一种耐氯菌的筛选分离方法及其得到的一株土地戈登氏菌与流程

本发明涉及一种供水系统中耐氯菌的筛选分离方法以及通过该方法从管网水中分离得到的一株土地戈登氏菌。

背景技术：

目前氯消毒依然是国内水厂广泛采用的消毒工艺，加氯的过程也是对细菌耐氯性选择的过程，对氯具有较高耐受性的细菌被称作“耐氯菌”。存在于供水系统中的耐氯菌对饮用水的安全性有较大危害，一方面有些耐氯菌本身就是病原菌或者条件致病菌，如分枝杆菌、军团菌、铜绿假单胞菌、金黄葡萄球菌等；另一方面，耐氯菌导致氯消毒失效，引发供水管网中微生物的再生长，降低了供水管网的生物稳定性，从而引起用户龙头水菌落总数、色度、浊度等水质指标超标。耐氯菌长期处于一个贫营养且余氯浓度较高的极端环境体系下，现行菌落总数检测的国标方法在耐氯菌检验的过程中存在较大的局限性，大大限制了对供水管网中耐氯菌的研究。

大量研究表明水体中可培养的细菌数量不足其总量的10％，现行菌落总数的检验方法远远不能体现水体中真实的细菌数量分布情况。

技术实现要素：

本发明针对现行菌落总数的检验方法无法对水体中的耐氯菌进行筛选、分离的问题，提供了一种耐氯菌的筛选分离方法，该方法对样品中菌体富集后，再经过耐氯性筛选、耐氯菌的分离纯化、耐氯性验证等步骤，对供水系统中的耐氯菌进行筛选分离。

本发明的一个目的是提供一种耐氯菌的筛选分离方法，具体步骤如下：

(1)水样前处理：水样经聚碳酸酯膜富集浓缩，然后用生理盐水洗脱，3500rpm离心，弃上清，收集菌体，收集到的菌体加入5ml营养肉汤置于37℃隔水式恒温培养箱中培养24h进行增菌，培养后的菌液3500rpm离心10min，弃上清后加10ml生理盐水涡旋制备成菌悬液备用；或：

(2)生物膜样品前处理：生物膜样品加入生理盐水，采用超声洗脱，先通过低速离心去除大的颗粒物质，取上清进一步重复超声、低速离心步骤去除颗粒物质，上清通过3500rpm离心10min，弃上清后加10ml生理盐水涡旋制备成菌悬液备用；

(3)耐氯细菌筛选：对上述步骤(1)或步骤(2)前处理后制备的菌悬液加氯，分别在作用30min、1h、2h进行异养菌平板计数，同时测定作用30min、1h、2h的余氯量，保持在hpc测定时水中的余氯量大于0.5mg/l；采用r2a培养基平板涂布法进行测定，涂布好的平板置于22℃培养7d，7d后观察平板上的菌落生长情况，记录菌落的形态特征及数量，此时平板上检出的菌落均有一定的耐氯性。

(4)分离纯化：挑取平板上的菌落到新的r2a平板上划线培养，培养温度22℃，培养7d；培养后挑取分离较好的单菌落至营养肉汤中37℃培养24h进行增菌，增菌后再进行划线分离纯化；重复上述“划线-增菌-划线”过程3次。

(5)耐氯性验证：对分离纯化后得到的有一定耐氯性的细菌进行进一步耐氯性验证。挑取分离好的单菌落，加入到5ml营养肉汤中，37℃培养24h，3500rpm离心10min弃上清，加入10ml生理盐水涡旋制备成菌悬液，制备好的菌悬液中加入300mg/l次氯酸钠溶液500μl，理论加氯浓度为15mg/l，作用2h后加5g/l的硫代硫酸钠溶液100μl终止反应；此时取100μl菌液进行r2a涂板培养，平板上有菌落检出，证明该菌有较强的耐氯性。

上述方法中，步骤1)中所述水样取样量为1l浓缩后加5ml生理盐水洗脱；所述聚碳酸酯膜的孔径为0.22μm，所述生理盐水为灭菌的氯化钠溶液，重量百分比为0.85％。

上述方法中，步骤2)中所述的生物膜为砂滤池中的生物砂或炭滤池中的生物活性炭；所述生理盐水为灭菌的氯化钠溶液，重量百分比为0.85％，所述超声洗脱的频率为40khz，所述的低速离心为800rpm。

上述方法中，步骤3)中所述加氯后氯的理论浓度为9mg/l。

本发明的另一个目的是提供一株通过上述方法筛选分离得到的一株耐氯菌jn724，经16srdna鉴定该菌属于土地戈登氏菌(gordoniaterrae)，于2017年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为：cgmccno.14482。

所述菌株的特征为：菌落橙红色，圆形，表面光滑湿润、菌落凸起，直径约1mm，边缘整齐平滑，生长缓慢；菌体短杆状，幼龄菌为球状，直径约为0.7μm,成熟菌体为杆状，大小为0.5～0.7×1.2～2.0μm，革兰氏阳性，好氧，生长温度为20～45℃，适宜生长ph为6.5～7.2；乳糖发酵实验不产酸、不产气，产氨试验阴性，氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性。

所述菌株有一定的耐氯性，耐氯实验加氯的初始浓度为15mg/l，2h后氯的浓度为0.5mg/l，此时仍可以检出该细菌。

所述菌株具有seqidno.1所示的16srdna序列。

本发明的再一个目的是提供所述的土地戈登氏菌(gordoniaterrae)jn724在指导供水系统水质检测分析及微生物安全评估方面的应用。

本发明的有益效果：

异养菌平板计数(hpc)通过选用贫营养培养基以及降低培养温度等方法，模拟管网中的贫营养环境，提高了细菌的检出率。本研究主要通过异养菌平板计数及聚合酶链式反应(pcr)技术筛选、分离、鉴定城市供水系统中的耐氯菌，同时对耐氯菌的耐氯性进行验证，为供水水厂消毒技术的优选提供理论技术支持。

通过耐氯菌的筛选分离，能够更准确的掌握水体中的细菌数量及细菌类群的构成情况，为城市供水的微生物安全评估提供更准确的理论依据，为水厂消毒工艺的改进提供支撑，从而更好的保证饮用水的生物安全性。

附图说明

图1、图2为hpc平板计数；

图3、图4为菌落的划线纯化；

图5为水厂生物活性炭加氯前后平板计数；

图6为鉴定耐氯菌的pcr产物琼脂糖电泳图；

图7为对筛选出的耐氯菌增菌培养；

图8、图9为产氨试验和乳糖发酵验证；

图10为土地戈登氏菌革兰氏染色镜检(40×)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1以管网水为例，对其中的耐氯菌进行筛选分离

(1)取某管网水水样1l，水样经0.22μm的聚碳酸酯膜富集浓缩，然后加入生理盐水5ml洗脱，3500rpm离心，弃上清，收集菌体，收集到的菌体加入5ml营养肉汤置于37℃隔水式恒温培养箱中培养24h。培养后的菌液3500rpm离心10min，弃上清后加10ml生理盐水涡旋制备成菌悬液备用。

(2)对菌悬液进行加氯试验，理论加氯量为9mg/l，分别在作用30min、1h、2h进行hpc测定，保证hpc测定时水中的余氯量大于0.5mg/l。采用r2a培养基平板涂布法进行hpc测定，涂布好的平板置于22℃培养7d后，观察平板上的菌落生长情况(附图1、2)，记录菌落的形态特征及数量，此时平板上检出的菌落均有一定的耐氯性。

(3)挑取平板上的菌落到新的r2a平板上划线培养，培养温度22℃，培养7d；培养后挑取分离较好的单菌落至营养肉汤中37℃培养24h进行增菌，增菌后再进行划线分离纯化；重复“划线-增菌-划线”过程3次对平板上的细菌进行分离纯化(附图4、7)，分离纯化后的细菌进行进一步耐氯性验证。

(4)挑取分离好的单菌落，增菌制备菌悬液后加入300mg/l次氯酸钠溶液500μl，理论加氯浓度为15mg/l，作用2h后加5g/l的硫代硫酸钠溶液100μl终止反应。经过耐氯验证的菌悬液取100μl涂板计数菌落生长情况。

通过该方法从管网水中分离得到3株耐氯菌，对3株菌进行16srdna分子的鉴定，从分子水平确定3株耐氯菌的种属。以待鉴定的细菌dna为模板，以16srdna基因的pcr扩增的通用引物为引物，进行pcr扩增，pcr产物(附图6)纯化后进行全序列测定，3株菌的结果鉴定为：芽孢杆菌、假单胞菌和土地戈登氏菌，其中管网中土地戈登氏菌的耐氯性未见相关报道，其测序结果(seqidno.1)如下：

atcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacggaaaggcccagcttgctgggtactcgagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgccctgcactctgggataagcctgggaaactgggtctaataccggatatgaccaactgtcgcatggtggttggtggaaagcttttgcggtgtgggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcaccagggacgaagcgtgagtgacggtacctggagaagaagcaccggccaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtcgtctgtgaaattctgcaactcaattgcaggcgtgcaggcgatacgggcagacttgagtactacaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggtagtaactgacgctgaggagcgaaagcgtgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggtactaggtgtgggttccttttcacgggatccgtgccgtagctaacgcattaagtaccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggtttgacatacaccagacgcggctagagatagtcgttcccttgtggttggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgtattgccagcgggttatgccggggacttgcaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggctggtacagagggctgcgataccgtgaggtggagcgaatcccttaaagccagtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcctaaccccttgtgggagggagctgtcgaaggtgggatcggcgattgggacgaagtcgtaacaag

将上述菌株的16srdna基因序列与国际genbank数据库中的基因序列进行网上同源性比较发现，该菌与戈登氏菌(gordoniasp.)多个菌株的同源性为100％，查阅有关资料，尚无土地戈登氏菌耐氯性研究的相关报道。

表1、土地戈登氏菌的菌落形态及生理生化特征

土地戈登氏菌的应用

土地戈登氏菌是条件致病菌，和人的生活息息相关，可以引发很多疾病，尤其是呼吸道相关疾病。当管网中环境适宜时，土地戈登氏菌的大量繁殖及其产生的色素，进一步导致龙头水中菌落总数、色度、浊度超标，存在较大的饮用水安全隐患。水厂可以以土地戈登氏菌为指示菌对供水系统中耐氯菌控制情况及微生物安全性进行评估。

由此可见本方法分离管网水中的耐氯菌是可行的。

实施例2

本具体实例采用如下步骤：

(1)称取某水厂砂滤池中生物砂10g，加入生理盐水50ml后40khz超声洗脱10min，800rpm，离心10min,取上清重复以上离心步骤2次，取上清3500rpm离心10min弃上清加入10ml生理盐水涡旋制备成菌悬液备用。

(2)对菌悬液进行加氯试验，加氯后氯的理论浓度为9mg/l，分别在作用30min、1h、2h进行hpc测定，保证hpc测定时水中的余氯量大于0.5mg/l。

(3)采用r2a培养基平板涂布法进行hpc测定，涂布好的平板置于22℃培养7d后，观察平板上的菌落生长情况，记录菌落的形态特征及数量，此时平板上检出的菌落均有一定的耐氯性。

(4)挑取平板上的菌落到新的r2a平板上划线培养(附图3)，培养温度22℃，培养7d；培养后挑取分离较好的单菌落至营养肉汤中37℃培养24h进行增菌，增菌后再进行划线分离纯化；重复“划线-增菌-划线”过程3次对平板上的细菌进行分离纯化，分离纯化后的细菌进行进一步耐氯性验证。

(5)挑取分离好的单菌落，增菌制备菌悬液后加入300mg/l次氯酸钠溶液500μl，理论加氯浓度为15mg/l,作用2h后加5g/l的硫代硫酸钠溶液100μl终止反应。经过耐氯验证的菌悬液取100μl涂板计数菌落生长情况。

通过该方法从水厂砂滤池生物砂中分离得到1株耐氯菌，经鉴定该菌为鞘氨醇单胞菌，由此可见，本方法分离水厂砂滤池生物砂中的耐氯菌是可行的。

实施例3

本具体实例采用如下步骤：

(1)称取某水厂炭滤池生物活性炭10g，加入生理盐水50ml后40khz超声洗脱10min，800rpm，离心10min，取上清重复以上离心步骤2次，取上清3500rpm离心10min弃上清加入10ml生理盐水涡旋制备成菌悬液备用。

(2)对菌悬液进行加氯试验，加氯后氯的理论浓度为9mg/l，分别在作用30min、1h、2h进行hpc测定(附图5)，保证hpc测定时水中的余氯量大于0.5mg/l。

(3)采用r2a培养基平板涂布法进行hpc测定，涂布好的平板置于22℃培养7d后，观察平板上的菌落生长情况，记录菌落的形态特征及数量，此时平板上检出的菌落均有一定的耐氯性。

(4)挑取平板上的菌落到新的r2a平板上划线培养，培养温度22℃，培养7d；培养后挑取分离较好的单菌落至营养肉汤中37℃培养24h进行增菌，增菌后再进行划线分离纯化；重复“划线-增菌-划线”过程3次对平板上的细菌进行分离纯化，分离纯化后的细菌进行进一步耐氯性验证。

(5)挑取分离好的单菌落，增菌制备菌悬液后加入300mg/l次氯酸钠溶液500μl，理论加氯浓度为15mg/l,作用2h后加5g/l的硫代硫酸钠溶液100μl终止反应。经过耐氯验证的菌悬液取100μl涂板计数菌落生长情况。

通过该方法从水厂炭滤池生物活性炭中分离得到2株耐氯菌，经鉴定2株菌分别为蜡状芽孢杆菌和杀鲑气单胞菌，由此可见，本方法分离水厂炭滤池生物活性炭中的耐氯菌是可行的。

sequencelisting

<110>山东省城市供排水水质监测中心

<120>一种耐氯菌的筛选分离方法及其得到的一株土地戈登氏菌

<130>0

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1470

<212>dna

<213>土地戈登氏菌（gordoniaterrae）

<400>1

atcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacggaaaggc60

ccagcttgctgggtactcgagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgccctgc120

actctgggataagcctgggaaactgggtctaataccggatatgaccaactgtcgcatggt180

ggttggtggaaagcttttgcggtgtgggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggg240

gtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccgacctgagagggtgatcggccacactgg300

gactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggc360

gcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctcttt420

caccagggacgaagcgtgagtgacggtacctggagaagaagcaccggccaactacgtgcc480

agcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagct540

cgtaggcggtttgtcgcgtcgtctgtgaaattctgcaactcaattgcaggcgtgcaggcg600

atacgggcagacttgagtactacaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgc660

gcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggtagtaactgacgctga720

ggagcgaaagcgtgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgg780

tgggtactaggtgtgggttccttttcacgggatccgtgccgtagctaacgcattaagtac840

cccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcaca900

agcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggtttgacat960

acaccagacgcggctagagatagtcgttcccttgtggttggtgtacaggtggtgcatggc1020

tgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtc1080

ctgtattgccagcgggttatgccggggacttgcaggagactgccggggtcaactcggagg1140

aaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctaca1200

atggctggtacagagggctgcgataccgtgaggtggagcgaatcccttaaagccagtctc1260

agttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagat1320

cagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaa1380

agtcggtaacacccgaagccggtggcctaaccccttgtgggagggagctgtcgaaggtgg1440

gatcggcgattgggacgaagtcgtaacaag1470