环状RNA的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及环状rna的应用。

背景技术：

我国养蜂历史悠久，蜜蜂遗传资源丰富，蜜蜂对生态环境的持续发展不可或缺，蜂产品营养价值高，对提高机体免疫功能非常有效。

蜜蜂蜂群中蜂王负责产卵繁衍后代，蜂王是发育完全雌性蜂，其主要职能是产卵。提高蜂王繁殖力，可以提高蜂群繁殖速度，进而加快蜂蜜、王浆等蜂产品的生产，可以有效的提高经济效益。因此，蜂王的高繁殖力越来越受到重视，提高蜂王的繁殖力成为关注焦点。

卵巢是雌性蜜蜂生殖系统的重要功能单位，卵巢激活是雌性蜜蜂体现生殖能力的前提条件，蜂王在自然交尾或是人工授精后卵巢被激活，专司产卵。研究和筛选鉴定蜜蜂卵巢激活的相关分子标记对培育高繁殖力力的蜜蜂蜂王有重要意义。

目前，蜜蜂育种者主要采用传统的配套系制种的方法，培育高繁殖性状的蜂王。采用分子标记开展标记辅助选择育种，在猪、牛、羊等畜种早在上世纪末就已经开始，近几年来，猪、牛等畜种的全基因组选择都已开展的如火如荼。而蜜蜂育种在分子育种方面还未开发出成熟的分子标记，组学水平的育种更是落后于其他畜种。

环状rna(circularrna)是一类新发现的重要调控因子，其与小rna(microrna)共同作用对基因表达具有重要调控作用。环状rna与传统的线性rna不同，是特殊非编码rna分子，呈封闭环状结构，不受rna外切酶的影响，表达更稳定，不易降解。环状rna具有组织表达特异性、时序性等特点，能够吸附小rna，对基因具有表达调控作用，具体如下：

(1)circularrna表达具有组织特异性；

(2)circularrna表达具有时序性；

(3)circularrna通过“海绵体”效应对基因表达发挥调控作用。

研究显示，环状rna通过与小rna、mrna构成共表达网络对繁殖等生命获得发挥调控作用。本发明采用全转录组测序测序对蜜蜂蜂王卵巢进行全转录组测序，并通过构建环状rna-小rna-mrna共表达网络，筛选获得了蜜蜂蜂王卵巢激活相关的环状rna分子标记10个，成为鉴定蜜蜂蜂王卵巢激活的环状rna分子标记。

目前，研究人员通常采用测序、芯片等方法筛选蜜蜂蜂王卵巢激活的dna、mrna分子标记。未见蜜蜂蜂王卵巢激活相关的环状rna分子标记的相关报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种环状rna的应用。该环状rna分子在卵巢激活过程中表达量显著上/下调，它们表达量的变化标志着蜜蜂蜂王卵巢的激活。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了环状rna作为蜜蜂蜂王卵巢激活的分子标记的应用；所述环状rna选自：

ame_circ_0001442、ame_circ_0001857、ame_circ_0002731、ame_circ_0003112、ame_circ_0019669、ame_circ_0013188、ame_circ_0014344、ame_circ_0020098、ame_circ_0008901、ame_circ_0010293、ame_circ_0012999、ame_circ_0015723、ame_circ_0017314、ame_circ_0004999、ame_circ_0011726、ame_circ_0008721、ame_circ_0011788、ame_circ_0011920、ame_circ_0012736、ame_circ_0011725、ame_circ_0011728、ame_circ_0011735、ame_circ_0001450、ame_circ_0009037、ame_circ_0011809、ame_circ_0001248、ame_circ_0006273、ame_circ_0015403、ame_circ_0017851、ame_circ_0002974、ame_circ_0003484、ame_circ_0013756或ame_circ_0011780。

在本发明的一些具体实施方案中，所述环状rna的表达量上调，相应的蜜蜂蜂王卵巢激活；

所述环状rna选自：ame_circ_0011726、ame_circ_0012736、ame_circ_0011725、ame_circ_0011728、ame_circ_0011735、ame_circ_0011809或ame_circ_0011780。

在本发明的一些具体实施方案中，所述环状rna的表达量下调，相应的蜜蜂蜂王卵巢激活；

所述环状rna选自：

ame_circ_0001442、ame_circ_0001857、ame_circ_0002731、ame_circ_0003112、ame_circ_0019669、ame_circ_0013188、ame_circ_0014344、ame_circ_0020098、ame_circ_0008901、ame_circ_0010293、ame_circ_0012999、ame_circ_0015723、ame_circ_0017314、ame_circ_0004999、ame_circ_0008721、ame_circ_0011788、ame_circ_0011920、ame_circ_0001450、ame_circ_0009037、ame_circ_0001248、ame_circ_0006273、ame_circ_0015403、ame_circ_0017851、ame_circ_0002974、ame_circ_0003484或ame_circ_0013756。

本发明还提供了环状rna作为鉴定蜜蜂产卵蜂王和处女蜂王的分子标记的应用；所述环状rna选自：

ame_circ_0001442、ame_circ_0001857、ame_circ_0002731、ame_circ_0003112、ame_circ_0019669、ame_circ_0013188、ame_circ_0014344、ame_circ_0020098、ame_circ_0008901、ame_circ_0010293、ame_circ_0012999、ame_circ_0015723、ame_circ_0017314、ame_circ_0004999、ame_circ_0011726、ame_circ_0008721、ame_circ_0011788、ame_circ_0011920、ame_circ_0012736、ame_circ_0011725、ame_circ_0011728、ame_circ_0011735、ame_circ_0001450、ame_circ_0009037、ame_circ_0011809、ame_circ_0001248、ame_circ_0006273、ame_circ_0015403、ame_circ_0017851、ame_circ_0002974、ame_circ_0003484、ame_circ_0013756或ame_circ_0011780。

在本发明的一些具体实施方案中，所述环状rna的表达量上调，所述蜂王为产卵蜂王；

所述环状rna选自：ame_circ_0011726、ame_circ_0012736、ame_circ_0011725、ame_circ_0011728、ame_circ_0011735、ame_circ_0011809或ame_circ_0011780。

在本发明的一些具体实施方案中，所述环状rna的表达量下调，所述蜂王为产卵蜂王；

所述环状rna选自：

ame_circ_0001442、ame_circ_0001857、ame_circ_0002731、ame_circ_0003112、ame_circ_0019669、ame_circ_0013188、ame_circ_0014344、ame_circ_0020098、ame_circ_0008901、ame_circ_0010293、ame_circ_0012999、ame_circ_0015723、ame_circ_0017314、ame_circ_0004999、ame_circ_0008721、ame_circ_0011788、ame_circ_0011920、ame_circ_0001450、ame_circ_0009037、ame_circ_0001248、ame_circ_0006273、ame_circ_0015403、ame_circ_0017851、ame_circ_0002974、ame_circ_0003484或ame_circ_0013756。

本发明还提供了一种蜜蜂蜂王卵巢激活的分子标记的筛选方法，包括如下步骤：

步骤1：分别获得蜜蜂产卵蜂王的卵巢组织样品和蜜蜂处女蜂王的卵巢组织样品；

步骤2：分别提取获得所述蜜蜂产卵蜂王的卵巢组织样品的rna和所述蜜蜂处女蜂王的卵巢组织样品的rna；

步骤3：获得circrna、mirna序列原始数据；

步骤4：获得所述蜜蜂产卵蜂王的卵巢组织样品与所述蜜蜂处女蜂王的卵巢组织样品中差异表达的circrna和mirna；

步骤5：获得circrna-mirnapair；

步骤6：获得与蜜蜂卵巢激活相关的mirna，通过pair关系获得与所述mirna相结合的circrna；

所述circrna选自：

ame_circ_0001442、ame_circ_0001857、ame_circ_0002731、ame_circ_0003112、ame_circ_0019669、ame_circ_0013188、ame_circ_0014344、ame_circ_0020098、ame_circ_0008901、ame_circ_0010293、ame_circ_0012999、ame_circ_0015723、ame_circ_0017314、ame_circ_0004999、ame_circ_0011726、ame_circ_0008721、ame_circ_0011788、ame_circ_0011920、ame_circ_0012736、ame_circ_0011725、ame_circ_0011728、ame_circ_0011735、ame_circ_0001450、ame_circ_0009037、ame_circ_0011809、ame_circ_0001248、ame_circ_0006273、ame_circ_0015403、ame_circ_0017851、ame_circ_0002974、ame_circ_0003484、ame_circ_0013756或ame_circ_0011780。

本发明还提供了一种蜜蜂蜂王卵巢状态的鉴定方法，包括如下步骤：

步骤1：分别获得蜜蜂产卵蜂王的卵巢组织样品和蜜蜂处女蜂王的卵巢组织样品；

步骤2：分别提取获得所述蜜蜂产卵蜂王的卵巢组织样品的rna和所述蜜蜂处女蜂王的卵巢组织样品的rna；

步骤3：获得circrna、mirna序列原始数据；

步骤4：获得所述蜜蜂产卵蜂王的卵巢组织样品与所述蜜蜂处女蜂王的卵巢组织样品中差异表达的circrna和mirna；

步骤5：获得circrna-mirnapair；

步骤6：获得与蜜蜂卵巢激活相关的mirna，通过pair关系获得与所述mirna相结合的circrna；

所述circrna选自：

ame_circ_0001442、ame_circ_0001857、ame_circ_0002731、ame_circ_0003112、ame_circ_0019669、ame_circ_0013188、ame_circ_0014344、ame_circ_0020098、ame_circ_0008901、ame_circ_0010293、ame_circ_0012999、ame_circ_0015723、ame_circ_0017314、ame_circ_0004999、ame_circ_0011726、ame_circ_0008721、ame_circ_0011788、ame_circ_0011920、ame_circ_0012736、ame_circ_0011725、ame_circ_0011728、ame_circ_0011735、ame_circ_0001450、ame_circ_0009037、ame_circ_0011809、ame_circ_0001248、ame_circ_0006273、ame_circ_0015403、ame_circ_0017851、ame_circ_0002974、ame_circ_0003484、ame_circ_0013756或ame_circ_0011780；

步骤7：获得待测样本中环状rna表达量，如果所述待测样本的卵巢组织的环状rna表达变化趋势符合以下所示，则所述待测样本的卵巢激活：

所述环状rna的表达情况为：

本发明应用全转录组测序技术，测序了蜜蜂卵巢激活过程中circrna、mirna的表达变化情况，并且利用差异表达的circrna和mirna构建了circrna-mirnapair，筛选了pair中已知与蜜蜂蜂王卵巢激活相关的mirna，鉴定了与已知卵巢激活相关mirna结合的circrna，这些circrna被认为是候选的影响卵巢激活的circrna分子标记。这些候选环状rna分子标记的变化，可以通过结合mirna，影响mirna的表达变化，进而影响mirna的靶基因的表达变化。因此，本发明所列的蜜蜂蜂王卵巢激活的环状rn分子标记具有调控的卵巢激活激活相关的基因数目多的特点；蜜蜂蜂王卵巢激活的环状rn分子标记具有准确标志蜜蜂蜂王卵巢激活的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示差异表达circrnago富集结果top20；

图2示差异表达circrnakeggpathway富集结果top20；

图3示差异表达mirnago富集结果top20；

图4示差异表达mirnakeggpathway富集结果top20。

具体实施方式

本发明公开了一种环状rna的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了蜜蜂蜂王卵巢激活环状rna分子标记。这些环状rna分子在卵巢激活过程中表达量显著上/下调，它们表达量的变化标志着蜜蜂蜂王卵巢的激活。包括33个环状rna：

所述环状rna的表达情况为：

本发明提供的环状rna的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

材料方法

样品采集

实验蜜蜂蜂王由中国农业科学院蜜蜂研究所海南实验蜂场提供。选择2组(每组3个重复)健康、体况基本一致的意大利处女蜂王。其中，第1组在处女王性成熟时期采集卵巢组织(处女王组)；另外1组进行人工授精处理，在蜂王正常产卵后采集卵巢组织。所有组织样品采集后迅速放入液氮中冻存，用于rna的提取。

组织样品总rna提取

(1)将预先准备好的1.5ml离心管中加入1mltrizol(invitrogen)，写上样品编号。

(2)将需要提取rna的样品从液氮中取出，在研钵中加入液氮进行研磨。始终保持样品存在于液氮中，研磨得越细越好。

(3)将研磨成粉状的样品倒入预先准备的trizol中，剧烈摇晃至样品完全溶解于trizol中，至透明。

(4)4℃，12000rpm,离心10-15min。

(5)取上清，加入0.2ml氯仿，剧烈混匀15s，放置冰上10min。

(6)4℃，12000rpm,离心10-15min。

(7)取上清，加入0.5ml异丙醇，轻晃至析出沉淀。

(8)放置冰上10min。

(9)4℃，12000rpm,离心10-15min。

(10)去上清，用枪头洗掉剩余的液体。

(11)加入1ml的75％乙醇，洗涤沉淀。

(12)4℃，12000rpm,离心10-15min。

(13)重复一次洗涤过程。

(14)4℃，12000rpm,离心10-15min。

(15)倒出液体，洗掉剩余液体，室温晾干，约3min。

(16)加入约60-100μldepc水溶解rna，放置冰上溶解15min。

(17)保存于-80℃冰箱。

circrna测序文库构建：

(1)使用epicentreribo-zerotmrrnaremovelkit(epicentre,usa)去除核糖体rna(rrna)。

(2)使用rnaser(epicentre,usa)进行消化线性rna。

(3)使用ultra^tmdirectionalrnalibraryprepkitfor(neb,usa)构建环状rna测序文库。

(4)测序平台illuminahiseq4000，产生序列150bppaired-endreads。

(5)参考基因组amel_4.5。

circrna识别：

使用ciri(gaoetal.2015)识别环状rna。具体的，首先利用bwa-mem算法进行序列拆分比对，然后对比对结果sam文件进行扫描，寻找pcc(pairdchiasticclipping)和pem(paired-endmapping)位点，以及gt-ag剪接信号，最后将具有junction位点的序列用动态规划算法进行重新比对，来识别circrna。

mirna测序建库步骤：

(1)使用nebnextmultiplexsmallrnalibraryprepsetforillumina(neb,usa)建库。

(2)纯化回收长为18-30nt的片段，既在srna片段的5’及3’端连接接头。反转录之后进巧凝胶回收。

(3)测序平台illuminahiseq2500，产生序列50bpsingle-endreads。

(4)参考基因组amel_4.5。

mirna鉴定和靶向circrna预测：

测序所得原始数据经过质量控制以后，使用bowtie软件对cleanreads进行mapping到蜜蜂基因组(amel_4.5)(langmeadetal.2009)。对mappedreads使用mirbase20.0鉴定已知的mirna(griffiths-jones2010)。根据mirna前体的发夹结构预测新mirna。使用mirevo(mingetal.2012)和mirdeep2(etal.2012)鉴定新mirna。

使用miranda软件进行靶向circrna的预测，具体参数是：自由能<-10kcal/mol，评分>140(enrightetal.2003)。

差异circrna和mirna的筛选：

使用deseqpackage(1.8.3)程序包对测序数据进行分析，筛选任意两组之间差异表达的circrna和mirna。使用benjamini&hochber计算差异检验p值。差异表达筛选标准是校正p<0.05。

差异表达circrna和mirna结果：

本研究选取处女蜂王和正常产卵蜂王作为研究对象(n＝3/组)，利用转录组测序的方法筛选获得卵巢激活过程差异表达的mirna和circrna(表1和表2)：卵巢激活过程，39个mirna和195个circrna表达上调；42个mirna和235个circrna表达下调。

表1卵巢激活差异表达的circrna列表

表2卵巢激活差异表达的mirna列表

实施例2差异表达circrna和mirna的富集分析：

对获得的差异表达的circrna和mirna的靶基因(circrna的来源基因)同源为果蝇的基因后，进行富集分析，以期能更全面的了解circrna的生物功能。果蝇的基因组从ensembl数据库下载(release74)。同源比对参数为“-pblastx-m8-e1e-5-ff”、“alignmentpeptides&gt;50”。go富集分析使用goseqbasedwalleniusnon-centralhyper-genomerticdistribution(youngetal.2012)。keggpathways分析使用kobassoftware(maoetal.2005)。

卵巢激活过程中差异表达circrna的富集分析结果：

通过对表达谱芯片数据的分析，我们得到了多组差异circrna，为了了解这些差异基因的生物学功能、它们参与的生物学过程，我们对获得的差异基因进行了功能富集分析。我们在这里列出了生物学过程部分显著富集的go_bp结果(p&lt;0.05)。

在卵巢激活过程中，差异circrna显著富集的go_bp过程包括生物过程调节、系统发育和神经系统发育等(图1)。

对卵巢激活和产卵调控过程的差异表达的circrna进行了pathway富集分析，结果见图2。

卵巢激活过程中差异表达mirna的富集分析结果：

通过对表达谱芯片数据的分析，得到了多组差异mirna，为了了解这些差异基因的生物学功能、它们参与的生物学过程，我们对获得的差异基因进行了功能富集分析。我们在这里列出了生物学过程部分显著富集的go_bp结果(p&lt;0.05)。

在卵巢激活过程中，差异mirna显著富集的go_bpterm包括组织器官发育和神经系统形成等(图3)，显著富集的生物学通路主要有notch信号通路、mtor信号通路等(图4)。

已知繁殖mirna分析：

在表3中列出了已知与蜜蜂繁殖相关的、并且在研究中差异表达的31个mrna和36个mirna，它们主要是与蜜蜂级形分化、卵巢激活和其他繁殖相关的过程有关。

表3繁殖相关mirna的分析

实施例3circrna-mirnapair构建：

满足以下条件时，circrna和mirna构成一个pair：(1)circrna是mirna的靶向target；(2)circrna和mirna表达量的pearson相关系数的绝对值大于0.95；(3)circrna和mirna在卵巢激活过程中差异表达。

circrna-mirnapair构建：

利用差异表达的circrna和mirna构建了circrna-mirnapair，筛选了pair中已知与蜜蜂蜂王卵巢激活相关的mirna，鉴定了与已知卵巢激活相关mirna结合的circrna，这些circrna被认为是候选的影响卵巢激活的circrna分子标记。这些候选circrna分子标记的变化，可以通过结合mirna，影响mirna的表达变化，进而影响mirna的靶基因的表达变化。

表4

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。