3’)引物对solyc07g052490基因纯合突变植株的cas9基因进行pcr扩增和电泳，选择不携带外源dna片段的solyc07g052490基因纯合突变植株即为solyc07g052490基因纯合突变且不携带外源dna片段的非转基因番茄高花青素紫黑果材料。

上述方法在培育高花青素紫黑果番茄杂交种或高花青素番茄杂交种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的第三个目的是提供如下(1)-(4)中任一种生物材料：

(1)上述表达sgrna1的编码基因、sgrna2的编码基因和cas9蛋白的编码基因的载体；

(2)含有上述番茄基因组编辑的载体的微生物转化体；

(3)上述靶序列；

(4)序列5所示的花青素合成调控基因solyc07g052490的突变序列。

上述生物材料中，所述含有上述番茄基因组编辑的载体的微生物转化体为含有所述重组载体pagm4723::cr-solyc07g052490的农杆菌lba4404。

上述生物材料中，所述花青素合成调控基因solyc07g052490的突变序列为序列5所示的dna分子。与野生型solyc07g052490基因相比，花青素合成调控基因solyc07g052490的突变序列为将野生型solyc07g052490基因第673-766位缺失，且保持野生型solyc07g052490基因的其他序列不变后得到的序列。

本发明的第四个目的是提供上述生物材料的新用途。

本发明提供了上述生物材料在提高含有aft位点的番茄材料花青素含量中的应用。

本发明还提供了上述生物材料在培育番茄高花青素紫黑果材料中的应用；

本发明还提供了上述生物材料在番茄育种中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种鉴定或鉴定待测番茄是否为上述高花青素番茄材料或其子代的方法。

本发明提供的鉴定或鉴定待测番茄是否为上述高花青素番茄材料或其子代的方法包括如下步骤：采用引物对1对待测番茄的基因组dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，根据所述pcr扩增产物测序结果判断待测番茄是否为上述高花青素番茄材料或其子代；

若测序结果显示缺失dna片段与序列5所示一致，则待测番茄为上述方法获得的高花青素番茄材料或其子代；

若测序结果1不满足上述条件，则待测番茄不为上述方法获得的高花青素番茄材料或其子代；

所述引物对1由引物1和引物2组成；

所述引物1为序列6所示的dna分子；

所述引物2为序列7所示的dna分子。

在本发明的具体实施例中，所述引物对1对4号solyc07g052490基因纯合打靶植株或其子代仅扩增得到一个大小为670bp的dna片段。

本发明的第六个目的是提供一种鉴定或鉴定待测番茄是否为上述高花青素番茄材料或其子代的产品。

本发明提供的鉴定或鉴定待测番茄是否为上述高花青素番茄材料或其子代的产品为如下(1)-(3)中的任一种：

(1)上述引物对1；

(2)含有(1)所述的引物对1的pcr试剂；

(3)含有(1)所述的引物对1或(2)所述的pcr试剂的试剂盒。

上述高花青素番茄材料为高花青素紫黑果番茄材料(即为solyc07g052490基因纯合突变体)。

本发明获得了用于对solyc07g052490基因进行cripsr/cas9基因编辑的两个sgrna靶点序列，并获得了含有上述两个靶点的基因编辑载体，将该载体转化aft番茄材料可对其solyc07g052490基因进行精确编辑，并可以从其自交子代中筛选出solyc07g052490基因纯合突变的非转基因高花青素紫黑果番茄材料。通过实验证明：本发明的基因编辑方法有效，可以快速将含aft位点的浅紫果番茄材料转变为高花青素紫黑果材料，具有重要的育种应用前景和经济价值。

附图说明

图1为solyc07g052490基因的结构和cripsr/cas9基因编辑sgrna靶点的位置信息。其中e1-e3为1-3号外显子。

图2为重组载体的结构示意图。

图3为t0代植株solyc07g052490基因的测序结果。其中，wt为未转化的野生型植株，1-7为t0代番茄植株。

图4为t0代打靶植株果实表型。其中1号为嵌合打靶植株，果皮黑紫色扇区solyc07g052490被打靶，4号为纯合打靶植株，植株所有细胞的solyc07g052490被打靶。

图5为t0代纯合打靶植株果皮花青素含量测定结果。其中野生型植株为la1996材料，4号和5号纯合突变植株为solyc07g052490纯合突变的la1996再生植株。

图6为t0打靶植株自交子代的solyc07g052490基因和cas9基因pcr检测。其中，-为阴性空白对照，wt为未转化的野生型植株自交后代，1-15为4号打靶植株自交子代。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第二版，j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中使用的番茄品种la1996购自美国番茄遗传资源中心(tgrc，http://tgrc.ucdavis.edu/)。

下述实施例中使用的pich86966::atu6p::sgrna_pds、picsl01009::atu6p、pich47751、pich47761、pagm4723、pich41780、pich47742::2x35s-5’utr-hcas9(stop)-nost和pich47732::nosp-nptii-ocst载体均可从addgene载体库(http://www.addgene.org/)购买。

下述实施例中使用的premixtaqdna聚合酶、primestarhsdna聚合酶、dna连接试剂盒dnaligationkitver.2.1均为大连takara公司产品；限制性内切酶为neb公司产品；pcr产物纯化试剂盒为omega公司产品；快捷型植物基因组dna提取试剂盒为北京博迈德基因技术有限公司的产品；引物为thermofisherscientific公司合成；测序由北京睿博兴科公司完成；其余试剂均为分析纯试剂。

实施例1、cripsr/cas9基因编辑载体pagm4723::cr-solyc07g052490的构建

结合r2r3-myb和r3-myb转录因子拮抗关系，推测aft(或abg)材料中的atv基因是正常，其编码有功能的r3-myb转录因子削弱aft(或abg)基因对花青素合成途径的激活，而野生种来源的atv基因是突变的，不能编码出正确的蛋白，进而丧失了对aft基因的抑制作用。因此理论上，利用基因编辑技术对aft(或abg)材料的atv基因进行敲除可以解除其对aft或abg基因的抑制作用，提高花青素合成基因的表达水平，并创制出高花青素紫黑果番茄材料。

一、获得solyc07g052490基因cripsr/cas9基因编辑靶点序列

根据sgn数据库(http://solgenomics.net/)登录的solyc07g052490基因序列(登录号为solyc07g052490.2.1，核苷酸序列为序列表中的序列1)，对solyc07g052490基因的结构进行分析。分析结果如图1所示，solyc07g052490基因有3个外显子(分别标注为e1-e3)和2个内含子构成。将外显子2的序列提交到crisprdirect在线靶点分析数据库(http://crispr.dbcls.jp/)，pam序列设定为ngg，物种数据设定为tomato(solanumlycopersicum)str.heinz1706genomesl2.50，进行cripsr/cas9靶点设计。最终选定的两个sgrna靶点如图1所示，具体序列如下：

solyc07g052490基因sgrna靶点1：5’-gagtggttgcattagagac-3’(序列2)；

solyc07g052490基因sgrna靶点2：5’-gttcagcttggttagagag-3’(序列3)。

二、构建solyc07g052490基因的cripsr/cas9基因编辑载体

1、sgrna扩增引物的设计

根据选定的靶点序列，设计构建sgrna扩增引物，具体为：solyc07g052490-g1：5’-tgtaattggagtggttgcattagagacgttttagagctagaaatagcaag-3’，框内为bsai酶切识别位点，下划线为靶点1序列。solyc07g052490-g2：5’-tgtaattggttcagcttggttagagaggttttagagctagaaatagcaag-3’，框内为bsai酶切识别位点，下划线为靶点2序列。

sgrna-r：5’-tgcaagcgtaatgccaactttgtac-3’，框内为bsai酶切识别位点。

2、cripsr/cas9基因编辑载体pagm4723::cr-solyc07g052490的构建

(1)重组质粒pich47751::solyc07g052490-sgrna1的构建

以质粒pich86966::atu6p::sgrna_pds为模板，以solyc07g052490-g1和sgrna-r所示核苷酸序列为引物，进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。pcr反应体系为：10×primestarbuffer(含mgcl2)5.0μl、2.5μmdntp8.0μl、前后引物各1.0μl、质粒模板30ng、primestarhsdna聚合酶1.0μl、加双蒸水至50μl。pcr反应条件为：98℃变性10秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒，共32个循环；扩增获得两侧带均带有bsai酶切位点的靶点1-sgrna核苷酸片段；pcr扩增产物纯化后用bsai酶切，再与经同样酶切的pich47751载体和picsl01009::atu6p载体，在dna连接试剂盒作用下连接，获得重组质粒pich47751::solyc07g052490-sgrna1。

(2)重组质粒pich47761::solyc07g052490-sgrna2的构建

以质粒pich86966::atu6p::sgrna_pds为模板，以solyc07g052490-g2和sgrna-r所示核苷酸序列为引物，进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。pcr反应体系同步骤(1)；扩增获得两侧带均带有bsai酶切位点的靶点2-sgrna核苷酸片段；pcr扩增产物纯化后用bsai酶切，再与经同样酶切的pich47761载体和picsl01009::atu6p载体，在dna连接试剂盒作用下连接，获得重组质粒pich47761::solyc07g052490-sgrna2。

(3)cripsr/cas9基因编辑载体pagm4723::cr-solyc07g052490的获得

根据文献“soyks,mullerna,parksj,schmalenbachi,jiangk,hayamar,etal.variationinthefloweringgeneselfpruning5gpromotesday-neutralityandearlyyieldintomato.naturegenetics.2017；49(1):162-168”中所述方法，利用goldengate克隆技术对pich47751::solyc07g052490-sgrna1、pich47761::solyc07g052490-sgrna2、pich47732::nosp-nptii-ocst、pich47742::2x35s-5’utr-hcas9(stop)-nost、pich41780和pagm4723进行重组，获得cripsr/cas9基因编辑重组载体pagm4723::cr-solyc07g052490，重组载体结构图如图2所示。

重组载体pagm4723::cr-solyc07g052490的核苷酸序列如序列4所示，依次包括t-dna区的lb识别序列(序列4第12391-12415位)、用于启动抗性筛选基因nptii表达的nos启动子、抗性筛选基因nptii(序列4第362-1156位)、用于终止抗性筛选基因nptii表达的ocs终止子、用于启动cas9蛋白的编码基因表达的35s启动子、cas9蛋白的编码基因(序列4第2753-6856位)、用于终止cas9蛋白的编码基因表达的nos终止子，用于启动sgrna1的编码基因表达的拟南芥u6启动子(atu6)、sgrna1的编码基因、用于启动sgrna2的编码基因表达的拟南芥u6启动子(atu6)、sgrna2的编码基因、t-dna区的rb识别序列(序列4第7695-7719位)。其中，sgrna1的编码基因如序列4第7260-7354位所示，sgrna1的靶点序列为序列4第7260-7278位所示；sgrna2的编码基因如序列4第7496-7590位所示，sgrna2的靶点序列为序列4第7496-7514位所示。

实施例2、一种通过基因编辑技术创制高花青素紫黑果番茄材料的方法

一、将基因编辑载体pagm4723::cr-solyc07g052490转化农杆菌

取1μg实施例1制备的基因编辑载体pagm4723::cr-solyc07g052490置于100μllba4404感受态细胞(北京华越洋生物，nrr01270)中，液氮中速冻3分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1mlyeb培养基(yeb培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及在培养基中的浓度为：酵母提取物5g/l，蛋白胨5g/l，牛肉浸膏5g/l，七水硫酸镁0.5g/l，蔗糖1g/l)，28℃培养2-4小时；10000×g离心30秒，弃上清，加入0.1mlyeb培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50μg/ml卡那霉素，500μg/ml链霉素和50μg/ml利福平的yeb平板上，28℃黑暗培养2-3天；挑单菌落，接种于含有50μg/ml卡那霉素，500μg/ml链霉素和50μg/ml利福平的yeb液体培养基中，28℃振荡培养过夜得，到转化子；将转化子进行菌液pcr鉴定，以dcas9-f(5’-tcaactgagcaaagacacct-3’)和dcas9-r(5’-ctcgtacagcagagagtgtt-3’)为引物，得到大小为757bp的扩增片段的即为阳性重组菌，并将该重组菌命名为pagm4723::cr-solyc07g052490/lba4404，-80℃冻存备用。

二、t0代solyc07g052490基因编辑植株的获得及鉴定

1、t0代再生植株的获得

将重组菌pagm4723::cr-solyc07g052490/lba4404转化红果含有aft位点的番茄材料la1996外植体(子叶)，然后在含1mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素核苷、ph为5.8的ms固体培养基(北京华越洋生物，m519)中，于25±1.5℃、光照强度100-200lx下共培养48小时；再转入含有1.0mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素、200mg/l特美汀和75mg/l卡那霉素、ph为5.8的ms固体培养基中，于25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有200mg/l特美汀和50mg/l卡那霉素、ph为5.8的ms固体培养基中，在25±1.5℃、光周期16h/d、光照强度800-1200lx条件下培养至生根，得到7株植株，即为t0代再生植株。

2、t0代solyc07g052490基因编辑植株的获得

采用快捷型植物基因组dna提取试剂盒分别提取上述7株t0代再生植株dna，利用序列6和序列7所示核苷酸序列为引物，对不同植株中的solyc07g052490基因进行克隆和测序。pcr反应体系为：premixtaqdna聚合酶mix10μl、前后引物各0.8μl、dna1.5μl、加双蒸水至20μl；pcr反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸25秒，共35个循环。引物序列如下：

solyc07g052490-f：5’-ttggacatctcatgctcctt-3’(序列6)；

solyc07g052490-r：5’-tgggattcttccagcaatta-3’(序列7)。

pcr产物测序结果如图3所示。由于番茄是二倍体植株，当cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，纯合突变体指的是该植株的两条同源染色体的solyc07g052490基因发生了相同的突变。从图中可以看出：7株t0代再生植株中，除3号再生植株外，其它植株均为solyc07g052490基因被编辑的植株，打靶效率(solyc07g052490基因被编辑的植株数/再生植株总数)为85.7％(6/7)。

solyc07g052490基因被编辑的植株中，1号为部分细胞solyc07g052490基因被编辑的嵌合体材料，被编辑的扇区果皮呈黑紫色(图4)。4号再生植株为solyc07g052490基因纯合打靶植株(solyc07g052490纯合突变体)，其果皮为紫黑色(图4)。2、6和7号也是solyc07g052490基因纯合打靶植株，其果皮为紫黑色。

总花青素测定结果表明solyc07g052490纯合突变体果皮花青素含量显著增加，为野生型la1996的30倍以上(图5)。

上述花青素测定方法为文献“zhang,b.,hu,z.,zhang,y.,li,y.,zhou,s.,andchen,g.(2012).aputativefunctionalmybtranscriptionfactorinducedbylowtemperatureregulatesanthocyaninbiosynthesisinpurplekale(brassicaoleraceavar.acephalaf.tricolor).plantcellrep31,281-289.”中所述。

4号再生植株中solyc07g052490基因的突变序列如序列表中的序列5所示。4号solyc07g052490基因纯合打靶植株为将野生型番茄la1996的两条同源染色体的solyc07g052490基因第673-766位缺失，且保持野生型番茄la1996的基因组其他序列不变后得到的植株。

实施例3、非转基因高花青素紫黑果番茄材料的获得

一、突变solyc07g052490基因的检测

将4号solyc07g052490基因纯合打靶植株自交，获得f1代种子；取50粒f1代种子进行播种；待长出真叶后，得到4号solyc07g052490基因纯合打靶植株的子代(f1代)。

分别以野生型番茄植株la1996和4号solyc07g052490基因纯合打靶植株的子代1号-15号的基因组dna为模板，以序列6和序列7所示核苷酸序列为引物，对其solyc07g052490基因片段进行pcr扩增和电泳。pcr反应体系为：premixtaqdna聚合酶mix10μl、前后引物各0.8μl、dna1.5μl、加双蒸水至20μl；pcr反应条件为：94℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸25秒，共35个循环。野生型番茄植株的solyc07g052490基因pcr产物为764bp，突变solyc07g052490基因pcr产物为670bp，两者可用3％的琼脂糖电泳区分。

pcr产物电泳结果如图6a所示，野生型植株的solyc07g052490基因pcr产物为764bp，4号打靶植株子代(1号-15号)的pcr产物均为670bp，较野生型植株(764bp)小，说明4号solyc07g052490基因纯合打靶植株的子代的solyc07g052490基因均为纯合突变植株(图6a)。

二、外源dna片段检测及非转基因高花青素紫黑果番茄材料的获得

以上述获得的solyc07g052490基因纯合打靶植株的子代中的纯合突变植株(1号-15号)的基因组dna为模板，以实施例2所述dcas9-f和dcas9-f为引物，对纯合突变植株的cas9基因进行pcr扩增和电泳。

结果表明：纯合突变植株(1号-15号)中4号、6号、7号、9号、11号、12号和14号子代检测结果为阴性，为不携带外源dna片段的紫黑果番茄材料(图6b)，即为目的非转基因紫黑果番茄材料。

由以上结果可知，本发明的基因编辑方法可以快速将含aft位点的浅紫果番茄材料转变为高花青素紫黑果材料，有重要的应用价值和育种前景。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所北京市农林科学院

<120>一种通过基因编辑创制紫黑果番茄材料的方法

<160>7

<210>1

<211>953bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggcagattggaatagatcaagcacatcagataatgcctcagtggtctcacctggtaat60

taacaattcttttttattttatcgcaagagcttttaattattcttttcgttcacttttat120

tgatctattttggacatctcatgctccttaccaaaaatttcttttgatataagggtccta180

cagtacatattaattgatatttgatattatgttttgaaagaagatttgagaaataaataa240

ctaatgagctaagggtaaacatgaaataaaatatttgtctttttttcatgttaaaaagta300

acgagtaaaaatgaacggatacttttatatttgcttataaatatattccttaaaggaatt360

tggagaacattatgatatgattatctgcgtctaaccatatactctaataatgccataagt420

aaacaaatatttatccttttggctacttccaaaatacatgttcatttatgaaatcatttt480

ttttaataataagttagttagtcggaatttagaatttaaaatttatgtatttttatacat540

caagttaatatattacactacttataagttcacaattaaatattcaattttgttaataat600

tttcttaatatatttataagtctaaataaaagttattgagttcacgtgaattcattatag660

attcgacccgagtggttgcattagagactaccaacgaagaaacctctaaacttgaatttt720

cagaagatgaagaaatgctcattgctaaaatgttcagcttggttagagagaggtacgttt780

aatatttttttaaaaaaattcttgaattttgtgtattaattatttaaggtttaatataaa840

attgtcatggtgtaattttaattaggtggtcattaattgctggaagaatcccaggaagaa900

atgctgatgagattgaaaaatattggaaatcaaaatactccaaaagccagtaa953

<210>2

<211>19bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gagtggttgcattagagac19

<210>3

<211>19bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gttcagcttggttagagag19

<210>4

<211>12482bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gtgccgaattcggatccggagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatg60

acgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccact120

gagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgc180

gttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctcca240

ctgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcctattt300

ttacaacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacatttacaattac360

catggttgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctatt420

cggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtc480

agcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaact540

gcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgt600

gctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggca660

ggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaat720

gcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcg780

catcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacga840

agagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccga900

cggcgaggatctcgtcgtgactcatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaa960

tggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcagga1020

catagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgctt1080

cctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttct1140

tgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgctagagtcctgctttaatgagatatg1200

cgagacgcctatgatcgcatgatatttgctttcaattctgttgtgcacgttgtaaaaaac1260

ctgagcatgtgtagctcagatccttaccgccggtttcggttcattctaatgaatatatca1320

cccgttactatcgtatttttatgaataatattctccgttcaatttactgattgtacccta1380

ctacttatatgtacaatattaaaatgaaaacaatatattgtgctgaataggtttatagcg1440

acatctatgatagagcgccacaataacaaacaattgcgttttattattacaaatccaatt1500

ttaaaaaaagcggcagaaccggtcaaacctaaaagactgattacataaatcttattcaaa1560

tttcaaaagtgccccaggggctagtatctacgacacaccgagcggcgaactaataacgct1620

cactgaagggaactccggttccccgccggcgcgcatgggtgagattccttgaagttgagt1680

attggccgtccgctctaccgaaagttacgggcaccattcaacccggtccagcacggcggc1740

cgggtaaccgacttgctgccccgagaattatgcagcatttttttggtgtatgtgggcccc1800

aaatgaagtgcaggtcaaaccttgacagtgacgacaaatcgttgggcgggtccagggcga1860

attttgcgacaacatgtcgaggctcagccgctgcaagaattcaagcttggaggtcaacat1920

ggtggagcacgacactctggtctactccaaaaatgtcaaagatacagtctcagaagatca1980

aagggctattgagacttttcaacaaaggataatttcgggaaacctcctcggattccattg2040

cccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatg2100

ccatcattgcgataaaggaaaggctatcattcaagatctctctgccgacagtggtcccaa2160

agatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagaggttccaaccacgtctac2220

aaagcaagtggattgatgtgataacatggtggagcacgacactctggtctactccaaaaa2280

tgtcaaagatacagtctcagaagatcaaagggctattgagacttttcaacaaaggataat2340

ttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagt2400

agaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcattca2460

agatctctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtgga2520

aaaagaagaggttccaaccacgtctacaaagcaagtggattgatgtgacatctccactga2580

cgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaag2640

ttcatttcatttggagaggacacgctcgagtataagagctcatttttacaacaattacca2700

acaacaacaaacaacaaacaacattacaattacatttacaattatcgatacaatggacaa2760

gaagtactccattgggctcgatatcggcacaaacagcgtcggctgggccgtcattacgga2820

cgagtacaaggtgccgagcaaaaaattcaaagttctgggcaataccgatcgccacagcat2880

aaagaagaacctcattggcgccctcctgttcgactccggggagacggccgaagccacgcg2940

gctcaaaagaacagcacggcgcagatatacccgcagaaagaatcggatctgctacctgca3000

ggagatctttagtaatgagatggctaaggtggatgactctttcttccataggctggagga3060

gtcctttttggtggaggaggataaaaagcacgagcgccacccaatctttggcaatatcgt3120

ggacgaggtggcgtaccatgaaaagtacccaaccatatatcatctgaggaagaagcttgt3180

agacagtactgataaggctgacttgcggttgatctatctcgcgctggcgcatatgatcaa3240

atttcggggacacttcctcatcgagggggacctgaacccagacaacagcgatgtcgacaa3300

actctttatccaactggttcagacttacaatcagcttttcgaagagaacccgatcaacgc3360

atccggagttgacgccaaagcaatcctgagcgctaggctgtccaaatcccggcggctcga3420

aaacctcatcgcacagctccctggggagaagaagaacggcctgtttggtaatcttatcgc3480

cctgtcactcgggctgacccccaactttaaatctaacttcgacctggccgaagatgccaa3540

gcttcaactgagcaaagacacctacgatgatgatctcgacaatctgctggcccagatcgg3600

cgaccagtacgcagacctttttttggcggcaaagaacctgtcagacgccattctgctgag3660

tgatattctgcgagtgaacacggagatcaccaaagctccgctgagcgctagtatgatcaa3720

gcgctatgatgagcaccaccaagacttgactttgctgaaggcccttgtcagacagcaact3780

gcctgagaagtacaaggaaattttcttcgatcagtctaaaaatggctacgccggatacat3840

tgacggcggagcaagccaggaggaattttacaaatttattaagcccatcttggaaaaaat3900

ggacggcaccgaggagctgctggtaaagcttaacagagaagatctgttgcgcaaacagcg3960

cactttcgacaatggaagcatcccccaccagattcacctgggcgaactgcacgctatcct4020

caggcggcaagaggatttctacccctttttgaaagataacagggaaaagattgagaaaat4080

cctcacatttcggataccctactatgtaggccccctcgcccggggaaattccagattcgc4140

gtggatgactcgcaaatcagaagagactatcactccctggaacttcgaggaagtcgtgga4200

taagggggcctctgcccagtccttcatcgaaaggatgactaactttgataaaaatctgcc4260

taacgaaaaggtgcttcctaaacactctctgctgtacgagtacttcacagtttataacga4320

gctcaccaaggtcaaatacgtcacagaagggatgagaaagccagcattcctgtctggaga4380

gcagaagaaagctatcgtggacctcctcttcaagacgaaccggaaagttaccgtgaaaca4440

gctcaaagaagattatttcaaaaagattgaatgtttcgactctgttgaaatcagcggagt4500

ggaggatcgcttcaacgcatccctgggaacgtatcacgatctcctgaaaatcattaaaga4560

caaggacttcctggacaatgaggagaacgaggacattcttgaggacattgtcctcaccct4620

tacgttgtttgaagatagggagatgattgaagaacgcttgaaaacttacgctcatctctt4680

cgacgacaaagtcatgaaacagctcaagaggcgccgatatacaggatgggggcggctgtc4740

aagaaaactgatcaatgggatccgagacaagcagagtggaaagacaatcctggattttct4800

taagtccgatggatttgccaaccggaacttcatgcagttgatccatgatgactctctcac4860

ctttaaggaggacatccagaaagcacaagtttctggccagggggacagtctccacgagca4920

catcgctaatcttgcaggtagcccagctatcaaaaagggaatactgcagaccgttaaggt4980

cgtggatgaactcgtcaaagtaatgggaaggcataagcccgagaatatcgttatcgagat5040

ggcccgagagaaccaaactacccagaagggacagaagaacagtagggaaaggatgaagag5100

gattgaagagggtataaaagaactggggtcccaaatccttaaggaacacccagttgaaaa5160

cacccagcttcagaatgagaagctctacctgtactacctgcagaacggcagggacatgta5220

cgtggatcaggaactggacatcaatcggctctccgactacgacgtggatcatatcgtgcc5280

ccagtcttttctcaaagatgattctattgataataaagtgttgacaagatccgataaaaa5340

tagagggaagagtgataacgtcccctcagaagaagttgtcaagaaaatgaaaaattattg5400

gcggcagctgctgaacgccaaactgatcacacaacggaagttcgataatctgactaaggc5460

tgaacgaggtggcctgtctgagttggataaagccggcttcatcaaaaggcagcttgttga5520

gacacgccagatcaccaagcacgtggcccaaattctcgattcacgcatgaacaccaagta5580

cgatgaaaatgacaaactgattcgagaggtgaaagttattactctgaagtctaagctggt5640

ttcagatttcagaaaggactttcagttttataaggtgagagagatcaacaattaccacca5700

tgcgcatgatgcctacctgaatgcagtggtaggcactgcacttatcaaaaaatatcccaa5760

gcttgaatctgaatttgtttacggagactataaagtgtacgatgttaggaaaatgatcgc5820

aaagtctgagcaggaaataggcaaggccaccgctaagtacttcttttacagcaatattat5880

gaattttttcaagaccgagattacactggccaatggagagattcggaagcgaccacttat5940

cgaaacaaacggagaaacaggagaaatcgtgtgggacaagggtagggatttcgcgacagt6000

ccggaaggtcctgtccatgccgcaggtgaacatcgttaaaaagaccgaagtacagaccgg6060

aggcttctccaaggaaagtatcctcccgaaaaggaacagcgacaagctgatcgcacgcaa6120

aaaagattgggaccccaagaaatacggcggattcgattctcctacagtcgcttacagtgt6180

actggttgtggccaaagtggagaaagggaagtctaaaaaactcaaaagcgtcaaggaact6240

gctgggcatcacaatcatggagcgatcaagcttcgaaaaaaaccccatcgactttctcga6300

ggcgaaaggatataaagaggtcaaaaaagacctcatcattaagcttcccaagtactctct6360

ctttgagcttgaaaacggccggaaacgaatgctcgctagtgcgggcgagctgcagaaagg6420

taacgagctggcactgccctctaaatacgttaatttcttgtatctggccagccactatga6480

aaagctcaaaggatctcccgaagataatgagcagaagcagctgttcgtggaacaacacaa6540

acactaccttgatgagatcatcgagcaaataagcgaattctccaaaagagtgatcctcgc6600

cgacgctaacctcgataaggtgctttctgcttacaataagcacagggataagcccatcag6660

ggagcaggcagaaaacattatccacttgtttactctgaccaacttgggcgcgcctgcagc6720

cttcaagtacttcgacaccaccatagacagaaagcggtacacctctacaaaggaggtcct6780

ggacgccacactgattcatcagtcaattacggggctctatgaaacaagaatcgacctctc6840

tcagctcggtggagacagcagggctgaccccaagaagaagaggaaggtgtgagcttgtca6900

agcagatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtct6960

tgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgta7020

atgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacattta7080

atacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtc7140

atctatgttactagatcgacgctactagaattcgagctcggagtgatcaaaagtcccaca7200

tcgatcaggtgatatatagcagcttagtttatataatgatagagtcgacatagcgattgg7260

agtggttgcattagagacgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccg7320

ttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttctagacccagctttcttgt7380

acaaagttggcattacgctttacgaattcccatggggagtgatcaaaagtcccacatcga7440

tcaggtgatatatagcagcttagtttatataatgatagagtcgacatagcgattggttca7500

gcttggttagagaggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttat7560

caacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttctagacccagctttcttgtacaa7620

agttggcattacgctcagagaggatgcacatgtgaccgagggacacgaagtgatccgttt7680

aaactatcagtgtttgacaggatatattggcgggtaaacctaagagaaaagagcgtttat7740

tagaataatcggatatttaaaagggcgtgaaaaggtttatccgttcgtccatttgtatgt7800

gccagccgtgcggctgcatgaaatcctggccggtttgtctgatgccaagctggcggcctg7860

gccggccagcttggccgctgaagaaaccgagcgccgccgtctaaaaaggtgatgtgtatt7920

tgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctgcgtatatgatgcgatgagtaaataaaca7980

aatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgctgtacttaaccagaaaggcgggtcaggc8040

aagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgccctgcaactcgccggggccgatgttctg8100

ttagtcgattccgatccccagggcagtgcccgcgattgggcggccgtgcgggaagatcaa8160

ccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgacgattgaccgcgacgtgaaggccatcggc8220

cggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgccccaggcggcggacttggctgtgtccgcg8280

atcaaggcagccgacttcgtgctgattccggtgcagccaagcccttacgacatatgggcc8340

accgccgacctggtggagctggttaagcagcgcattgaggtcacggatggaaggctacaa8400

gcggcctttgtcgtgtcgcgggcgatcaaaggcacgcgcatcggcggtgaggttgccgag8460

gcgctggccgggtacgagctgcccattcttgagtcccgtatcacgcagcgcgtgagctac8520

ccaggcactgccgccgccggcacaaccgttcttgaatcagaacccgagggcgacgctgcc8580

cgcgaggtccaggcgctggccgctgaaattaaatcaaaactcatttgagttaatgaggta8640

aagagaaaatgagcaaaagcacaaacacgctaagtgccggccgtccgagcgcacgcagca8700

gcaaggctgcaacgttggccagcctggcagacacgccagccatgaagcgggtcaactttc8760

agttgccggcggaggatcacaccaagctgaagatgtacgcggtacgccaaggcaagacca8820

ttaccgagctgctatctgaatacatcgcgcagctaccagagtaaatgagcaaatgaataa8880

atgagtagatgaattttagcggctaaaggaggcggcatggaaaatcaagaacaaccaggc8940

accgacgccgtggaatgccccatgtgtggaggaacgggcggttggccaggcgtaagcggc9000

tgggttgtctgccggccctgcaatggcactggaacccccaagcccgaggaatcggcgtga9060

cggtcgcaaaccatccggcccggtacaaatcggcgcggcgctgggtgatgacctggtgga9120

gaagttgaaggccgcgcaggccgcccagcggcaacgcatcgaggcagaagcacgccccgg9180

tgaatcgtggcaagcggccgctgatcgaatccgcaaagaatcccggcaaccgccggcagc9240

cggtgcgccgtcgattaggaagccgcccaagggcgacgagcaaccagattttttcgttcc9300

gatgctctatgacgtgggcacccgcgatagtcgcagcatcatggacgtggccgttttccg9360

tctgtcgaagcgtgaccgacgagctggcgaggtgatccgctacgagcttccagacgggca9420

cgtagaggtttccgcagggccggccggcatggccagtgtgtgggattacgacctggtact9480

gatggcggtttcccatctaaccgaatccatgaaccgataccgggaagggaagggagacaa9540

gcccggccgcgtgttccgtccacacgttgcggacgtactcaagttctgccggcgagccga9600

tggcggaaagcagaaagacgacctggtagaaacctgcattcggttaaacaccacgcacgt9660

tgccatgcagcgtacgaagaaggccaagaacggccgcctggtgacggtatccgagggtga9720

agccttgattagccgctacaagatcgtaaagagcgaaaccgggcggccggagtacatcga9780

gatcgagctagctgattggatgtaccgcgagatcacagaaggcaagaacccggacgtgct9840

gacggttcaccccgattactttttgatcgatcccggcatcggccgttttctctaccgcct9900

ggcacgccgcgccgcaggcaaggcagaagccagatggttgttcaagacgatctacgaacg9960

cagtggcagcgccggagagttcaagaagttctgtttcaccgtgcgcaagctgatcgggtc10020

aaatgacctgccggagtacgatttgaaggaggaggcggggcaggctggcccgatcctagt10080

catgcgctaccgcaacctgatcgagggcgaagcatccgccggttcctaatgtacggagca10140

gatgctagggcaaattgccctagcaggggaaaaaggtcgaaaaagcttctttcctgtgga10200

tagcacgtacattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggaacccgtacattgggaa10260

cccaaagccgtacattgggaaccggtcacacatgtaagtgactgatataaaagagaaaaa10320

aggcgatttttccgcctaaaactctttaaaacttattaaaactcttaaaacccgcctggc10380

ctgtgcataactgtctggccagcgcacagccgaacagctgcaaaaagcgcctacccttcg10440

gtcgctgcgctccctacgccccgccgcttcgcgtcggcctatcgcggccgctggccgctc10500

aaaaatggctggcctacggccaggcaatctaccagggcgcggacaagccgcgccgtcgcc10560

actcgaccgccggcgcccacatcaaggctccgagtgcgcggaacccctatttgtttattt10620

ttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaa10680

taatattgaaaaaggaagagtatggctaaaatgagaatatcaccggaattgaaaaaactg10740

atcgaaaaataccgctgcgtaaaagatacggaaggaatgtctcctgctaaggtatataag10800

ctggtgggagaaaatgaaaacctatatttaaaaatgacggacagccggtataaagggacc10860

acctatgatgtggaacgggaaaaggacatgatgctatggctggaaggaaagctgcctgtt10920

ccaaaggtcctgcactttgaacggcatgatggctggagcaatctgctcatgagtgaggcc10980

gatggcgtcctttgctcggaagagtatgaagatgaacaaagccctgaaaagattatcgag11040

ctgtatgcggagtgcatcaggctctttcactccatcgacatatcggattgtccctatacg11100

aatagcttagacagccgcttagccgaattggattacttactgaataacgatctggccgat11160

gtggattgcgaaaactgggaagaggacactccatttaaagatccgcgcgagctgtatgat11220

tttttaaagacggaaaagcccgaagaggaacttgtcttttcccacggcgacctgggagac11280

agcaacatctttgtgaaagatggcaaagtaagtggctttattgatcttgggagaagcggc11340

agggcggacaagtggtatgacattgccttctgcgtccggtcgctcagggaggatatcggg11400

gaagaacagtatgtcgagctattttttgacttactggggatcaagcctgattgggagaaa11460

ataaaatattatattttactggatgaattgttttagctgtcagaccaagtttactcatat11520

atactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctt11580

tttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagac11640

cccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgc11700

ttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacca11760

actctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttcta11820

gtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgct11880

ctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttg11940

gactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgc12000

acacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcta12060

tgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagg12120

gtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagt12180

cctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcagggggg12240

cggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctgctcggatctgtt12300

ggaccggacagtagtcatggttgatgggctgcctgtatcgagtggtgattttgtgccgag12360

ctgccggtcggggagctgttggctggctggtggcaggatatattgtggtgtaaacaaatt12420

gacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactggggttgaacact12480

ct12482

<210>5

<211>859bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5