本发明属于疾病检测技术领域。更具体地，涉及一套同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病相关基因的引物组及检测方法。
背景技术：
地中海贫血(简称“地贫”)是全球最常见、对人类健康影响最大的单基因遗传病，也是世界卫生组织(who)推荐进行重点预防的遗传病。临床上，以α-地贫和β-地贫最多见，其发病相关基因分别为hba2和hbb。耳聋是影响人类健康和致残的常见病，也是最常见的遗传性疾病，据统计，新生儿中耳聋的发病率为1‰，影响它的基因主要有gjb2、gjb3和slc26a4等；耳聋基因诊断结果对耳聋的预防、辅助诊断、康复治疗有很好的指导意义。
苯丙酮尿症是由于肝脏苯丙氨酸羟化酶缺乏所致的一种严重的遗传性氨基酸代谢障碍性疾病，由苯丙氨酸羟化酶基因突变导致肝脏苯丙氨酸羟化酶缺乏所致的苯丙酮尿症占97％～99％；未经治疗的患者，会出现脑组织损伤和不可逆的智力发育障碍，重症患儿可于3岁内死亡；发病率为1/16500，携带者率为1/50～1/60；苯丙酮尿症是可治性的遗传病之一，早期基因诊断可以尽早发现患者，应用饮食疗法可以减轻或者控制患者症状；因此及早准确地诊断pku有十分重要的意义。
肝豆状核变性病是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍疾病，基因突变可引起铜蓝蛋白合成障碍、胆汁中铜排泄受阻，过量的铜不能排出体外而在体内沉积，导致肝硬化、神经症状、角膜环、尿铜升高等临床表现。在我国患病率约为1/10万，人群杂合子携带率为1/4000，目前已明确主要与atp7b基因突变密切相关。是通过早期诊断可以治疗的遗传代谢病之一。目前治疗的药物主要是应用铜离子螯合剂青霉胺和离子交换剂硫酸锌，其预后与诊断治疗早晚关系密切，如能早期诊治，尤其是在症状前期开始治疗，则绝大多数预后良好；若治疗较晚，肝、脑及肾等重要器官已发生了不可逆性损害，最多只能获得部分症状的改善，其预后不佳。因此，症状前和早期诊断非常重要，而在症状前的生化检测指标仅依靠血清铜蓝蛋白是不够的，如能发现atp7b基因突变类型，就能及早采取减少铜摄入和促进铜排出的治疗，保证机体器官的正常功能。
综上所述，地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病是几种常见的遗传病，在人群中发病率高，危害大。进行基因检测能够在医学上实现尽早干预，达到及早发现，及早治疗的效果。
技术实现要素：
本发明提供了一种可以同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病四种遗传病相关基因的方法，应用多重pcr扩增技术结合高通量测序技术，通过文库构建、上机测序、分析测序数据，可以准确快速地同时检测出地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病多个致病基因的突变型别，可以同时检测四种遗传疾病的常见的致病突变位点，实现四种疾病的同时检测。
本发明的目的是提供一套可以同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病相关基因的引物组。
本发明另一目的是提供一种可以同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病相关基因的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一套可以同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病相关基因突变的引物组，包括引物池1、引物池2和引物池3；引物池1包括9对引物，上下游引物序列依次如seqidno.1～4、seqidno.13～20、seqidno.35～36、seqidno.47～50所示；引物池2包括10对引物，上下游引物序列依次如seqidno.5～10、seqidno.21～26、seqidno.37～42、、seqidno.51～52所示；引物池3包括8对引物，上下游引物序列依次如seqidno.11～12、seqidno.27～34、seqidno.43～46、seqidno.53～54所示。
在上述引物组中，seqidno.1～12是特异性扩增检测地贫基因hba2和hbb的致病突变位点的引物序列；seqidno.13～34是特异性扩增检测耳聋基因gjb2、gjb3和slc26a4的致病突变位点的引物序列；seqidno.35～46是特异性扩增检测苯丙酮尿症基因pah的致病突变位点的引物序列；seqidno.47～54是特异性扩增检测肝豆状核变性病基因atp7b的致病突变位点的引物序列。
该引物组能够快速、高效的同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病四种遗传病常见的致病突变位点。因此，所述引物组在同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病相关基因突变位点方面的应用，以及在制备同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病相关基因突变位点的试剂盒方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。
一种可以同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病相关基因突变的方法，包括如下步骤：
s1.以外周全血基因组dna为模板，分别用权利要求1所述三个引物池进行多重pcr扩增，同时扩增得到地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病相关基因的多个扩增子(amplicon)；
s2.将三个引物池扩增所得扩增子合在一起，并进行文库构建；
s3.基于构建的文库，应用高通量测序法进行测序，并应用生物信息系统对测序结果进行数据分析，获得地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病的致病基因的各个位点突变情况，从而判断样本是否携带地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病基因突变。
具体优选地，所述同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病相关基因突变的方法，包括如下步骤：
(1)待测样本dna：提取外周全血基因组dna；
(2)靶序列的扩增：以待测样本dna为模板，分别利用权利要求1所述三个引物池进行多重pcr反应；
(3)消化引物序列：将步骤(2)中三个引物池扩增产物合在一起，然后与引物消化液混合反应；
(4)接头连接：将步骤(3)的产物与连接缓冲液、p1接头、barcodex、无核酸酶水和dna连接酶混合后进行连接反应，得到接头dna片段；然后用ampurexp磁珠进行纯化，得到吸附着dna片段的磁珠；
其中，p1接头、barcodex(文库构建的特异性接头)如实施例2中所示；
(5)文库扩增：利用文库引物混合液和文库扩增反应液进行文库扩增，最后用ampurexp对扩增的产物进行纯化，得到文库；
(6)高通量测序：利用半导体法对文库进行测序；
(7)数据分析：利用人类基因组数据库(ncbi)、dbsnp信息对检测的位点进行注释，确定位点的碱基变化、在染色体上的位置、rs号，测序完成后运行插件，每个样本生成一个包含所有检测位点信息的excel表；当突变频率为0则为野生型，突变频率在50％左右为杂合突变型，突变频率在100％左右为纯合突变型。
其中，优选地，步骤(2)靶序列的扩增的反应体系如实施例中表5所示。
优选地，步骤(2)靶序列的扩增的反应条件如实施例中表6所示。
优选地，步骤(3)所述引物消化液为引物清除试剂fupareagent。
优选地，步骤(3)中，与引物消化液混合反应的反应条件如实施例中表7所示。
优选地，步骤(4)接头连接的反应体系如实施例中表9和表10所示。
优选地，步骤(4)接头连接的反应条件如实施例中表11所示。
优选地，步骤(5)所述文库引物混合液为文库扩增引物a和引物p的混合液，具体引物序列如下：
引物a：5’-ccatctcatccctgcgtgtc-3’
引物p：5’-ccactacgcctccgctttcctctctatg-3’。
优选地，步骤(5)所述文库扩增反应液为文库扩增酶platiumtmpcrsupermixhighfidelity。
优选地，步骤(5)所述文库扩增反应体系如实施例中表12所示。
优选地，步骤(5)所述文库扩增反应条件如实施例中表13所示。
另外，一种包含有包含本发明所述引物组的同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病相关基因突变的试剂盒，也应在本发明的保护范围之内。
具体优选地，所述试剂盒还包含pcr反应液、dna连接酶、引物消化液、连接缓冲液、p1接头、文库扩增反应液、文库引物混合液、ampurexp磁珠和/或无核酸酶水。
本发明具有以下有益效果：
本发明设计的引物组分为三个引物池，应用多重pcr扩增技术结合高通量测序技术，建立了一种可以同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病四种遗传病常见的致病突变位点。所述多重pcr是指在同一管扩增体系里加入多对引物同时对一样本进行扩增，可一管等效率扩增多个扩增子(amplicon)，方法高效、快速、准确、重复性好。
附图说明
图1为本发明制备的文库的片段分布图；片段大小集中在200-350bp之间；样本类型为人类外周全血基因组dna。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1引物组的设计
1、确定检测的地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病四种遗传病的相关基因的检测范围；针对这些遗传病的相关致病基因的每一个突变位点，设计引物，避免形成引物二聚体和高gc含量的引物，最终选择退火温度均为60℃的引物。对所有设计的引物在ncbi数据库上进行blast比对，引物之间不应存在互补序列且应该具有较高的特异性。将在人类基因组hg19参考序列位置邻近的引物对分配到不同的引物池中避免overlap的产生，将位置较远的、gc含量相似的引物对分配到同一引物池中。最终优化出本发明的引物组，包括三个引物池：引物池ⅰ，引物池ⅱ和引物池ⅲ，用这三个引物池对基因组dna进行扩增分析。
2、具体地，本发明针对四种疾病相关基因可以检测到的致病位点共有58个，引物组及其序列信息如下：
(1)本发明针对地贫相关基因hba2和hbb可以检测到的致病位点有28个：hba2:369c>g、hba2:377t>c、hba2:427t>c、hbb:126_129delcttt、hbb:130g>t、hbb:123_124inst、hbb:-82c>a、hbb:-80t>c、hbb:-79a>g、hbb:-78a>g、hbb:-78a>c、hbb:216_217inst、hbb:216_217insa、hbb:52a>t、hbb:316-197c>t、hbb:79g>a、hbb:45_46insg、hbb:84_85insc、hbb:94delc、hbb:113g>a、hbb:-50a>c、hbb:-11_-8delaaac、hbb:2t>g、hbb:92+1g>t、hbb:92+5g>c、hbb:315+5g>c、hbb:25_26delaa、hbb:27_28insg(具体如表1所示)。
表1针对地贫基因突变设计的引物
(2)本发明针对耳聋相关基因gjb2、gjb3和slc26a4可以检测到的致病位点有18个：gjb2:35delg、gjb2:176_179del16、gjb2:235delc、gjb2:299_300delat、gjb2:167delt、gjb3:538c>t、gjb3:547g>a、slc26a4:ivs7-2a>g、slc26a4:2168a>g、slc26a4:1229c>t、slc26a4:281c>t、slc26a4:589g>a、slc26a4:1174a>t、slc26a4:1226g>a、slc26a4:ivs15+5g>a、slc26a4:1975g>c、slc26a4:2027t>a、slc26a4:2162c>t(具体如表2所示)。
表2针对耳聋基因突变设计的引物
(3)本发明针对苯丙酮尿症相关基因pah可以检测到的致病位点有6个：pah:842+2t>a、pah:728g>a、pah:611a>g、pah:1068c>a、pah:1238g>c、pah:442-1g>a(具体如表3所示)。
表3针对苯丙酮尿症基因突变设计的引物
(4)本发明针对肝豆状核变性病相关基因atp7b可以检测到的致病位点有6个：atp7b:2333g>t、atp7b:2333g>a、atp7b:2975c>t、atp7b:2804c>t、atp7b:3443t>c、atp7b:2755c>g(如表4所示)。
表4针对肝豆状核变性病基因突变设计的引物
实施例2地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病相关基因的检测方法
以实施例1设计的引物组，以样本外周全血基因组dna为模板，结合多重pcr方法进行文库构建，应用高通量测序法对文库进行测序，并分析测序数据，从而检测分析基因突变情况。
1、该方法所用到的试剂：dneasyblood&tissuekit、qubitdsdnahsassaykit、ionampliseqlibrarykit2.0、ionxpressbarcodeadapters1-16、无水乙醇、ampurexpbeads、ionpihi-qsequencing200kit、ionpihi-qot2200kit、dynabeadsmyonestreptavidinc1、ionpichipkitv2、异丙醇、氢氧化钠等。
2、检测方法
(1)检测模板为外周全血的dna；
(2)靶序列的扩增
每个样本分别用引物池ⅰ，引物池ⅱ，引物池ⅲ进行三个反应，均按照表5在pcr管中配制反应体系。配制好的体系置于pcr仪上按表6的反应条件进行反应。
表5反应体系
表6反应条件
(3)引物的消化
扩增结束后取出pcr管，静置到室温后低速离心3～5秒，使管壁和盖子上无明显液滴，将同一样本的三个引物池pcr反应管混合为一管，体积为30μl。向pcr管中加入3μlfupareagent，涡旋震荡混匀并低速离心3～5秒，置于pcr仪上，按表7所示反应条件进行反应。
表7反应条件
(4)接头连接
接头为：p1接头(p1adapter)和barcodex(特异性接头)。
所述p1接头的序列如下：
5'—ccactacgcctccgctttcctctctatgggcagtcggtgat–3'3'—ttggtgatgcggaggcgaaaggagagatacccgtcagccacta-5'。
所述barcodex是文库构建的特异性接头，用于区分不同样本；具体地，特异性接头的序列如下表8所示：
表8特异性接头序列(每次扩增体系任选其一使用)
接头按表9所示体系进行稀释后，再配制成表10所示连接反应体系，配制好的体系置于pcr仪上按照表11所示反应条件进行反应。
表9稀释的接头混合液(总共2μl)
表10连接反应体系：
表11反应条件：
(5)连接产物的纯化
向连接产物中加入66μlampurexp磁珠进行纯化，得到晾干了的吸附着dna的磁珠。
(6)文库的扩增
按照表12配制扩增反应体系，加进步骤(5)晾干的磁珠中，并转移到pcr管，pcr管置于pcr仪上按照表13所示反应条件进行反应。
表12扩增反应体系
其中，所述文库引物混合液为文库扩增引物a和引物p1的混合液，具体引物序列如下：
引物a：5’-ccatctcatccctgcgtgtc-3’
引物p1：5’-ccactacgcctccgctttcctctctatg-3’。
步骤(5)所述文库扩增反应液为文库扩增酶platiumtmpcrsupermixhighfidelity。
表13反应条件：
(7)文库的纯化
向步骤(6)反应后的pcr管中加入45.5μl的ampurexp磁珠，吹打混匀，转移到新的1.5ml的ep管中，室温放置5分钟；把ep管放到磁力架上，待溶液澄清，把上清液转移到新的ep管中，弃去磁力架上的ep管；在ep管中加入71.5μl的ampurexp磁珠进行纯化，最后得到22μl的文库。
(8)高通量测序
使用测序反应通用试剂盒(半导体法)(广州市达瑞生物技术股份有限公司，备案号：粤穗械备20160061号)对文库进行测序。
(9)数据分析
突变类型分析：利用人类基因组数据库(ncbi)、dbsnp信息对检测的位点进行注释，确定位点的碱基变化、在染色体上的位置、rs号，测序完成后运行插件，每个样本生成一个包含所有检测位点信息的excel表。当突变频率为0则为野生型，突变频率在50％左右为杂合突变型，突变频率在100％左右为纯合突变型。
实施例3检测方法在野生型人类基因组中的应用
1、标本的采集、运送和保存：
(1)标本采集：标本为人类的外周全血，以上58个位点经临床一代测序检测，结果均为野生型。血液为常规取静脉血2ml，edta抗凝处理。
(2)保存：可立即检测，-20±5℃保存2年。
(3)运输：4℃条件下保存运送。
2、人类基因组dna的提取
dna提取使用dneasyblood&tissuekit提取试剂盒。具体步骤如下：在1.5mlep管中分别加入20μlproteinasek、200μl全血样本和20μlalbuffer，混匀后56℃孵育10分钟；加入200μl无水乙醇，混匀后全部液体转移到离心柱中，8000rpm离心1分钟，弃去液体；加入500μlaw1buffer，8000rpm离心1分钟，弃去液体；加入500μlaw2buffer，14000rpm离心3分钟，弃去液体；空柱14000rpm离心1分钟；加入200μlaebuffer室温平衡1分钟，8000rpm离心1分钟得到提取好的基因组dna。
3、利用实施例2所述的检测方法进行检测
以样本类型为人类外周全血基因组dna所制备的文库的片段分布图如图1所示；片段大小集中在200-350bp之间。
(1)地贫相关基因突变的检测
样本为选取的地贫各种突变型别病例，本发明所述的58个位点经临床一代测序检测，结果如表14中“临床检测型别”栏中所示。
应用实施例2的方法对样本进行检测。检测结果如表14所示，与临床检测结果一致。
表14地贫相关基因突变检测结果
(2)耳聋相关基因突变的检测
样本为选取的耳聋各种突变型别病例，本发明所述的58个位点经临床一代测序检测，结果如下表中“临床检测型别”栏中所示。
应用实施例2的方法对样本进行检测。检测结果如表15所示，与临床检测结果一致。
表15耳聋相关基因突变检测结果
(3)苯丙酮尿症相关基因突变的检测
样本为选取的苯丙酮尿症的各种突变型别病例，本发明所述的58个位点经临床一代测序检测，结果如下表中“临床检测型别”栏中所示。
应用实施例2的方法对样本进行检测。检测结果如表16所示，与临床检测结果一致。
表16苯丙酮尿症相关基因突变检测结果
(4)肝豆状核变性病相关基因突变的检测
样本为选取的肝豆状核变性病的各种突变型别病例，本发明所述58个位点经临床一代测序检测，结果如下表中“临床检测型别”栏中所示。
应用实施例2的方法对样本进行检测。检测结果如表17所示，与临床检测结果一致。
表17肝豆状核变性病相关基因突变检测结果
实施例4检测方法的重复性
选取临床检测为地贫hbb:126_129delcttt杂合突变、耳聋gjb2:235delc杂合突变、苯丙酮尿症pah:728g>a杂合突变和肝豆状核变性病atp7b:2333g>t杂合突变样本各1例，本发明所述的58个位点经临床一代测序检测，结果如表18中“临床检测型别”栏中所示。应用实施例2的方法对这4例样本进行十次重复检测。检测结果如表18所示，与临床检测结果一致。
结果显示，hbb:126_129delcttt杂合、gjb2:235delc杂合、pah:728g>a杂合和atp7b:2333g>t杂合突变4个突变型别检测十次的突变频率的cv值分别为4.9％、3.1％、4.5％、4.4％，cv值都在5％以内，说明此方法的重复性好。
表18检测方法的重复性结果
序列表
<110>广州市达瑞生物技术股份有限公司
<120>一套同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病的引物组及方法
<160>54
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>引物对1上游引物(primer1forwardprimer)
<400>1
cccggtcaacttcaaggtga20
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>引物对1下游引物(primer1reverseprimer)
<400>2
tcacagaagccaggaacttgtc22
<210>3
<211>24
<212>dna
<213>引物对2上游引物(primer2forwardprimer)
<400>3
tgaggttgctagtgaacacagttg24
<210>4
<211>26
<212>dna
<213>引物对2下游引物(primer2reverseprimer)
<400>4
gggccaagagatatatcttagaggga26
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>引物对3上游引物(primer3forwardprimer)
<400>5
cctggacaagttcctggcttc21
<210>6
<211>22
<212>dna
<213>引物对3下游引物(primer3reverseprimer)
<400>6
acacctccattgttggcacatt22
<210>7
<211>23
<212>dna
<213>引物对4上游引物(primer4forwardprimer)
<400>7
ggagctgtgggaggaagataaga23
<210>8
<211>24
<212>dna
<213>引物对4下游引物(primer4reverseprimer)
<400>8
atcatgcctctttgcaccattcta24
<210>9
<211>22
<212>dna
<213>引物对5上游引物(primer5forwardprimer)
<400>9
gcagcctaagggtgggaaaata22
<210>10
<211>25
<212>dna
<213>引物对5下游引物(primer5reverseprimer)
<400>10
ggcagagccatctattgcttacatt25
<210>11
<211>26
<212>dna
<213>引物对6上游引物(primer6forwardprimer)
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ctgtttcccattctaaactgtaccct26
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<211>22
<212>dna
<213>引物对6下游引物(primer6reverseprimer)
<400>12
ggcactgactctctctgcctat22
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<211>22
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<213>引物对7上游引物(primer7forwardprimer)
<400>13
ttcgaagatgacccggaagaag22
<210>14
<211>20
<212>dna
<213>引物对7下游引物(primer7reverseprimer)
<400>14
cctgcagctgatcttcgtgt20
<210>15
<211>27
<212>dna
<213>引物对8上游引物(primer8forwardprimer)
<400>15
tgaggatattgaagatctggaggaact27
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<211>29
<212>dna
<213>引物对8下游引物(primer8reverseprimer)
<400>16
gccaaagctccaaatgtataattcagaaa29
<210>17
<211>23
<212>dna
<213>引物对9上游引物(primer9forwardprimer)
<400>17
gtcgtctgtatggcagttaagga23
<210>18
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<212>dna
<213>引物对9下游引物(primer9reverseprimer)
<400>18
ttttccaggttggctccatatgaaa25
<210>19
<211>29
<212>dna
<213>引物对10上游引物(primer10forwardprimer)
<400>19
agattttccagtcctattttctatggcaa29
<210>20
<211>28
<212>dna
<213>引物对10下游引物(primer10reverseprimer)
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ctcttccttctatgaactctcaactgtc28
<210>21
<211>24
<212>dna
<213>引物对11上游引物(primer11forwardprimer)
<400>21
tcttcttctcatgtctccggtagg24
<210>22
<211>27
<212>dna
<213>引物对11下游引物(primer11reverseprimer)
<400>22
catttttcgcattatgatcctcgttgt27
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<211>24
<212>dna
<213>引物对12上游引物(primer12forwardprimer)
<400>23
cttcctgaaatactcagcgaaggt24
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<211>28
<212>dna
<213>引物对12下游引物(primer12reverseprimer)
<400>24
ctgagatggatatcataaggctgttgtt28
<210>25
<211>22
<212>dna
<213>引物对13上游引物(primer13forwardprimer)
<400>25
gctagagtcctgattgccagtg22
<210>26
<211>28
<212>dna
<213>引物对13下游引物(primer13reverseprimer)
<400>26
cttgcttactattttagcacctgaccta28
<210>27
<211>21
<212>dna
<213>引物对14上游引物(primer14forwardprimer)
<400>27
catctccccacacctcctttg21
<210>28
<211>22
<212>dna
<213>引物对14下游引物(primer14reverseprimer)
<400>28
agaagtctccctgttctgtcct22
<210>29
<211>24
<212>dna
<213>引物对15上游引物(primer15forwardprimer)
<400>29
agcctcatcttcaagctcatcatt24
<210>30
<211>21
<212>dna
<213>引物对15下游引物(primer15reverseprimer)
<400>30
gtagcagagctcacagatggt21
<210>31
<211>27
<212>dna
<213>引物对16上游引物(primer16forwardprimer)
<400>31
gacgacaacattagaaaggacacattc27
<210>32
<211>28
<212>dna
<213>引物对16下游引物(primer16reverseprimer)
<400>32
agactagacttgtgtaatgtttgccatt28
<210>33
<211>25
<212>dna
<213>引物对17上游引物(primer17forwardprimer)
<400>33
caaattggttgtgactgagattgga25
<210>34
<211>24
<212>dna
<213>引物对17下游引物(primer17reverseprimer)
<400>34
ccagaactctcaatctgccaacat24
<210>35
<211>20
<212>dna
<213>引物对18上游引物(primer18forwardprimer)
<400>35
cagagctagtggctcacctt20
<210>36
<211>28
<212>dna
<213>引物对18下游引物(primer18reverseprimer)
<400>36
gggaatactgatcctgatttaacagtga28
<210>37
<211>22
<212>dna
<213>引物对19上游引物(primer19forwardprimer)
<400>37
cacagaaggcaggactcttcat22
<210>38
<211>26
<212>dna
<213>引物对19下游引物(primer19reverseprimer)
<400>38
gccttgaaaaatcaggtgtctctttt26
<210>39
<211>20
<212>dna
<213>引物对20上游引物(primer20forwardprimer)
<400>39
gcaactggtagctggaggac20
<210>40
<211>28
<212>dna
<213>引物对20下游引物(primer20reverseprimer)
<400>40
gtgatgagctttgagttttctttcttct28
<210>41
<211>20
<212>dna
<213>引物对21上游引物(primer21forwardprimer)
<400>41
gcaactggtagctggaggac20
<210>42
<211>28
<212>dna
<213>引物对21下游引物(primer21reverseprimer)
<400>42
gtgatgagctttgagttttctttcttct28
<210>43
<211>22
<212>dna
<213>引物对22上游引物(primer22forwardprimer)
<400>43
ctatggcgatggtagggaaaga22
<210>44
<211>21
<212>dna
<213>引物对22下游引物(primer22reverseprimer)
<400>44
actcaagcctgtggttttggt21
<210>45
<211>26
<212>dna
<213>引物对23上游引物(primer23forwardprimer)
<400>45
gccacagtacttttcaagaagtggaa26
<210>46
<211>26
<212>dna
<213>引物对23下游引物(primer23reverseprimer)
<400>46
ttgagacacctattttgtgcctgtat26
<210>47
<211>24
<212>dna
<213>引物对24上游引物(primer24forwardprimer)
<400>47
ctgtatttctgagagagcggaagg24
<210>48
<211>27
<212>dna
<213>引物对24下游引物(primer24reverseprimer)
<400>48
accatttagaaataaccacagcctctt27
<210>49
<211>28
<212>dna
<213>引物对25上游引物(primer25forwardprimer)
<400>49
agatactactttcatctctcaggatggg28
<210>50
<211>22
<212>dna
<213>引物对25下游引物(primer25reverseprimer)
<400>50
aggtgatcatccggtttgcttt22
<210>51
<211>23
<212>dna
<213>引物对26上游引物(primer26forwardprimer)
<400>51
catggtgttcagaggaagtgaga23
<210>52
<211>22
<212>dna
<213>引物对26下游引物(primer26reverseprimer)
<400>52
ggccacaagcattgcttatgtt22
<210>53
<211>24
<212>dna
<213>引物对27上游引物(primer27forwardprimer)
<400>53
aaacacaaccaccatatagcccaa24
<210>54
<211>25
<212>dna
<213>引物对27下游引物(primer27reverseprimer)
<400>54
ggttgtaatttcccatggtcttggt25