一种高效提取河豚毒素的方法与流程

本发明涉及一种化学物质提取领域，尤其涉及一种以河豚鱼内脏为原料规模化、高效地提取生产河豚毒素的方法。其产品可用于戒毒、镇痛及降压药物制剂。

背景技术：

河豚毒素(tetrodotoxin，ttx)是一种由河豚鱼内脏提取的低分子量生物碱类物质。由于其独特的化学结构使其成为细胞钠离子通道专一阻断剂。因此其在生物学研究领域作为生物试剂有着不可替代的位置。河豚毒素在医学临床上所显示的药理学作用，早在上世纪30年代就已有用于临床介断生物碱类成瘾性病症的报道。在镇痛治疗方面也不断有报道推出。因此，其无论在生物学研究领域还是在医学临床应用方面，都显示了十分重要的地位。

ttx是典型的钠离子通道阻断剂，它能选择性与肌肉、神经细胞的细胞膜表面的钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠离子通道，从而阻滞动物电位，抑制神经肌肉间兴奋的传导，导致与之相关的生理机能的障碍，主要造成肌肉和神经的麻痹。构效关系表明，ttx的活性基团是1，2，3位的胍氨基和附近的c-4，c-9，c-10位的羟基，胍基在生理ph值下发生质子化，形成正电活性区域与钠离子通道受体蛋白的负电性羰基相互作用，从而阻碍离子进入通道。钠离子受体至少有6个特异性靶分子结合位点，ttx是与钠通道受体部位i结合。ttx受体位于可兴奋细胞膜外侧、钠通道外口附近，ttx与受体部位结合，阻碍钠离子接近通道外口。研究表明，ttx特异性作用于钠通道，对钾、钙通道和神经肌肉的突触及胆碱指酶无直接影响。此外，毒素能通过血脑屏障进入中枢，对中枢产生明显的抑制作用。总的来说，ttx对呼吸和心血管的抑制是对中枢和外周的共同作用结果。

ttx由于在极微量的情况下就能阻断细胞钠离子的通道，而对钾离子通道没有影响，具有高度的转移性，因此是十分有用的神经生理研究用工具药。

临床医学上已证明ttx是良好的镇静剂、解痉剂、镇痛剂，特别对癌症等恶性疼痛具有良好的镇痛作用，与传统的杜冷丁、吗啡等镇痛药相比虽然响应时间稍长，但其镇痛作用可达12-20小时，而且无成瘾性。近来ttx在戒毒方面也显示出良好的效果，一般戒毒者只需每日注射10μgttx一针，5-7天为一个疗程，毒瘾即可得到控制，并可大大减轻一般戒毒中常常出现的戒毒综合症。

但河豚毒素注射液(水溶液)对温度很敏感，容易受温度的影响而发生降解，温度越高，降解越快。一旦有效活性物质河豚毒素含量低于其标示量的90％或有关物质的相对含量超过医药标准规定限度(大于对照溶液主峰面积)就不符合临床使用要求。试验证明，河豚毒素注射液(水针剂)在室温下不稳定，为了保证河豚毒素注射液的质量，防止河豚毒素含量下降和有关物质含量升高，必须将其置于4-8℃冰箱中保存。这就给河豚毒素的临床适用带来诸多困难和不便，相应在贮存、运输、装卸、批发、零售、医院和应用各个环节都得注意保持4-8℃低温，否则温度偏高可能影响临床效果，对此，必须设法尽快予以解决，研制出安全稳定，室温下就能长期贮存的可靠产品。为了解决上述问题，一个简单的做法是将河豚毒素做成冻干制剂。一般在水溶液中不稳定的生物活性物质在冻干脱水后贮存期都可延长，待临床应用时，加灭菌注射用水再生即可。但河豚毒素用于医药时，其每剂量的用量只有0.5-60μg，如此微量的河豚毒素在溶液中经冻干脱水后形成不了所要求的固态残留物，必需加入医药上能接受的赋形剂，才能提供微量河豚毒素得以附着的支架，在溶液冻干脱水后能形成固态物。

虽然目前提取、提纯河豚毒素的方法繁多，但这些方法多多少少都存在着一定的缺陷，如产出纯度高的高效液相法也存在这设备昂贵(高压液相仪)的问题，又例如浸渍分馏法，存在着效率低下、产品纯度不高等问题。

中国专利局于2008年6月18日公开了一种河豚毒素制备方法的发明专利，授权公开号为cn101891751b，该发明专利采用氨基酸作助溶剂，不仅能起到助溶剂的作用，增加河豚毒素在水中的溶解性，还能与河豚毒素形成高水溶性的盐溶液，提供了一种生产纯度较高、杂质较少河豚毒素的方法，但该技术方案同样存在着制备周期过长、不宜用于大规模产业化生产等方面的缺陷。

技术实现要素：

为解决上述虽然目前提取、提纯河豚毒素的方法繁多，但这些方法多多少少都存在着一定的缺陷，如产出纯度高的高效液相法也存在这设备昂贵(高压液相仪)的问题，又例如浸渍分馏法，存在着效率低下、产品纯度不高等问题，提供了一种能够大规模提取制备河豚毒素的方法，该方法工艺简单、高效，产率高，品质优良，产品纯度高达97-99％，直接符合生物学研究和临床应用的要求。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种高效提取河豚毒素的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将河豚鱼内脏捣碎、匀浆，用含醋酸的醇-水混合液搅拌浸泡1-2小时，并以5800-6200r/m转速离心，搅拌在水浴条件下进行，过滤沉淀物，并将沉淀物重复进行2-3次以上方法，合并过滤所得滤液，并进行浓缩；用除脂液除去滤液所含的脂肪，得到微黄初毒液；

2)微黄初毒液在低温条件下，用活性炭进行脱色纯化后滤出活性炭，再以大孔吸附剂进一步吸附纯化，滤出大孔吸附剂，得到初毒液清液；

3)对初毒液清液进行冷冻干燥处理和减压浓缩，减少至原体积三分之一至二分之一，得到浓缩河豚毒素毒液，经过微滤和超滤后收集滤液，再对滤液进行2-3次的微滤和超滤后将所得滤液合并得到低杂质河豚毒素毒液；

4)对低杂质河豚毒素毒液进行纳滤处理收集滤液，对纳滤膜进行洗脱收集洗脱液，再一次重复上述操作，合并两次收集得到的洗脱液，得到液态河豚毒素粗品；

5)对液态河豚毒素粗品进行水浴蒸馏处理，收集余液，利用氨水将水浴蒸馏处理后的余液ph值调节至8.5-9.5，在低温条件下静置得到河豚毒素结晶体；

6)将河豚毒素结晶体溶于醋酸-甲醇-水体系溶液，利用氨水将溶液ph值调节至8.5-9.5，进行低温减压干燥处理，将产品再次结晶纯化，将结晶产物干燥后便得到所需河豚毒素。

作为优选，所述步骤5)和步骤6)均优选为将ph值调节至9-9.2。

作为优选，所述步骤1)中含醋酸的醇-水混合液中醇为甲醇、乙醇或两者混合醇，醋酸含量为0.8-1％，醇含量为10-12％，余量为水。

作为优选，所述步骤1)中除脂液为氯仿、乙醚、苯、石油醚中任意一种物质。

作为优选，所述步骤2)中的大孔吸附剂为d101大孔吸附剂或d201大孔吸附剂中的任意一种。

作为优选，所述步骤3)中冷冻干燥分为三个阶段：(1)预冻2-3小时，温度为-20～-35℃；(2)低压干燥10-12小时，温度为-20～-25℃；(3)升温干燥3-4小时，温度为-5～5℃。

作为优选，所述步骤3)中微滤施加压力为0.1-0.3mpa，优选为0.1-0.15mpa；超滤施加压力为0.1-0.3mpa，优选为0.2-0.25mpa；所述步骤4)中纳滤施加压力为0.1-0.3mpa，优选为0.1-0.15mpa。

作为优选，所述步骤3)中减压浓缩在减压真空度为1.2-2.0pa条件下进行；步骤5)中低温静置温度在10-35℃。

作为优选，所述步骤6)中醋酸-甲醇-水体系中醋酸含量为0.5-0.8％，甲醇含量为8-10％，余量为水；低温减压干燥在压力0.01-0.02mpa，温度5～10℃条件下进行。

上述方法是在水浴条件下提取，水浴温度优选为90-100℃，由于河豚毒素(tetrodotoxin，简称ttx)具有良好的热稳定性，一般的加热烹煮无法使其分解，且ttx微溶于水，不溶于部分有机物但对一定浓度的醋酸溶液具有较良好的溶解性，因此在醋酸-醇-水的溶液体系下对其水浴加热能够促进ttx溶解萃取，醇类优选为甲醇，搅拌使溶剂中ttx分布均匀能够促进溶解过程的进行；此外由于河豚内脏中含有大量的蛋白质，水浴加热过程能够使得大部分溶解的蛋白质发生变性产生沉淀，方便过滤，有利于除去溶液体系中所含的大部分蛋白质；多次对其进行搅拌、水浴过程能够提高ttx的获得率；由于原材料是河豚内脏，其中含有大量的动物脂肪，因此加入除脂液除脂能够减少后续过程中动物脂肪对提取ttx产生干扰，除脂液为氯仿、乙醚、苯、石油醚中任意一种物质的甲醇或乙醇溶液，优选为氯仿的甲醇溶液，氯仿重量百分比为10-20％，优选为10-12％，通过萃取的方式除去滤液中的动物脂肪，且除脂液中成分对原滤液中溶解的ttx不产生不良影响。

上述活性炭优选为木质活性炭、兽骨/血活性炭或泥煤活性炭中的一种，以水蒸气活化的颗粒状活性炭，这几种活性炭原来来源丰富价格制备活化较简单，价格低廉，对于大规模生产ttx需要大量使用活性炭的情况比较有利，同时所述这几种活性炭性质稳定，在纯化脱色过程中不对微黄初毒液造成污染、引入杂质，易通过过滤方式进行滤出除去；大孔吸附剂为d101大孔吸附剂或d201大孔吸附剂中的一种，最优选择为d201大孔吸附剂，d201是一种阴离子交换树脂，其对弱酸性物质具有极佳的亲和力，而ttx作为一种生物碱，其d201大孔吸附剂进行吸附除杂时对ttx无影响，不会降低ttx的产率。

上述微滤和超滤均为物理过滤杂质的方式，微滤和超滤混用能够更加彻底地除去溶液中的大分子量杂质，且先微滤再超滤可提升超滤的过滤效果，以免大分子量物质堵塞超滤膜或对超滤膜进行损坏；超滤优选孔径为500-700a的超滤膜进行，ttx分子量为319，该孔径的超滤膜对ttx具有良好的透过性，而分子量大于ttx的杂质在微滤后的超滤过程的几乎被完全滤出，仅存在几种与ttx分子量极为接近的组分和分子量小于ttx的组分存在于滤液中，在此后的纳滤过程中，纳滤优选孔径为1-2nm的纳滤膜，能够透过绝大部分分子量小于ttx的组分物质，此后从纳滤膜上洗脱得到的洗脱液中仅余下ttx与分子量与ttx极为相近的物质，其中以ttx为主，杂质在微滤-超滤-纳滤的三重膜过滤中已基本除去。

上述对纳滤膜进行洗脱的洗脱液为醋酸-甲醇-水溶液，醋酸浓度为0.5-1.5％，甲醇浓度为5-12％，余量为水，优选醋酸浓度为0.8-0.9％，甲醇浓度为9-10％，余量为水。

上述冷冻干燥和减压浓缩步骤均是为了减少ttx所在溶液体系中醋酸、醇和水的含量，提高ttx的浓度，使ttx在其所在溶液体系中接近一种饱和状态，对后续的析出结晶起到良好的铺垫作用。

上述加入氨水后对ttx所在溶液体系进行水浴蒸馏可使ttx更加接近一种饱和态，在向ttx所在溶液体系中加入氨水可中和其溶液体系中的醋酸，调节ph值，降低ttx的溶解度使其处于一种过饱和状态，使ttx析出，析出使采用静置析出可提高ttx结晶体纯度；碱液可以中和醋酸，选择氨水作为碱液一是由于氨水碱性较弱，可控性较强，对ph进行微调以氨水作为碱液较为合适，二是由于ttx对碱极不稳定，与大部分的碱性物质产生反应且反应产生化学性质稳定的杂质，氨水是一种弱碱物质，减少甚至避免了该情况的发生；在一次结晶后使结晶溶解再在低温减压干燥后重结晶，能够进一步提高ttx的纯度。

另一方面，本发明也提供了含有本法制备的河豚毒素产品的各种制剂，包括口服胶囊、口服片剂、含片、肌肉注射、静脉注射和静脉滴注等剂型。以及各类型透皮吸收制剂，其包括但不仅限于透皮贴片、喷雾剂和涂抹剂等。各剂型中河豚毒素产品含量为：口服剂型每片或每一胶囊10-50ng；注射针剂每毫升1-5ng；透皮吸收制剂每一单体5-50ng。

本发明的有益效果在于：河豚毒素具有良好的热稳定性，一般的加热烹煮无法使其分解，且ttx微溶于水，不溶于部分有机物但对一定浓度的醋酸溶液具有较良好的溶解性，因此在醋酸-醇-水的溶液体系下对其水浴加热能够促进ttx溶解萃取；普通过滤、活性炭和大孔吸附剂吸附能够快速除去沉淀、大分子量杂质，再配以微滤-超滤-纳滤结合的多重膜过滤，能够快速彻底地除去ttx所在溶液体系中的绝大部分杂质，高效制得ttx纯度高的溶液体系；本发明提供的一种高效提取河豚毒素的方法具有实用性强、提取效率高、提取得到ttx纯度高的有点，且各个工序均可由机械自动化或机械手动操控完成，使每一工作步骤都尽量减少工作人员与毒液的直接接触，一方面降低了生产操作的危险性，保障了工作人员的安全，另一方面则该方式更有利于实现规模化生产，减少污染，有利于环境保护。

本发明的上述制剂与现有技术类似的含河豚毒素的药剂相比的改进之处在于特定的剂量范围选择，如中国专利局公布的专利号为cn1227102a的专利文件，其方案提供的药剂剂量范围过大，为0.001-0.45μg，且最低剂量所含河豚毒素过低，根本无法达到治疗效果，并在不起治疗效果的同时会使机体产生耐药性和免疫学反应，因此本发明所选用的剂量是在药代动力学研究的基础上，提出的一个既安全、又具有很好使用效果的剂量。在此剂量范围下，能保证较良好的量效关系，并减少了病人的用药次数，避免给病人带来不必要的痛苦和负担。

本河豚毒素产品可作为用于临床戒断生物碱类成瘾性依赖药物综合征用药，即俗称戒毒用药，还可替代吗啡、杜冷丁等镇痛药，以及解痉、镇静、局麻、抗瘙痒、心动过速和降血压等临床用药。

附图说明

图1为本发明所制备河豚毒素测定的标准曲线。

图2为本发明所制备的河豚毒素的hplc-ms/ms检测质谱离子流图。

具体实施方式

实施例1：河豚毒素的提取

1)将50kg河豚鱼内脏捣碎、匀浆，用含醋酸的醇-水混合液搅拌浸泡1小时，并以6200r/m转速离心，搅拌在水浴条件下进行，过滤沉淀物，并将沉淀物重复进行3次以上方法，合并过滤所得滤液，并进行浓缩；用除脂液除去滤液所含的脂肪，得到微黄初毒液；其中混合液醋酸含量为1％，醇含量为12％，余量为水；除脂液为氯仿的甲醇溶液，氯仿为10％；

2)微黄初毒液在低温条件下，用木质活性炭进行脱色纯化后滤出活性炭，再以d201大孔吸附剂进一步吸附纯化，滤出d201大孔吸附剂，得到初毒液清液；

3)对初毒液清液进行冷冻干燥处理和减压浓缩，减少至原体积三分之一，得到浓缩河豚毒素毒液，经过微滤和超滤后收集滤液，再对滤液进行2次的微滤和超滤后将所得滤液合并得到低杂质河豚毒素毒液；冷冻干燥分为三个阶段：(1)预冻2小时，温度为-35℃；(2)低压干燥10小时，温度为-25℃；(3)升温干燥3小时，温度为5℃；减压浓缩压力为1.2pa；微滤所施外压为0.1mpa，超滤所施外压为0.25mpa，超滤膜孔径为500a；

4)对低杂质河豚毒素毒液进行纳滤处理收集滤液，对纳滤膜进行洗脱收集洗脱液，再对滤液进行纳滤处理，对纳滤膜进行洗脱收集洗脱液，合并两次收集得到的洗脱液，得到液态河豚毒素粗品；纳滤膜选用纳滤膜孔径为1nm；洗脱液为醋酸-甲醇-水溶液，醋酸浓度为0.8％，甲醇浓度为10％，余量为水；

5)对液态河豚毒素粗品进行水浴蒸馏处理，收集余液，利用氨水将水浴蒸馏处理后的余液ph值调节至9.2，在低温条件下静置得到河豚毒素结晶体；低温为10℃；

6)将河豚毒素结晶体溶于醋酸-甲醇-水体系溶液，利用氨水将溶液ph值调节至9.2，进行低温减压干燥处理，将产品再次结晶纯化，将结晶产物干燥后便得到所需河豚毒素；醋酸-甲醇-水体系中醋酸含量为0.8％，甲醇含量为10％，余量为水；低温减压干燥在压力0.01mpa，温度5℃条件下进行。

实施例2：河豚毒素的提取

1)将50kg河豚鱼内脏捣碎、匀浆，用含醋酸的醇-水混合液搅拌浸泡2小时，并以5800r/m转速离心，搅拌在水浴条件下进行，过滤沉淀物，并将沉淀物重复进行2次以上方法，合并过滤所得滤液，并进行浓缩；用除脂液除去滤液所含的脂肪，得到微黄初毒液；其中混合液醋酸含量为0.8％，醇含量为10％，余量为水；除脂液为氯仿的甲醇溶液，氯仿为20％；

2)微黄初毒液在低温条件下，用木质活性炭进行脱色纯化后滤出活性炭，再以d101大孔吸附剂进一步吸附纯化，滤出d101大孔吸附剂，得到初毒液清液；

3)对初毒液清液进行冷冻干燥处理和减压浓缩，减少至原体积二分之一，得到浓缩河豚毒素毒液，经过微滤和超滤后收集滤液，再对滤液进行3次的微滤和超滤后将所得滤液合并得到低杂质河豚毒素毒液；冷冻干燥分为三个阶段：(1)预冻3小时，温度为-20℃；(2)低压干燥12小时，温度为-20℃；(3)升温干燥4小时，温度为-5℃；减压浓缩压力为1.2pa；微滤所施外压为0.1mpa，超滤所施外压为0.25mpa，超滤膜孔径为500a；

4)对低杂质河豚毒素毒液进行纳滤处理收集滤液，对纳滤膜进行洗脱收集洗脱液，再对滤液进行纳滤处理，对纳滤膜进行洗脱收集洗脱液，合并两次收集得到的洗脱液，得到液态河豚毒素粗品；纳滤膜选用纳滤膜孔径为2nm；洗脱液为醋酸-甲醇-水溶液，醋酸浓度为0.9％，甲醇浓度为9％，余量为水；

5)对液态河豚毒素粗品进行水浴蒸馏处理，收集余液，利用氨水将水浴蒸馏处理后的余液ph值调节至9，在低温条件下静置得到河豚毒素结晶体；低温为35℃；

6)将河豚毒素结晶体溶于醋酸-甲醇-水体系溶液，利用氨水将溶液ph值调节至9，进行低温减压干燥处理，将产品再次结晶纯化，将结晶产物干燥后便得到所需河豚毒素；醋酸-甲醇-水体系中醋酸含量为0.5％，甲醇含量为8％，余量为水；低温减压干燥在压力0.02mpa，温度10℃条件下进行。

实施例3：河豚毒素的提取

1)将50kg河豚鱼内脏捣碎、匀浆，用含醋酸的醇-水混合液搅拌浸泡2小时，并以6200r/m转速离心，搅拌在水浴条件下进行，过滤沉淀物，并将沉淀物重复进行3次以上方法，合并过滤所得滤液，并进行浓缩；用除脂液除去滤液所含的脂肪，得到微黄初毒液；其中混合液醋酸含量为1％，醇含量为10％，余量为水；除脂液为氯仿的甲醇溶液，氯仿为15％；

2)微黄初毒液在低温条件下，用木质活性炭进行脱色纯化后滤出活性炭，再以d201大孔吸附剂进一步吸附纯化，滤出d201大孔吸附剂，得到初毒液清液；

3)对初毒液清液进行冷冻干燥处理和减压浓缩，减少至原体积二分之一，得到浓缩河豚毒素毒液，经过微滤和超滤后收集滤液，再对滤液进行3次的微滤和超滤后将所得滤液合并得到低杂质河豚毒素毒液；冷冻干燥分为三个阶段：(1)预冻3小时，温度为-35℃；(2)低压干燥12小时，温度为-25℃；(3)升温干燥3小时，温度为-5℃；减压浓缩压力为2.0pa；微滤所施外压为0.15mpa，超滤所施外压为0.20mpa，超滤膜孔径为700a；

4)对低杂质河豚毒素毒液进行纳滤处理收集滤液，对纳滤膜进行洗脱收集洗脱液，再对滤液进行纳滤处理，对纳滤膜进行洗脱收集洗脱液，合并两次收集得到的洗脱液，得到液态河豚毒素粗品；纳滤膜选用纳滤膜孔径为1nm；洗脱液为醋酸-甲醇-水溶液，醋酸浓度为0.9％，甲醇浓度为10％，余量为水；

5)对液态河豚毒素粗品进行水浴蒸馏处理，收集余液，利用氨水将水浴蒸馏处理后的余液ph值调节至9.2，在低温条件下静置得到河豚毒素结晶体；低温为10℃；

6)将河豚毒素结晶体溶于醋酸-甲醇-水体系溶液，利用氨水将溶液ph值调节至9.2，进行低温减压干燥处理，将产品再次结晶纯化，将结晶产物干燥后便得到所需河豚毒素；醋酸-甲醇-水体系中醋酸含量为0.8％，甲醇含量为8％，余量为水；低温减压干燥在压力0.02mpa，温度5℃条件下进行。

上述方法制备的河豚毒素产品，其质量、纯度以下表所列指标进行检测、确定产品纯度：

高压液相分析采用20rbaxc18柱，检测波长200-210nm，依据扫描的绘画结果，通过保留时间和峰值比较以峰面积归一法计算。

ld50急性毒性试验采用简化几率法测定。

制剂实施例1

精确称取河豚毒素20.0mg，加入50ml柠檬酸盐溶液，其柠檬酸含量为60mg/100ml，充分溶解后添加常规制片赋形剂，所选赋形剂为淀粉100g，充分混合均匀后干燥蒸发水分制片。每片净重100mg，含河豚毒素20ng。

制剂实施例2

精确称取河豚毒素15.0mg，加入柠檬酸盐100.0mg，加注射用水2000ml，搅拌下充分溶解，无菌条件下分装1.0ml/支，每支含河豚毒素5ng。

制剂实施例3

精确称取20.0mg，加入柠檬酸盐20.0mg，加注射用水100ml，加入氮酮1000.0mg，海藻酸钠3000.0mg，搅拌充分溶解后，用氯化钙作为造形剂，制成贴片1000片，每片含河豚毒素10ng。