一种2‑酮积雪草酸、制备方法和在干细胞领域的应用与流程

本发明属于化学领域，涉及一种2-酮积雪草酸、制备方法和在干细胞领域的应用。
背景技术：
：积雪草酸，又名亚细亚酸，是天然植物积雪草的三萜提取物的主要成分之一，具有乌苏烷型骨架结构。积雪草酸及其衍生物具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗阿尔茨海默病、保护心脑血管以及抗肿瘤等作用(参考文献：积雪草酸a环开环衍生物的合成及体外抗肿瘤活性研究，中国新药杂志2017年第26卷第10期)。微生物转化法可以实现很多化学合成无法实现的结构修饰。对积雪草酸的微生物转化是获得新型积雪草酸衍生物的重要手段。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸及其制备方法和在干细胞领域的应用，2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸均为积雪草酸的衍生物。实现本发明上述目的技术方案如下：一种2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸，其化学结构如下：一种2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法，包括如下步骤：步骤s1，生物转化：取活化后的梅林青霉斜面菌种，用无菌水冲洗斜面上的孢子，振摇，得梅林青霉孢子悬浮液；取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中培养2d；无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中，继续培养3d；步骤s2，分离纯化：培养液过滤取滤液，上样于ab-8型大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为40％、75％的乙醇水溶液洗脱，收集75％乙醇洗脱液，浓缩后用反相制备液相色谱分离，流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:3-7,v/v/v)，根据色谱图收集2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸对应的洗脱流份，浓缩干燥即得所述2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸。2-酮积雪草酸可能由梅林青霉通过如下生源途径转化得到：3-酮积雪草酸可能由梅林青霉通过如下生源途径转化得到：优选地，步骤s1于25℃、150r/min条件培养。优选地，所述液体培养液为pdb培养基。优选地，所述积雪草酸浓度为0.4-0.6mg/ml。所述的2-酮积雪草酸在诱导骨髓间充质干细胞成骨分化方面的应用。所述的3-酮积雪草酸在诱导骨髓间充质干细胞成骨分化方面的应用。本发明的突出优点：本发明提供了一种新的积雪草酸衍生物—2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸，并提供了该2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法，申请人研究发现，2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸可以诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，可以用于制备诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的试剂；本发明提供的制备方法步骤简单，易于大生产。附图说明图1为采用反相制备液相色谱分离75％乙醇洗脱物的色谱图；图2为骨髓间充质干细胞成骨分化的茜红素染色结果图。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。实施例12-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸的制备一、实验材料梅林青霉penicilliummeliniithom购自中国科学院微生物研究所。固体培养基：pda培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)；转化培养基：pdb培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)。积雪草酸自制，纯度大于98％。二、实验方法和结果2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法，包括如下步骤：步骤s1，生物转化：取活化后的梅林青霉斜面菌种，用无菌水冲洗斜面上的孢子，振摇，得梅林青霉孢子悬浮液；取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中于25℃、150r/min条件培养2d；无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中，积雪草酸浓度为0.5mg/ml，于25℃、150r/min条件继续培养3d；步骤s2，分离纯化：培养液过滤取滤液，上样于ab-8型大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为40％、75％的乙醇水溶液洗脱，收集75％乙醇洗脱液，浓缩后用反相制备液相色谱分离，色谱柱ultimatexb-c8(10μm,10mm×250mm)，流速2.5ml/min，柱温25℃，检测波长为210nm，进样量0.5ml，流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:5,v/v/v)，根据色谱图(如图1a所示；图1b为对比色谱图，流动相中不添加三氟乙酸)收集2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸对应的洗脱流份，浓缩干燥即得所述2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸，纯度均大于98％。结构鉴定：2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸与积雪草酸碳谱结构鉴定数据对比如下。根据高分辨质谱可知，2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的分子式为c30h46o4，比积雪草酸少一个h2o。根据碳谱的酮羰基以及氢谱(600mhz,cdcl3)羟基数量可知，2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸为积雪草酸脱水后发生烯醇变化的产物。再根据2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸氢谱中c23羟基氢的化学位移确定2-酮积雪草酸(δ4.24，相对3-酮积雪草酸位于高场)、3-酮积雪草酸(δ6.34，相对2-酮积雪草酸位于低场)的酮羰基位置。实施例22-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸的制备一、实验材料梅林青霉penicilliummeliniithom购自中国科学院微生物研究所。固体培养基：pda培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)；转化培养基：pdb培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)。积雪草酸自制，纯度大于98％。二、实验方法和结果2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法，包括如下步骤：步骤s1，生物转化：取活化后的梅林青霉斜面菌种，用无菌水冲洗斜面上的孢子，振摇，得梅林青霉孢子悬浮液；取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中于25℃、150r/min条件培养2d；无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中，积雪草酸浓度为0.4mg/ml，于25℃、150r/min条件继续培养3d；步骤s2，分离纯化：培养液过滤取滤液，上样于ab-8型大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为40％、75％的乙醇水溶液洗脱，收集75％乙醇洗脱液，浓缩后用反相制备液相色谱分离，流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:3,v/v/v)，根据色谱图(与图1a基本一致，仅色谱峰分离度不同，均大于1.5，符合规定)收集2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸对应的洗脱流份，浓缩干燥即得所述2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸，纯度均大于98％。实施例32-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸的制备一、实验材料梅林青霉penicilliummeliniithom购自中国科学院微生物研究所。固体培养基：pda培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)；转化培养基：pdb培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)。积雪草酸自制，纯度大于98％。二、实验方法和结果2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法，包括如下步骤：步骤s1，生物转化：取活化后的梅林青霉斜面菌种，用无菌水冲洗斜面上的孢子，振摇，得梅林青霉孢子悬浮液；取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中于25℃、150r/min条件培养2d；无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中，积雪草酸浓度为0.6mg/ml，于25℃、150r/min条件继续培养3d；步骤s2，分离纯化：培养液过滤取滤液，上样于ab-8型大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为40％、75％的乙醇水溶液洗脱，收集75％乙醇洗脱液，浓缩后用反相制备液相色谱分离，流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:7,v/v/v)，根据色谱图(与图1a基本一致，仅色谱峰分离度不同，均大于1.5，符合规定)收集2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸对应的洗脱流份，浓缩干燥即得所述2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸，纯度均大于98％。实施例4诱导骨髓间充质干细胞成骨分化一、实验材料积雪草酸、2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸自制，纯度大于98％。dmem/f12(1:1)培养基作为无血清培养液，购于hyclone公司。二、实验方法1、骨髓间充质干细胞(bmscs)的分离和培养取出生14d的健康sd大鼠，采用颈椎脱臼法处死浸泡于75％酒精中10min，无菌条件下取双侧股骨、胫骨以及肱骨，置于无血清的培养液中，剪断双侧干骺端，暴露出骨髓腔，用注射器吸取2.5ml培养基反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液置于离心管中，离心1200r/min，5min，弃上清，用含有10％胎牛血清的完全培养液重悬细胞，于5％co2、37℃培养箱内培养，24h后换液，去除未贴壁细胞，每2-3d换液一次，当细胞贴壁生长80％-90％，0.25％胰酶消化并传代，每隔2d换液一次，用传代方法对细胞纯化，于倒置显微镜下观察细胞形态。2、对骨髓间充质干细胞增殖的影响取第三代bmscs以1×103/孔的浓度接种于96孔板，分别加入25μm的积雪草酸、2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸(还设置对照组，对照组不添加积雪草酸、2-酮积雪草酸或3-酮积雪草酸)，每组设置3个复孔，培养5d时终止培养，每孔中加入100μl无血清培养液及10μlcck-8检测液，置于培养箱中2h后，使用酶标仪450nm波长下测定od值。3、钙化结节染色取第3代细胞，接种培养皿中，2.5×105/皿。待细胞贴合至80％后分别加入20μm的积雪草酸、2-酮积雪草酸或3-酮积雪草酸，诱导21d后终止，pbs冲洗3次，95％酒精固定15min后，0.1％茜素红染色，37℃孵育1h，双蒸水冲洗3次。观察并照相，统计钙化面积百分比(％)。4、统计学处理用spss19.0统计软件进行统计学分析，数据采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，p＜0.05表示差异有统计学意义。三、实验结果1、bmscs培养及鉴定大鼠原代细胞培养24h后可见少量星形、梭形细胞贴壁生长，4d后可见细胞呈放射状排列，呈梭形。培养7d后可见细胞呈片状生长排列紧密，呈漩涡状生长，bmscs培养正常。2、对骨髓间充质干细胞增殖的影响积雪草酸、2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸分别培养5d后，采用cck-8试剂盒检测bmscs细胞数量。结果表明：2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸能够促进bmscs的增殖，od值显著高于对照组，差异具有统计学意义(p＜0.05)；积雪草酸对bmscs的增殖无明显促进作用。各组od值如表1所示。表1cck8法检测对骨髓间充质干细胞增殖的影响对照组2-酮积雪草酸组3-酮积雪草酸组积雪草酸组od值(450nm)0.91±0.091.44±0.151.57±0.140.89±0.073、钙化结节染色结果已知成骨细胞会出现钙化现象，会被茜红素染成红色，未钙化的细胞不会被染色。从图2可见，对照组、积雪草酸组均没有明显的钙化结节现象(钙化面积百分比＜5％)，而2-酮积雪草酸组和3-酮积雪草酸组可观察到大面积的钙化结节，钙化面积百分比达40％以上。上述实施例证明，2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，可以用于制备成诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的培养液，以有效提高骨髓间充质干细胞分化成骨骨量。上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。当前第1页12