一种检测急性b淋巴细胞白血病特异基因hb-1引物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及诊断试剂盒领域，具体讲，涉及一种检测急性B淋巴细胞白血病特异基因HB-1的引物和试剂盒。其中，检测HB-1的引物和探针为：由SEQ?ID?NO:1所示的上游引物序列，由SEQ?ID?NO:2所示的下游引物序列，由SEQ?ID?NO:3所示的探针；其中SEQ?ID?NO:3所示的核苷酸序列的5’端有Fam标记，3’端有Tamra标记。本发明的试剂盒优化了探针序列，简化了实验步骤，实现检测方法的一步化，增加实验的稳定性，实现了基因HB-1的定量检测。
【专利说明】—种检测急性B淋巴细胞白血病特异基因HB-1引物及试剂盒。
【技术领域】
[0001]本发明涉及诊断试剂盒领域，具体讲，涉及一种检测急性B淋巴细胞白血病特异基因HB-1的引物和试剂盒。
【背景技术】
[0002]HB-1基因为新近发现的一种次要组织相容性抗原基因。HB-1基因位于5号染色体5q32区，全长约8.5kb，含2个外显子，转录产物382bp，编码含58个氨基酸残基的蛋白质产物。HB-1抗原肽的编码是由CUG密码子启动的，翻译一个含有41个氨基酸的短肽蛋白质。至目前为止，文献报道仅发现HB-1表达于急性B淋巴细胞白血病的白血病细胞以及EB病毒转化的B细胞表面，不在正常B细胞表达，也不在T细胞、单核细胞及成纤维细胞等表达。
[0003]Dolstra等学者在1999年曾应用实时荧光定量PCR方法对相关病例进行了 HB-1基因表达的检测，13名B-ALL患者全部表达HB-1基因(>10%)，14个B细胞淋巴瘤标本中有2个表达,5个急性未分化白血病中有2个标本表达。而所有T-ALL、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病及非造血系统的实体肿瘤均无HB-1的表达。在非肿瘤细胞中，EBV转化的B细胞系有90%表达HB-1基因，而其他非肿瘤细胞无表达。Dolstra等学者将EBV转化的淋巴细胞系的mRNA逆转录为cDNA，并将cDNA转入E.coli，构建了 cDNA文库。他们将含有HLA-B * 4403基因的pCR3质粒及含有cDNA文库的pSV-Sprortl质粒混合孵育，将孵育产物转染进C0S-1细胞，通过检测CTL细胞刺激产生的IFN-Y水平来测定转染产物。应用实时荧光定量PCR (Taqman?探针)来检测HB-1，在ABI/PRISM7700实时荧光定量PCR仪上进行，Pbgd为内参基因。其上游、下游引物见表1。
[0004]PCR 反应体系:共 50ul，1.25U AmpliTaq GOLD, 250 μ M dNTPs,上游及下游引物各15pmol PCR 反应条件:95°C IOmin — (60°C 60s, 95°C 15s)，40 个循环。
[0005](参考文件为:Dolstra H, Fredrix H, Maas F，Coulie PG, Brasseur F，MensinkE，et al.A human minor histocompatibility antigen specific for B cell acutelymphoblastic leukemia.J Exp Med.1999Janl8 ；189 (2):301-8.)
[0006]表1:目的基因及内参基因的引物及探针序列
[0007]
【权利要求】
1.一种检测急性B淋巴细胞白血病特异基因HB-1的引物和探针，其特征在于，检测目的基因HB-1的引物和探针为:由SEQ ID NO:1所示的上游引物序列，由SEQ ID N0:2所示的下游引物序列，由SEQ ID NO:3所示的探针；其中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的5’端有Fam标记,3’端有Tamra标记。
2.一种检测急性B淋巴细胞白血病特异基因HB-1试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括核酸扩增试剂、阴性对照品、阳性对照品、HB-1参考品和ABL参考品； 其中，核酸扩增试剂包括:
3.根据权利要求2所述的检测急性B淋巴细胞白血病特异基因HB-1试剂盒，其特征在于， 检测 HB-1 的 PCR 反应液中含有:5XBuffer 液 5 μ 1，IOmmoI/L 的 dNTPs0.25 μ I,50ymol/L 的 SEQ ID N0:1 ~2 各 0.12μ l,50ymol/L 的 SEQ ID NO:30.1μ 1，用 ddH20 补足至8 μ I ; 内参 PCR 反应液中含有:5 X Buffer 液 5μ 1，I Ommo I/L 的 dNTPs0.25 μ l,50ymol/L的SEQ ID N0:4~6(内参基因的上游引物有2条)各0.12μ l，50ymol/L的SEQ IDNO: 70.1 μ I，其中SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列的5，端有Fam标记，3，端有Tamra标记；ddH20补足至8 μ I。
4.根据权利要求2所述的检测急性B淋巴细胞白血病特异基因HB-1试剂盒，其特征在于，所述的HB-1参考品、ABL参考品分别为；
5.根据权利要求2所述的检测急性B淋巴细胞白血病特异基因HB-1试剂盒，其特征在于，所述HB-1重组质粒液的制备方法为:选取表达HB-1基因的急性B淋巴细胞白血病骨髓细胞提取RNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物回收与pGEM_TPCR载体连接，形成重组质粒，经测序验证为目的基因序列。将上述质粒逐步转录为RNA制作RNA质控品，用定值的RNA质控品滴定质粒DNA，获得质粒DNA相对应的RNA的浓度，然后1:10梯度稀释，制成重组质粒液。
6.根据权利要求2所述的检测急性B淋巴细胞白血病特异基因HB-1试剂盒，其特征在于，所述的对照品为；
7.如权利要求1所示的引物或如权利要求2~6任一权利要求所述的试剂盒在诊断急性B淋巴细胞白血病、监测急性B淋巴细胞白血病治疗后微小残留病或预测急性B淋巴细胞白血病复发中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103937901SQ201410188018
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】任汉云, 王清云, 李渊, 邱志祥, 戢莉, 刘微, 梁赜隐 申请人:北京大学第一医院