预测HER2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab敏感性的标志物和试剂盒的制作方法

本发明涉及用于预测her2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab敏感性的标志物、试剂盒和系统。

背景技术：

her2阳性乳腺癌是恶性程度高的一类乳腺癌分型，所有的乳腺癌患者中有20％～30％的乳腺癌患者为her2阳性。her2又称人表皮生长因子受体-2，是一种原癌基因，在细胞膜上表达her2蛋白，当egf与her-2结合后，引起her2由单体变成二聚体，随后引发自体磷酸化而传递细胞内信息，调控基因表达，最后维持正常的细胞生长与分裂。当her2表达过多，细胞会因过度刺激而造成不正常的快速生长，最终造成癌症发生。trastuzumab是能与her2特异结合的单克隆抗体，能专一性与her2结合，阻止egf与her2结合，抑制癌细胞生长。另外，trastuzumab还能降低癌细胞her2的表达，抑制肿瘤血管新生的作用，诱发体内免疫作用，包括抗体依赖型细胞毒杀作用与补体毒杀作用，进而造成被单克隆抗体辨识的目标细胞死亡，从而发挥抗肿瘤的作用。

然而近30％的her2阳性乳腺癌患者在使用trastuzumab治疗的过程中对trastuzumab产生耐药，而没能从包含trastuzumab方案的治疗中获益。已有多篇文献报道，选择一些其他的治疗方案如lapatinib、pertuzumab、trastuzumabemtansine(t-dm1)则可能会使这部分患者获益。因此在治疗前判断患者是否对trastuzumab敏感对选择治疗方案非常重要。尽管文献报道有几种her2阳性肿瘤细胞的标记如pi3k的激活、er的激活、pten的丢失、igfr的激活以及免疫细胞状态可以作为判断治疗敏感的标志，但目前这几项标记还没能在临床上展开应用。

目前对her2阳性乳腺癌的诊断主要依靠肿瘤的病理学特征，如免疫组化染色、fish等等，一旦明确her2阳性，则推荐使用含trastuzumab的治疗方案，此时并不知道患者对trastuzumab的治疗的敏感性，只能在经治疗一定时间以后才明确trastuzumab的治疗效果。对于治疗耐受的这部分患者来说，这意味着不良的预后。由于肿瘤存在着较大的异质性，仅用上述的某种标记可能不能反映整个肿瘤乃至患者的全身实际情况，而且需要在取得肿瘤组织后才能检测。所以我们需要找到一个准确的评价方法，在选择治疗方案前先判断患者对trastuzumab的治疗是否敏感。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一组预测her2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab敏感性的标志物，本发明还提供了一种预测her2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab敏感性的试剂盒和系统。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一组预测her2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab敏感性的标志物，包括mir-451a、mir-16-5p、mir-17-3p和mir-940。

优选地，所述mir-451a、mir-16-5p、mir-17-3p和mir-940均来自血清。

本发明提供了一种预测her2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab敏感性的试剂盒，包括扩增mir-451a、mir-16-5p、mir-17-3p和mir-940的引物。

优选地，所述mir-451a、mir-16-5p、mir-17-3p和mir-940均来自血清。

优选地，所述试剂盒还包括逆转录酶及逆转录酶的反应缓冲液、随机逆转录引物、荧光定量pcr反应缓冲液、外参。

优选地，所述外参为cel-mir-39。

本发明提供了mir-451a、mir-16-5p、mir-17-3p和mir-940的联合使用在制备预测her2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab敏感性的试剂盒中的用途。

优选地，所述mir-451a、mir-16-5p、mir-17-3p和mir-940均来自血清。

本发明提供了一种预测her2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab敏感性的系统，包括：

数据输入模块，用于将her2阳性的转移性乳腺癌患者的分子指标的表达值输入模型计算模块，所述分子指标包括mir-451a、mir-16-5p、mir-17-3p和mir-940，将通过荧光定量pcr测得的分子指标的ct值按公式进行计算：δct＝ctmicrorna–ct外参，所述外参为cel-mir-39，所得的δct值即为表达值；

模型计算模块，包括风险评分模型，用于根据her2阳性的转移性乳腺癌患者的分子指标的表达值以及风险评分模型计算患者风险评分结果，所述风险评分模型包括风险评分公式，风险评分＝(0.611×mir-940的表达值)–(0.482×mir-451a的表达值)–(0.525×mir-16-5p的表达值)–(0.719×mir-17-3p的表达值)；

结果输出模块，用于根据患者风险评分结果判定her2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab是否敏感；当患者风险评分结果＜0.13时，该患者对trastuzumab敏感；当患者风险评分结果≥多0.13时，患者对trastuzumab不敏感。

优选地，所述mir-451a、mir-16-5p、mir-17-3p和mir-940均来自血清。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一组预测her2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab敏感性的标志物，本发明还提供了一种预测her2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab敏感性的试剂盒和系统。本发明涉及人血清microrna的分离、定量分析，本发明提供了一种利用血清中的microrna量的变化预测trastuzumab治疗效果的技术，检测血清中的microrna量，可以有以下几个优势：

1、血清相对肿瘤组织标本较易获得，甚至在平常体检中都可以收集到；

2、获取的血清microrna是血液循环中microrna整体水平的代表，反映的是患者整体的生理病理情况，其检测结果具有指导意义；

3、样本的处理、microrna的提取及检测方案简单易行，花费的时间少，样本可以进行大批量处理。

通过本发明的系统能够很好地预测her2阳性的转移性乳腺癌患者对trastuzumab的敏感性。

附图说明

图1为本发明实施例1中芯片检测发现trastuzumab治疗敏感、耐受患者血清中差异表达的microrna的图片；

图2为本发明实施例2中四个microrna依赖的预测模型将患者分为高风险和低风险两组的图片；

图3为本发明实施例2中预测风险在386例患者中的临床因素分层分析。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

在103例使用trastuzumab治疗的her2阳性晚期转移性乳腺癌患者中，有61例对治疗敏感，52例耐受。在这两群患者中，通过microrna芯片检测，结果如图1所示，发现在耐受的患者中，有3个microrna表达上调，9个microrna表达下降。其中mir-940表达上升，mir-451a、mir-16-5p、mir-17-3p下降。

实施例2

一、实验方法

1、her2阳性的转移性乳腺癌患者选择及血液标本收集

患者选择标准：1)病理学诊断为导管浸润性乳腺癌；2)免疫组化her2染色3(+)，或原位杂交her2/cep17ratio≥2.0)；3)预期存活时间≥3，体能状态ecog评分≤2；4)能接受抽血检查。

血液标本收集：全血采集到抗凝管后立即离心，离心条件：820g、4℃、10min；离心后将血清吸取至新ep管中待提取rna用。

2、外参的加入及血清rna抽提；

外参microrna选择cel-mir-39，每500ul血清加入2.5ulcel-mir-39(100nm)，使其在每个样本中的浓度为0.05nm。rna抽提选用norgenbiotek公司的试剂盒(plasma/serumcirculatingandexosomalrnapurificationminikit)，最后将rna溶于10ulrnasefree水中。

3、血清中的microrna反转录为cdna

反转录试剂盒使用clontech公司的microrna反转录试剂盒(mir-x^tmmirnafirst-strandsynthesiskit)

按照表1体系进行反转录：

表1反转录体系

反转录条件设置如表2：

表2反转录条件

反转录结束后加入40μl去离子水使总体积为50μl。

4、用荧光定量pcr技术检测的血清中的4个microrna的量，microrna的序列及使用的引物序列表3。

表3microrna的序列及使用的引物序列

荧光定量试剂盒选用takara公司的sybrgreenmastermix(含通用反向引物)。

按照表4体系进行荧光定量检测。

表4荧光定量pcr体系

pcr条件设置如表5。

表5pcr条件

5、根据风险模型计算风险分数并得到结论。

将所得ct值按公式进行计算：δct＝ctmicrorna–ct外参，所得的δct值即为表达值。风险评分(rs)＝(0.611×mir-940的表达值)–(0.482×mir-451a的表达值)–(0.525×mir-16-5p的表达值)–(0.719×mir-17-3p的表达值)。在试验组中，将计算所得表达值与患者的无进展生存时间关联分析，得到风险评分临界值＝0.13。即当患者风险评分＜0.13时该患者对trastuzumab治疗敏感；当患者风险评分≥0.13时，患者对trastuzumab治疗不敏感。根据所得值预测trastuzumab治疗的敏感性，并选择治疗方案。

二、实验结果

1、根据mir-940、mir-451a、mir-16-5p、mir-17-3p四个microrna在血清中的表达值代入本发明所述风险评分公式所得的数值，将386例trastuzumab治疗的her2阳性晚期转移性乳腺癌患者分成高风险(风险评分≥0.13)和低风险(风险评分＜0.13)两组，可以发现在高风险组患者中无病生存率、总生存率都明显低于低风险组(如图2所示)。

2、为了判断混杂因素是否对结果有影响，在六种临床相关因素(年龄、ki67、ecog评分、er表达状态、pr表达状态、月经状态)中对本风险模型进行了分层分析。根据本发明所述风险模型所得结果，在不同临床因素状态中进行分析，发现四个microrna计算所得的风险预测值仍能很好区分trastuzumab治疗敏感和耐受患者，即这六种临床因素没有影响本风险预测模型的效能，如图3所示。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。