一种PDMS微控板处理方法及其应用与流程

本发明涉及一种生物实验方法，尤其涉及一种pdms微控板处理方法及其应用。

背景技术：

pdms(polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)，是高分子有机硅化合物，固态的pdms是一种硅胶，具有疏水性(hydrophobic)和防水性，为无毒、非易燃性、透明弹性体。因其制作简便且快速，成本低，同硅片之间具有良好的粘附性，而且具有良好的化学惰性等特点，成为一种广泛应用于微流控等领域的有机聚合物材料，尤其常见的生物微孔板微芯片材料。由于pdms具有疏水性，在进行生物实验时具有不相容性，需要对其表面进行处理，使之具有相容性。目前，实验大多通过pbs(phosphatebuffersaline，磷酸缓冲盐溶液)+1％bsa(albuminfrombovineserum，牛血清白蛋白)对pdms表面进行前处理。bsa是牛血清中的一种球蛋白，为白色结晶或类白色冷冻干燥粉末，储存条件为2-8℃，可应用于生化研究，遗传工程和药物研究。现有技术的缺点有：1.bsa本身性质不稳定，需要储存在2-8℃，储存条件严苛，并且需要现配现用，不耐保存。2.bsa含有微量核酸酶，可能使rna降解，且不同批次差异大，导致测试结果不稳定。3.bsa价格较高，实验成本高。

技术实现要素：

所要解决的问题：

本发明处理方法可通过对其表面进行处理，减少表面吸附性，增加pdms的相容性，从而提高测试精确度，且本方法具有操作简便、效果好、成本低等优点。

技术方案：

本发明提供一种pdms微控板处理方法，包括如下步骤：

s1:pdms表面处理：吸取pbst溶液，加于pdms表面，处理时间为10-15min；

s2:加入细胞：加入细胞悬液，静置处理后用pbs洗涤将多余留在表面的细胞冲走；

s3:捕获mrna：加入细胞裂解液，使细胞裂解，获得mrna；

s4:反转录及pcr扩增；将捕获到的mrna进行反转录，获得cdna；并将cdna进行pcr扩增，得到pcr产物；

s5:纯化dna。

更进一步的技术方案为，所述的s1步骤中pbst溶液为：pbst溶液为pbs缓冲液与吐温混合液，所述的吐温浓度为0.01％-1％。

所述的吐温20(tween-20聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯)为黄色或琥珀色澄明的油状液体。聚山梨醇酯类是一大类非离子表面活性剂，具有乳化、扩散、增溶、稳定等作用。

更进一步的技术方案为，所述的s1步骤中pbst溶液为：pbst溶液为pbs缓冲液与吐温20混合液，所述的吐温浓度为0.02％-0.1％。

更进一步的技术方案为，所述的s1步骤中pbst溶液为：pbst溶液的中吐温-20浓度为0.02％，所述的处理时间为15min。

更进一步的技术方案为，所述s1步骤中的0.02％pbst溶液制备方法为：配制0.02％pbst溶液:用无核酸酶水(nucleasefreewater)配制20％tween-20，然后按照pbs：20％tween-20＝1000:1的比例配制0.02％pbst，充分涡旋混匀。

更进一步的技术方案为，包括s6步骤中dna质检。

更进一步的技术方案为，包括s5步骤中dna纯化方法为磁选纯化。

本处理方法可用于用于dna提取。

有益效果

本发明提供技术方案对pdms表面处理方法，用于减少细胞黏连性，分散细胞，能够去除多余粘附于pdms表面的细胞，利于细胞在微控板内按照要求的排布，且不伤害细胞，能够保持细胞完整性。本处理方法使用不含有任何外源性mrna酶，使得整个实验过程不受mrna酶影响，实验结论准确，结论变化性小，性能稳定获得较高得率。使用该发明中的方法纯化后的dna浓度较之现有方法更为稳定，并且产物片段大小符合预期结果。

pbst作为洗涤剂，可用于裂解细胞膜，一般不用于活细胞处理。本技术方案将tween浓度控制在0.01％-0.1％，不但降低细胞之间的粘附性，达到可以去除多余细胞的目的，同时不会对细胞造成伤害，保证细胞活性。尤其0.02％吐温20的pbst溶液对处理pdms表面，既可以降低细胞粘附性，此浓度也不导致细胞死亡，适用细胞范围广。

pbst溶液性质稳定，不需要特殊方法保存，能够长时间保存，且原材料价格低廉，本发明技术方案高效，便捷，成本低。

附图说明

图1为一种pdms微控板处理方法流程图；

图2为实施例1中c组处理结果电泳dna片段检测结果；

图3为实施例2中f组处理结果电泳dna片段检测结果；

图4为实施例3中i组处理结果电泳dna片段检测结果；

图5为实施例4中l组处理结果电泳dna片段检测结果。

具体实施方式

实施例1

配制0.02％pbst溶液:用无核酸酶水(nucleasefreewater)配制20％tween-20，然后按照pbs：20％tween-20＝1000:1的比例配制0.02％pbst，充分涡旋混匀。

s1:pdms表面处理：用移液器吸取200μl0.02％pbst溶液，加于pdms表面，用抽真空干燥器抽真空，处理15min。

s2:加入细胞：加入100μl细胞悬液(重悬于pbs中)，静置2min，是细胞落入微孔中，而后用移液器吸取500μlpbs溶液，将多余留在表面的细胞冲走。本发明所用细胞为小鼠胚胎成纤维细胞l929。

s3:捕获mrna：加入100100μl细胞裂解液，使细胞裂解，获得mrna。用移液器吸取溶液。

s4:反转录及pcr扩增：使用诺唯赞公司反转录试剂(货号r021)及高保真pcr酶(货号p505)进行反转录及pcr扩增，详细步骤如下：

在rnase-free离心管置于冰上，配制如下混合液：

按下列条件进行第一链合成反应：

42℃反应90分钟。

合成的cdna进行pcr扩增，将离心管置于冰上，配制如下混合液：

反应程序：

s5:dna纯化：采用磁选纯化法，用0.6×vahtsdnacleanbeads(诺唯赞，货号n411)进行片段筛选。

s6:dna质控：使用invitrogen公司的qubit3.0仪器对dna的浓度进行定量。使用aati全自动毛细管电泳仪fragmentanalyzer进行dna片段检测。见下表d-f。

实施例2

其他条件不变，用0.01％pbst处理pdms表面，处理时间10min，所用细胞为a431。dna片段检测见下表g-i。

实施例3

其他条件不变，用0.1％pbst处理pdms表面，处理时间10min，所用细胞为293t。dna片段检测见下表j-l。

本发明已经经过了样本验证，证明了该方法的可行性。现列举我们做过的一次对比实验结果，我们使用常规的pbs+1％bsa溶液和0.02％pbst溶液处理pdms，得到的纯化后dna浓度见下表，从该结果可见本发明提供技术方案dna浓度更稳定。数次实验过程中，现有技术变化性大，而本技术方案变化性小，性能更加稳定，有利于提高实验的准确率。

图1-4分别为上述c、f、i、l纯化后的产物，用aati全自动毛细管电泳仪fragmentanalyzer进行dna片段大小检测，结果如下，从图1可见片段大小符合预期结果，由此证明pbst溶液用于处理pdms表面，达到能够降低细胞黏连性的效果，且不伤害细胞，保持细胞完整性，尤其以0.02％pbst处理最佳。以上pbst前百分数为该溶液中吐温-20含量。