本申请是以下申请的分案申请：申请日：2008年9月22日；申请号：200880113962.0(pct/us2008/077250)；发明名称：同上。
本申请根据35u.s.c.§119(e)要求2007年7月24日提交的ussn60/951,536的权益，并且是2006年5月17日提交的ussn11/436,266的部分继续申请，ussn11/436,266是2005年11月14日提交的ussn11/274,065的部分继续申请，这两者都根据35u.s.c.§119(e)要求下列的权益：2004年11月12日提交的ussn60/627,763；2005年1月11日提交的ussn,60/642,886；2005年2月2日提交的ussn60/649,508；2005年3月15日提交的ussn60/662,468；2005年4月6日提交的ussn60/669,311；2005年5月16日提交的ussn60/681,607；2005年6月13日提交的ussn60/690,200；2005年7月5日提交的ussn60/696,609；2005年7月27日提交的ussn60/703,018；以及2005年10月12日提交的ussn60/726,453，它们全部通过引用整体并入。
发明领域
本申请涉及优化的igg免疫球蛋白变体、用于制备它们的工程化方法、以及它们的应用，尤其是用于治疗目的的应用。
发明背景
抗体是与特异性抗原结合的免疫蛋白。在包括人和小鼠在内的大多数哺乳动物中，抗体是由成对的多肽重链和轻链构成的。每个链由各自的免疫球蛋白(ig)结构域构成，因此将通用术语免疫球蛋白用于这种蛋白。每条链由两个不同的区域构成，这两个不同的区域称为可变区和恒定区。轻链和重链可变区在抗体之间显示明显的序列多样性，并且负责结合靶抗原。恒定区显示较少的序列多样性，并且负责结合许多天然蛋白以引发重要的生物化学事件。在人中，有5种不同种类的抗体，包括iga(它包括iga1和iga2亚类)、igd、ige、igg(它包括igg1、igg2、igg3和igg4亚类)、以及igm。这些抗体种类之间的区别特征为他们的恒定区，尽管v区也可能存在细微的不同。图1显示了igg1抗体，它在此处作为实例来描述免疫球蛋白的一般结构特征。igg抗体是由两条重链和两条轻链构成的四聚体蛋白。igg重链由四个免疫球蛋白结构域从n-末端至c-末端以vh-ch1-ch2-ch3的顺序连接构成，vh-ch1-ch2-ch3分别是指重链可变结构域、重链恒定结构域1、重链恒定结构域2、和重链恒定结构域3(也称为vh-cγ1-cγ2-cγ3，分别是指重链可变结构域、γ1恒定结构域、γ2恒定结构域、和γ3恒定结构域)。igg轻链由两个免疫球蛋白结构域从n-末端至c末端以vl-cl的顺序连接构成，vl-cl分别是指轻链可变结构域和轻链恒定结构域。
抗体的可变区含有分子的抗原结合决定簇，因此决定着抗体对其靶抗原的特异性。可变区如此命名是因为它与同种类的其他抗体在序列上最不相同。大部分的序列变异存在于互补决定区。共有6种cdr，重链和轻链各三种，它们命名为vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2、和vlcdr3。cdr之外的可变区称为框架(fr)区。尽管不如cdr那么多样化，在不同抗体的fr区之间确实存在序列变异。总的来说，抗体的这种特征结构提供了稳定的骨架(fr区)，免疫系统可以在该骨架上开发出丰富的抗原结合多样性(cdr)以获得对大量抗原的特异性。从不同的生物体中可以得到用于多种可变区片段的大量高度溶解结构，一些是未结合的，一些为与抗原的复合体。已经很好地表征了抗体可变区的序列和结构特征(morea等人,1997,biophyschem68:9-16；morea等人,2000,methods20:267-279，全文通过引用并入)，抗体的保守特征使得能够开发出大量的抗体工程化技术(maynard等人,2000,annurevbiomedeng2:339-376，其通过引用整体并入)。例如，将来自一种抗体例如鼠抗体的cdr移植到另一种抗体例如人抗体的框架区是可能的。这个过程在本领域内称为“人源化”，它使得能够从非人抗体产生较小免疫原性的抗体治疗剂。包含可变区的片段可以在不存在抗体的其他区域时存在，它们包括，例如包含vh-cγ1和vh-cl的抗原结合片段(fab)、包含vh和vl的可变片段(fv)、包含在相同的链上连接在一起的vh和vl的单链可变片段(scfv)，以及多种其他的可变区片段(little等人,2000,immunoltoday21:364-370，通过引用整体并入)。
抗体的fc区与大量fc受体和配体相互作用，赋予它们一系列重要的功能，该功能称为效应子功能。对于igg，如图1和2所示，fc区包含ig结构域cγ2和cγ3，n-末端铰链连入cγ2中。igg种类的fc受体的一个重要家族是fcγ受体(fcγr)。这些受体介导着抗体和免疫系统细胞臂之间的通讯(raghavan等人,1996,annurevcelldevbiol12:181-220；ravetch等人,2001,annurevimmunol19:275-290，它们都通过引用整体并入)。在人中，这个蛋白家族包括：fcγri(cd64)，其包括同种型fcγria、fcγrib、和fcγric；fcγrii(cd32)，其包括同种型fcγriia(包括同种异型h131和r131)、fcγriib(包括fcγriib-1和fcγriib-2)、和fcγriic；以及fcγriii(cd16)，其包括同种型fcγriiia(包括同种异型v158和f158)和fcγriiib(包括同种异型fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)(jefferis等人,2002,immunollett82:57-65，其通过引用整体并入)。这些受体通常具有介导与fc结合的胞外结构域、跨膜区、和可以介导细胞内的一些信号传导事件的胞内结构域。这些受体在多种免疫细胞中表达，包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、b细胞、大颗粒淋巴细胞、朗氏(langerhans)细胞、自然杀伤(nk)细胞、和γγt细胞。fc/fcγr复合体的形成将这些效应子细胞募集到结合抗原的位点，这通常会在细胞内产生信号传导事件和随后的重要的免疫反应，如炎症介质的释放、b细胞活化、内吞作用、吞噬作用、和细胞毒性侵袭。介导细胞毒性和吞噬效应子功能的能力是抗体损坏靶细胞的可能机制。其中表达fcγr的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，并随后引起靶细胞裂解的细胞介导的反应称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(adcc)(raghavan等人,1996,annurevcelldevbiol12:181-220；ghetie等人,2000,annurevimmunol18:739-766；ravetch等人,2001,annurevimmunol19:275-290，它们都通过引用整体并入)。其中表达fcγr的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，并随后引起靶细胞的吞噬作用的细胞介导的反应称为抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)。已经得出了人fcγr的胞外结构域的许多结构，包括fcγriia(pdb登录号1h9v，通过引用整体并入)(sondermann等人,2001,jmolbiol309:737-749，通过引用整体并入)(pdb登录号1fcg，通过引用整体并入)(maxwell等人,1999,natstructbiol6:437-442，通过引用整体并入)、fcγriib(pdb登录号2fcb，通过引用整体并入)(sondermann等人,1999,emboj18:1095-1103，通过引用整体并入)；和fcγriiib(pdb登录号1e4j，通过引用整体并入)(sondermann等人,2000,nature406:267-273，通过引用整体并入)。所有的fcγr结合fc上在cγ2结构域上的n-末端和前面的铰链区的相同区域，显示在图1中。这种相互作用已在结构上充分鉴定(sondermann等人,2001,jmolbiol309:737-749，它们通过引用整体并入)，并且已经得到了与人fcγriiib的胞外结构域结合的人fc的几种结构(pdb登录号1e4k，通过引用整体并入)(sondermann等人,2000,nature406:267-273，通过引用整体并入)(pdb登录号1iis和1iix，通过引用整体并入)(radaev等人,2001,jbiolchem276:16469-16477，通过引用整体并入),并且它们具有人igefc/fcεriα复合体的结构(pdb登录号1f6a，通过引用整体并入)(garman等人,2000,nature406:259-266，通过引用整体并入)。可以通过fc区的变体来改变效应子功能反应(lazar等人2006proc.nat.acad.sciusa.103(111):4005-4010，通过引用整体并入)。
不同igg亚类对fcγr具有不同的亲和力，其中igg1和igg3与受体的结合通常基本上比igg2和igg4更好(jefferis等人,2002,immunollett82:57-65，通过引用整体并入)。所有的fcγr结合iggfc上的相同区域，但是具有不同的亲和力：高亲和力的结合物fcγri对igg1的kd为10-8m-1，而低亲和力受体fcγrii和fcγriii一般分别以10-6和10-5结合。fcγriiia和fcγriiib的胞外结构域96％相同；然而fcγriiib不具有胞内信号传导结构域。此外，尽管fcγri、fcγriia/c、和fcγriiia是触发免疫复合体的激活的正调节子，它们的特征是具有胞内结构域，该胞内结构域具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)；但是fcγriib则具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，因此它是抑制性的。因此，前一类被称为激活受体，fcγriib被称为抑制受体。受体在不同免疫细胞中的表达模式和水平也不同。然而另一水平的复杂性是人蛋白质组中存在大量fcγr多态现象。具有临床重要性的尤其相关多态现象为v158/f158fcγriiia。人igg1与v158同种异型结合的亲和力大于与f158同种异型结合的亲和力。已经显示这种亲和力的不同，以及推测的其对adcc和/或adcp的作用的不同是抗cd20抗体利妥昔单抗(
fc上的重叠但是单独的位点(图1中显示)充当了补体蛋白c1q的结合点。与fc/fcγr的结合介导adcc的方式相同，fc/c1q的结合介导补体依赖性的细胞毒作用(cdc)。c1q与丝氨酸蛋白酶c1r和c1s形成复合体从而形成c1复合体。c1q能够结合6种抗体，然而与两种igg的结合就足以激活补体级联。与fc和fcγr的相互作用类似，不同igg亚类对c1q具有不同的亲和力，其中igg1和igg3与fcγr的结合通常基本上比igg2和igg4更好(jefferis等人,2002,immunollett82:57-65，通过引用整体并入)。
在igg中，fc上cg2和cg3结构域之间的位点(图1)介导与新生儿受体fcrn的相互作用，新生儿受体fcrn的结合会从内体中将内吞的抗体再循环回血流中(raghavan等人,1996,annurevcelldevbiol12:181-220；ghetie等人,2000,annurevimmunol18:739-76，它们都通过引用整体并入)。这个过程结合由于全长分子的大尺寸所引起的肾过滤的排除致使有利抗体的血清半衰期介于1至3周。fc与fcrn的结合还在抗体运输中起关键作用。fc上的fcrn结合位点也是细菌蛋白a和g结合的位点。通常使用这些蛋白的紧密结合作为纯化抗体的方法，该方法在蛋白纯化期间采用蛋白a或蛋白g亲和色谱进行。因此，fc上这个区域的保真性对于抗体的临床特性和它们的纯化很重要。大鼠fc/fcrn复合体(burmeister等人,1994,nature,372:379-383；martin等人,2001,molcell7:867-877，它们都通过引用整体并入)、以及fc与蛋白a和g的复合体(deisenhofer,1981,biochemistry20:2361-2370；sauer-eriksson等人,1995,structure3:265-278；tashiro等人,1995,curropinstructbiol5:471-481，它们都通过引用整体并入)的可用结构使得能够深入了解fc与这些蛋白的相互作用。fcrn受体还负责将igg转移到新生儿的肠和成人肠表皮腔(ghetie和ward,annu.rev.immunol.,2000,18:739-766；yoshida等人,immunity,2004,20(6):769-783，它们都通过引用整体并入)。
大鼠和人fc结构域的研究证明了一些fc残基对fcrn结合的重要性。大鼠和人序列在fc区(根据kabat等人的编号为残基237-443)具有约64％的序列同一性。关于大鼠/人的fc、fcrn重链和fcrn轻链(β-2-微球蛋白)的比对参见图3、4和5。已经从大鼠fc/fcrn复合体的现有结构建立了人fc/fcrn复合体的模型(martin等人,2001,molcell7:867-877，通过引用整体并入)。大鼠和人序列共有对于fcrn结合很关键的一些残基，例如h310和h435(medesan等人,1997j.immunol.158(5):221-7；shields等人,2001,j.biol.chem.276(9):6591-6604，它们都通过引用整体并入)。然而，在许多位置，人和大鼠蛋白具有不同的氨基酸，使得人序列中的残基与大鼠序列中的残基具有不同的环境，并且可能具有不同的特征。这种变异性限制了将特征从一个同源物转移到另一同源物的能力。
在鼠fc中，在t252、t254、和t256位点的随机突变和噬菌体展示选择产生了三突变体t252l/t254s/t256f，该三突变体的fcrn亲和力增加了3.5倍，血清半衰期增加了1.5倍(ghetie等人,1997,nat.biotech.15(7):637-640，通过引用整体并入)。通过在位置253、310和435突变破坏fc/fcrn的相互作用还导致体内半衰期降低(medesan等人j.immunol.1997158(5):2211-7，通过引用整体并入)。
大鼠fc/fcrn复合体的晶体结构鉴定出了对于fcrn结合很重要的fc残基(burmeister等人nature.372:379-383(1994)；martin等人molecularcell.7:867-877(2001)，它们都通过引用整体并入)。最初fc/fcrn复合体结构在1994年解析，分辨率为
已经在人fcγ中对一些对于与fcrn结合很重要的残基进行了突变研究，并且已经证明它们具有增加的血清半衰期。在人fcγ1中，hinton等人将三个残基分别突变为另外19种常见的氨基酸。hinton等人发现某些点会突变为fcrn结合亲和力增加的双突变体(hinton等人2004,j.biol.chem.279(8):6213-6216.hinton等人journalofimmunology2006,176:346-356，它们都通过引用整体并入)。在猴子中，两种突变具有增加的半衰期。shields等人将残基几乎都突变为ala，并且研究了它们与fcrn和fcγr的结合(shields等人,2001,j.biol.chem.,276(9):6591-6604，通过引用整体并入)。
dall’acqua等人使用噬菌体展示选择了与fcrn结合的亲和力增加的fc突变(dall’acqua等人2002,j.immunol.169:5171-5180，通过引用整体并入)。所选择的dna序列主要为双突变体和三突变体。该参考文献表达了他们所选择的序列中的一些所编码的蛋白，并且发现某些能比野生型fc更紧密地结合fcrn。
抗体和fc融合蛋白作为治疗剂的施用需要指定频率的注射，该指定频率与所述蛋白的清除和半衰期特征相关。较长的体内半衰期容许更少地注射或较低的剂量，这很明显是有利的。尽管过去在fc结构域中的突变已经得到了具有增加的fcrn结合亲和力和体内半衰期的一些蛋白，但是这些突变还没有鉴定最佳的突变和增强的体内半衰期。
fc区的一个特征是在n297处发生的n-连接的糖基化是保守的，在图1中显示。这种碳水化合物或有时称为寡糖，在抗体中起着关键的结构和功能作用，并且是抗体必须使用哺乳动物表达系统制备的一个主要原因。
抗体已经被开发用于治疗用途。关于这种治疗的代表性公开物包括chamow等人,1996,trendsbiotechnol14:52-60；ashkenazi等人,1997,curropinimmunol9:195-200；cragg等人,1999,curropinimmunol11:541-547；glennie等人,2000,immunoltoday21:403-410；mclaughlin等人,1998,jclinoncol16:2825-2833；以及cobleigh等人,1999,jclinoncol17:2639-2648，它们都通过引用整体并入。对于目前的抗癌治疗，死亡率方面的任何小的改进就表明了成功。本文所公开的某些igg变体增强了抗体限制靶癌细胞的进一步生长或至少部分破坏靶癌细胞的能力。
抗体的抗肿瘤效力是通过增强它们介导细胞毒效应子功能例如adcc、adcp、和cdc的能力而达成的。实例包括clynes等人,1998,procnatlacadsciusa95:652-656；clynes等人,2000,natmed6:443-446以及cartron等人,2002,blood99:754-758，它们都通过引用整体并入。
人igg1是用于治疗目的的最常用的抗体，并且在此方面已经进行了大量的工程化研究。然而，igg种类的不同同种型包括igg1、igg2、igg3、和igg4具有独特的物理、生物和临床特性。在本领域内需要设计改良的igg1、igg2、igg3、和igg4变体。还需要设计与天然igg多肽相比改良了与fcrn的结合和/或增加了体内半衰期的这类变体。此外，需要将具有改良的药代动力学特性的变体与包括通过改变的fcγr结合而改善效力的修饰的变体组合。本申请满足了这些和其他的需求。
发明概述
本发明涉及亲本多肽的fc变体，该变体包括在多肽的fc区的至少一个修饰。在各实施方式中，所述变体多肽表现出与亲本多肽相比改变的与fcrn的结合。在某些变化形式中，修饰可以选自由下列组成的组：246h、246s、247d、247t、248h、248p、248q、248r、248y、249t、249w、250e、250i、250q、250v、251d、251e、251h、251i、251k、251m、251n、251t、251v、251y、252q、252y、253l、253t、253v、254h、254l、254n、254t、254v、^254n、255e、255f、255h、255k、255s、255v、256e、256v、257a、257c、257d、257e、257f、257g、257h、257i、257k、257l、257m、257n、257q、257r、257s、257t、257v、257w、257y、258r、258v、259i、279a、279d、279c、279f、279g、279h、279i、279k、279m、279n、279p、279q、279q、279r、279s、279t、279w、279y、280h、^281a、^281d、^281s、^281t、282d、282f、282h、282i、282t、283f、283i、283l、283y、284h、284k、284p、284q、284r、284s、284y、285s、285v、286d、286#、286l、287h、287s、287v、287y、288h、288q、288s、305h、305t、306f、306h、306i、306n、306t、306v、306y、307d、307p、307q、307s、307v、307y、308c、308d、308e、308f、308g、308h、308i、308k、308l、308m、308n、308q、308p、308r、308s、308w、308y、309f、309h、309n、309q、309v、309y、310k、310n、310t、311a、311l、311p、311t、311v、311w、312h、313y、315e、315g、315h、315q、315s、315t、317h、317s、319f、319f、319l、339p、340p、341s、374h、374s、376h、376l、378h、378n、380a、380t、380y、382h、383h、383k、383q、384e、384g、384h、385a、385c、385f、385h、385i、385k、385l、385m、385n、385p、385q、385s、385t、385v、385w、385y、386e、386k、387#、387a、387h、387k、387q、389e、389h、426e、426h、426l、426n、426r、426v、426y、427i、428f、428l、429d、429f、429k、429n、429q、429s、429t、429y、430d、430h、430k、430l、430q、430y、431g、431h、431i、431p、431p、431s、432f、432h、432n、432s、432v、433e、433p、433s、434a、434f、434h、434l、434m、434q、434s、434y、435n、436e、436f、436l、436v、436w、437e、437v、438h、和438k，其中编号是根据kabat等人的eu索引进行，并且^是在所指示位置后插入，#是在所指示位置的缺失。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：250q/252y、250q/256e、250q/286d、250q/308f、250q/308y、250q/311a、250q/311v、250q/380a、250q/428l、250q/428f、250q/434h、250q/434f、250q/434y、250q/434a、250q/434m、和250q/434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：250e/252y、250e/256e、250e/286d、250e/308f、250e/308y、250e/311a、250e/311v、250e/380a、250e/428l、250e/428f、250e/434h、250e/434f、250e/434y、250e/434a、250e/434m、和250e/434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：252y/250q、252y/250e、252y/256e、252y/286d、252y/308f、252y/308y、252y/311a、252y/311v、252y/380a、252y/428l、252y/428f、252y/434h、252y/434f、252y/434y、252y/434a、252y/434m、和252y/434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：256e/250q、256e/250e、256e/252y、256e/286d、256e/308f、256e/308y、256e/311a、256e/311v、256e/380a、256e/428l、256e/428f、256e/434h、256e/434f、256e/434y、256e/434a、256e/434m、和256e/434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：286d/250q、286d/250e、286d/252y、286d/256e、286d/308f、286d/308y、286d/311a、286d/311v、286d/380a、286d/428l、286d/428f、286d/434h、286d/434f、286d/434y、286d/434a、286d/434m、和286d/434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：308f/250q、308f/250e、308f/252y、308f/256e、308f/286d、308f/311a、308f/311v、308f/380a、308f/428l、308f/428f、308f/434h、308f/434f、308f/434y、308f/434a、308f/434m、和308f/434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：308y/250q、308y/250e、308y/252y、308y/256e、308y/286d、308y/311a、308y/311v、308y/380a、308y/428l、308y/428f、308y/434h、308y/434f、308y/434y、308y/434a、308y/434m、和308y/434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：311a/250q、311a/250e、311a/252y、311a/256e、311a/286d、311a/308f、311a/308y、311a/380a、311a/428l、311a/428f、311a/434h、311a/434f、311a/434y、311a/434a、311a/434m、和311a/434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：311v/250q、311v/250e、311v/252y、311v/256e、311v/286d、311v/308f、311v/308y、311v/380a、311v/428l、311v/428f、311v/434h、311v/434f、311v/434y、311v/434a、311v/434m、和311v/434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：380a/250q、380a/250e、380a/252y、380a/256e、380a/286d、380a/308f、380a/308y、380a/311a、380a/311v、380a/428l、380a/428f、380a/434h、380a/434f、380a/434y、380a/434a、380a/434m、和380a/434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：428l/250q、428l/250e、428l/252y、428l/256e、428l/286d、428l/308f、428l/308y、428l/311a、428l/311v、428l/380a、428l/434h、428l/434f、428l/434y、428l/434a、428l/434m、和428l/434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：434h/250q、434h/250e、434h/252y、434h/256e、434h/286d、434h/308f、434h/308y、434h/311a、434h/311v、434h/380a、434h/428l、和434h/428f。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：434f/250q、434f/250e、434f/252y、434f/256e、434f/286d、434f/308f、434f/308y、434f/311a、434f/311v、434f/380a、434f/428l、和434f/428f。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：434y/250q、434y/250e、434y/252y、434y/256e、434y/286d、434y/308f、434y/308y、434y/311a、434y/311v、434y/380a、434y/428l、和434y/428f。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：434a/250q、434a/250e、434a/252y、434a/256e、434a/286d、434a/308f、434a/308y、434a/311a、434a/311v、434a/380a、434a/428l、和434a/428f。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：434m/250q、434m/250e、434m/252y、434m/256e、434m/286d、434m/308f、434m/308y、434m/311a、434m/311v、434m/380a、434m/428l、和434m/428f。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：434s/250q、434s/250e、434s/252y、434s/256e、434s/286d、434s/308f、434s/308y、434s/311a、434s/311v、434s/380a、434s/428l、和434s/428f。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少一个修饰：y319l、t307q、v259i、m252y、v259i/n434s、m428l/n434s、v308f/n434s、m252y/s254t/t256e/n434s、m252y/s254t/t256e/v308f、m252y/s254t/t256e/m428l、v308f/m428l/n434s、v259i/v308f/n434s、t307q/v308f/n434s、t250i/v308f/n434s、v308f/y319l/n434s、v259i/v308f/m428l、v259i/t307q/v308f、t250i/v259i/v308f、v259i/v308f/y319l、t307q/v308f/l309y、t307q/v308f/y319l、和t250q/v308f/m428l。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少一个修饰：y319l、t307q、v259i、m252y、v259i/n434s、m428l/n434s、v308f/n434s、v308f/m428l/n434s、v259i/v308f/n434s、t307q/v308f/n434s、t250i/v308f/n434s、v308f/y319l/n434s、v259i/v308f/m428l、v259i/t307q/v308f、t250i/v259i/v308f、v259i/v308f/y319l、t307q/v308f/l309y、t307q/v308f/y319l、和t250q/v308f/m428l。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少一个修饰：250i、250v、252q、252y、254t、256v、259i、307p、307q、307s、308f、309n、309y、311p、319f、319l、428l、和434s。
在另一变化形式中，fc变体包括选自由下列组成的组的至少一个修饰：250v/308f、250i/308f、254t/308f、256v/308f、259i/308f、307p/208f、307q/308f、307s/308f、308f/309y、308f/309y、v308f/311p、308f/319l、308f/319f、308f/428l、252q/308f、m252y/s254t/t256e、259i/434s、428l/434s、308f/434s、308f/428l/434s、259i/308f/434s、307q/308f/434s、250i/308f/434s、308f/319l/434s、259i/308f/428l、259i/307q/308f、250i/259i/308f、259i/308f/319l、307q/308f/309y、307q/308f/319l、和250q/308f/428l。
在另一变化形式中，本发明包括治疗需要所述治疗的患者的方法，该方法包括施用有效量的本文所述的fc变体。
在另一变化形式中，本发明包括通过根据本文所述的修饰对fc进行修饰来增加抗体或免疫粘附素的半衰期的方法。
附图简述
图1.抗体结构和功能。所显示的是全长人igg1抗体的模型，它使用来自pdb登录号1ce1的人源化fab结构(james等人,1999,jmolbiol289:293-301，通过引用整体并入)和来自pdb登录号1dn2的人igg1fc结构(delano等人,2000,science287:1279-1283，通过引用整体并入)进行建模。未显示连接fab和fc区的柔性铰链。igg1是异源二聚体的同源二聚体，由两条轻链和两条重链构成。标记出了构成抗体的ig结构域，包括轻链的vl和cl，和重链的vh、c伽马1(cγ1)、c伽马2(cγ2)、和c伽马3(cγ3)。标记出了fc区。标记出了相关蛋白的结合位点，包括可变区中的抗原结合位点和fc区中fcγr、fcrn、c1q和蛋白a和g的结合位点。
图2.本发明中所用的人igg序列，其具有如kabat等人的eu编号。
图3.本发明中所用的示例性人和啮齿动物igg序列，其具有如kabat的eu编号。
图4.本发明中所用的示例性人和啮齿动物fcrn重链序列。
图5.本发明中所用的示例性人和啮齿动物β-2-微球蛋白序列。
图6.由大鼠结构所产生的人fc/fcrn复合体模型(burmeister等人,1994,nature,372:379-383；martin等人,2001,molcell7:867-877，它们都通过引用整体并入)。一些组氨酸残基显示为fcrn链(浅灰色)和fc多肽(深灰色)上的空间填充原子。
图7.包含插入或缺失的变体的设计中所用的一些概念的图示。
图8.本发明的变体。
图9.本发明的变体。
图10.本发明的变体。
图11.可用于fc变体构建体中的载体pcdna3.1zeo+的示意图。
图12.野生型fc和本发明的fc变体的fcrn竞争性结合数据。在各图中，本发明的fc变体显示为左侧(红色或深灰色)曲线，野生型抗her2抗体显示为右侧(蓝色或浅灰色)曲线。
图13.fc变体的fcrn结合特性的概括。从左到右的纵列显示fcrn结合修饰、所用的免疫球蛋白、其他修饰、通过alphascreentm竞争测定所得的与野生型相比的相对fcrn亲和力(中值)、以及所进行的测定的次数。相对的fcrn亲和力数大于1.0表明与野生型相比结合增强。数据在ph6.0(0.1m磷酸钠、25mm氯化钠)下收集。
图14.fc变体的fcrn结合数据。fc变体在阿仑单抗或抗her2抗体中。所显示的是与野生型相比结合的增加倍数，也就是说，大于1的数表明与fcrn结合更紧密，而小于1的数则表明与fcrn的结合减弱。
图15.与fcrn结合被改善的fc变体的表面等离子体共振实验的概况。柱形图显示各变体的fcrn结合亲和力与野生型fc结构域相比的增加倍数。
图16.野生型抗体和本发明的变体的表面等离子体共振实验。所显示的图线是在ph6.0下fc变体抗体与fcrn的结合和解离。
图17.本发明的fc变体与fcrn的结合测定。所显示的是在ph6.0(a和b)和ph7.0(c)下通过alphascreentm测量的直接结合测定。
图18.本发明的fc变体与fcrn的结合测定。所显示的是在变体fc与表面结合的fcrn结合后所产生的表面等离子体共振单位。
图19.在ph6.0下本发明的fc变体与人fcrn的结合亲和力的表面等离子体共振测量。
图20.本发明的fc变体与人、猕猴和小鼠fcrn的结合亲和力的表面等离子体共振(spr)测量概况。如通过将spr曲线与1:1langmuir结合模型的拟合所测定，大于1的数表明变体fc与fcrn的结合增强。
图21.fc变体的fcrn结合特性的概括。从左到右的纵列显示fcrn结合修饰、所用的免疫球蛋白、其他修饰、通过alphascreentm竞争测定所得的与野生型相比的相对fcrn亲和力(中值)、以及所进行的测定的次数。相对的fcrn亲和力数大于1.0表明与野生型相比结合增强了。数据在ph6.0(0.1m磷酸钠、125mm氯化钠)下收集。
图22.抗her2抗体重链和轻链的氨基酸序列。
图23.本文所用的某些igg1重链的恒定区(ch1至ch3)的氨基酸序列。
图24.本文所用的某些杂合igg1/2重链的恒定区(ch1至ch3)的氨基酸序列。
图25.如用alphascreentm竞争测定所测得的fc变体与人fcγriiia(v158同种异型)的结合。
图26.如用alphascreentm竞争测定所测得的fc变体与蛋白a的结合。
图27.野生型和人fcrn敲入小鼠的抗体变体的血清浓度。所用的抗vegf抗体为野生型(空正方形)、v308f(实正方形)、p257l(实三角形)和p257n(交叉线)。
图28.结合本发明的变体的fcrn的实例。列出了抗vegf抗体与培养基的体积和纯化蛋白的产量。
图29.在ph6.0下本发明的变体与人fcrn的结合亲和力。所显示的值为所讨论的变体相对于野生型抗体的结合强度的增加倍数。例如，变体434s与fcrn的结合比野生型抗体紧密4.4倍。
图30.野生型和变体抗体与293t细胞表面上的fcrn的结合。
图31.包含多个取代的本发明的组合变体。
图32.包含标记为ser434的434s的变体人ch3结构域与人fcrn的相互作用图。
发明详述
本发明公开了新的fc结构域变体的制备，所述fc结构域变体包括在抗体、fc融合体、和免疫粘合素中存在的那些，所述fc结构域变体与fcrn受体的结合增强。如本文所提到的，与fcrn的结合产生了较长的体内血清滞留。
为了增加体内的fc蛋白滞留，结合亲和力的增加必须在约ph6的条件下，而在约ph7.4的条件下则保持较低的亲和力。尽管仍处于检测阶段，但是相信fc区具有较长的体内半衰期，因为在ph6时在与内体中fcrn的结合隔离了fc(ghetie和ward，1997immunoltoday.18(12):592-598，通过引用整体并入)。然后内体隔室将fc再循环到细胞表面。一旦隔室向胞外空间开放，较高的ph约7.4便诱导fc释放回血液中。在小鼠中，dall’acqua等人显示在ph6和ph7.4的条件下fcrn结合增加的fc突变体实际上与野生型fc相比具有降低的血清浓度和相同的半衰期(dall’acqua等人2002,j.immunol.169:5171-5180，通过引用整体并入)。认为在ph7.4时fc与fcrn的亲和力增加阻止了fc释放回血液。因此，增加fc体内半衰期的fc突变理想地应在较低ph下增加fcrn结合，而在较高ph下则仍然容许fc释放。氨基酸组氨酸在6.0至7.4的ph范围内会改变其电荷状态。因此，在fc/fcrn复合体的重要位置发现his残基并不出乎意料(图6)。
本发明的另一方面是增加与野生型相比的fcrn结合，尤其是在较低的ph约ph6.0下，以促进fc/fcrn在内体中的结合。由于对fcγr的差异结合，尤其是与fcγriiib结合增加并且与fcγriib结合降低，已显示导致效力增加，还公开了与fcrn结合改变并且与另一类fc受体fcγr(有时写为fc伽马r)的结合改变的fc变体。
定义
为了可以更完整地理解本申请，下面列出了一些定义。这些定义的意思涵盖语法上的等同物。
本文所用的“adcc”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”意指细胞介导的反应，其中表达fcγr的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上所结合的抗体，并且随后引起靶细胞的裂解。
本文所用的“adcp”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用意指细胞介导的反应，其中表达fcγr的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上所结合的抗体，并且随后引起靶细胞的吞噬作用。
本文所谓的“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失，或者与蛋白化学连接部分的改变。例如，修饰可以是连接到蛋白上的碳水化合物或peg结构的改变。本文所谓的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失。
本文所谓的“氨基酸取代”或“取代”意指将在亲本多肽序列的特定位置的氨基酸替换为另一氨基酸。例如，取代e272y是指变体多肽，在这种情况下为fc变体，其中位置272处的谷氨酸被替换为酪氨酸。
本文所谓的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列的特定位置的氨基酸序列的添加。例如，-233e或^233e是指在位置233后和位置234前的谷氨酸插入。此外，-233ade或^233ade是指位置233之后和位置234之前的alaaspglu插入。
本文所谓的“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列的特定位置的氨基酸序列的去除。例如，e233-或e233#是指在位置233处的谷氨酸缺失。此外，eda233-或eda233#是指在位置233处开始的gluaspala序列的缺失。
本文所用的“变体蛋白”或“蛋白变体”、或“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本蛋白不同的蛋白。蛋白变体可以指蛋白本身、包含蛋白的组合物、或编码它的氨基酸序列。优选地，蛋白变体与亲本蛋白相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比约1至约10个氨基酸修饰，优选约1至约5个氨基酸修饰。本文的蛋白变体序列优选具有与亲本蛋白序列至少约80％的同源性，并且最优选至少约90％的同源性，更优选至少约95％的同源性。变体蛋白可以指变体蛋白本身、包含蛋白变体的组合物、或编码它的dna序列。因此，本文所用的“抗体变体”或“变体抗体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本抗体不同的抗体，本文所用的“igg变体”或“变体igg”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本igg不同的抗体，并且本文所用的“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。本文所用的“fc变体”或“变体fc”意指包含fc结构域中的修饰的蛋白。本发明的fc变体根据构成它们的氨基酸修饰来定义。因此，例如，i332e是相对于亲本fc多肽具有取代i332e的fc变体。同样地，s239d/i332e/g236a定义了相对于亲本fc多肽具有取代s239d、i332e、和g236a的fc变体。野生型氨基酸的身份可能是非特异性的，在这种情况下，上述变体称为239d/332e/236a。注意其中取代的顺序是任意提供的，也就是说，例如，s239d/i332e/g236a是与g236a/s239d/i332e相同的fc变体，等等。对于本发明所讨论的所有位置，编号根据eu索引或eu编号方案(kabat等人,1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(具有免疫学重要性的蛋白序列),第5版,unitedstatespublichealthservice,nationalinstitutesofhealth，通过引用整体并入本文)进行。eu索引或如kabat中的eu索引或eu编号方案是指eu抗体的编号(edelman等人,1969,procnatlacadsciusa63:78-85，其通过引用整体并入本文)。修饰可以是添加、缺失、或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。变体可以包含非天然氨基酸。实例包括us6586207；wo98/48032；wo03/073238；us2004-0214988a1；wo05/35727a2；wo05/74524a2；j.w.chin等人,(2002),journaloftheamericanchemicalsociety124:9026-9027；j.w.chin和p.g.schultz,(2002),chembiochem11:1135-1137；j.w.chin,等人,(2002),picasunitedstatesofamerica99:11020-11024；以及l.wang和p.g.schultz,(2002),chem.1-10，它们通过引用整体并入)。
如本文所用“蛋白”在本文意指至少两个共价连接的氨基酸，它包括蛋白、多肽、寡肽和肽。肽基基团可以包含天然存在的氨基酸和肽键、或合成的肽模拟物结构，即“类似物”，如类肽(参见simon等人,pnasusa89(20):9367(1992)，其通过引用整体并入)。氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的，如本领域的那些技术人员所了解的一样。例如高苯丙氨酸、瓜氨酸、和正亮氨酸是本发明目的所考虑的氨基酸，并且d-和l-(r或s)构型的氨基酸都可以使用。本发明的变体可以包含使用非天然氨基酸的修饰，这些非天然氨基酸使用例如schultz和同事所开发的技术来整合，所述技术包括但不下于下列文献中所描述的方法：cropp&shultz,2004,trendsgenet.20(12):625-30；anderson等人,2004,procnatlacadsciusa101(2):7566-71；zhang等人,2003,303(5656):371-3；和chin等人,2003,science301(5635):964-7，它们全部通过引用整体并入。此外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生、糖基化、peg化、环状排列、环化、与其他分子的连接子、与蛋白或蛋白结构域的融合体、以及肽标签或标记的添加。
本文所用的“残基”意指蛋白的位置及其相关的氨基酸身份。例如，天冬酰胺297(还称为asn297，也称为n297)是人抗体igg1中的残基。
本文所用的“fab”或“fab区”意指包含vh、ch1、vl和cl免疫球蛋白结构域的多肽。fab可以指分离状态的这个区域，或在全长抗体、抗体片段或fab融合蛋白背景下的这个区域。
本文所用的“igg亚类修饰”意指将一种igg同种型的一个氨基酸转变为不同的、比对的igg同种型的对应氨基酸的氨基酸修饰。例如，由于在eu位置296处igg1包含酪氨酸，igg2具有苯丙氨酸，因此igg2中的f296y取代被认为是igg亚类修饰。
本文所用的“非天然存在的修饰”意指非同种型的氨基酸修饰。例如，由于没有一种igg在位置332包含谷氨酸，所以igg1、igg2、igg3、或igg4中的取代i332e被认为是非天然存在的修饰。
本文所用的“氨基酸”和“氨基酸身份”意指可以在特定的、指定的位置存在的20种天然存在的氨基酸或任何非天然类似物中的一种。
本文所用的“效应子功能”意指由于抗体fc区与fc受体或配体的相互作用而引起的生物化学事件。效应子功能包括但不限于adcc、adcp、和cdc。
本文所用的“效应子细胞”意指表达一种或多种fc受体并且介导一种或多种效应子功能的免疫系统的细胞。效应子细胞包括但不限于：单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、b细胞、大颗粒淋巴细胞、朗氏细胞、自然杀伤(nk)细胞、和γδt细胞，并且它可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。
本文所用的“iggfc配体”意指来自任何生物体的与igg抗体的fc区结合形成fc/fc配体复合体的分子，优选多肽。fc配体包括但不限于fcγr、fcγr、fcγr、fcrn、c1q、c3、结合甘露聚糖的凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌(staphylococcal)蛋白a、葡萄球菌蛋白g、和病毒fcγr。fc配体还包括fc受体同源物(fcrh)，它们是与fcγr同源的fc受体家族(davis等人,2002,immunologicalreviews190:123-136，其通过引用整体并入)。fc配体可以包括结合fc的未发现的分子。具体的iggfc配体是fcrn和fcγ受体。本文所用的“fc配体”意指来自任何生物体的与抗体的fc区结合形成fc/fc配体复合体的分子，优选多肽。
本文所用的“fcγ受体”、“fcγr”或“fc伽马r”意指结合igg抗体fc区并且由fcγr基因编码的蛋白家族的任何成员。在人中，这个家族包括但不限于fcγri(cd64)，其包括同种型fcγria、fcγrib、和fcγric；fcγrii(cd32)，其包括同种型fcγriia(包括同种异型h131和r131)、fcγriib(包括fcγriib-1和fcγriib-2)、和fcγriic；以及fcγriii(cd16)，其包括同种型fcγriiia(包括同种异型v158和f158)和fcγriiib(包括同种异型fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)(jefferis等人,2002,immunollett82:57-65，通过引用整体并入)；以及任何未发现的人fcγr或fcγr同种型或同种异型。fcγr可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。小鼠fcγr包括但不限于fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)、和fcγriii-2(cd16-2)、以及任何未发现的小鼠fcγr或fcγr同种型或同种异型。
本文所用的“fcrn”或“新生儿fc受体”意指结合igg抗体fc区并且至少部分由fcrn基因编码的蛋白。fcrn可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。如本领域所已知的，功能fcrn蛋白包含两条多肽，它们通常称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，重链由fcrn基因编码。除非本文中另外指明，否则fcrn或fcrn蛋白是指fcrn重链与β-2-微球蛋白的复合体。具体的感兴趣的fcrn序列显示在附图中，特别是人的。
本文所用的“亲本多肽”意指随后被修饰产生变体的未被修饰的多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽、或天然存在的多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物、或编码它的氨基酸序列。因此，本文所用的“亲本免疫球蛋白”意指被修饰产生变体的未被修饰的免疫球蛋白多肽，本文所用的“亲本抗体”意指被修饰产生变体抗体的未被修饰的抗体。应了解“亲本抗体”包括如下文中所列出的已知的商业上的重组制备的抗体。
本文所用的“位置”意指蛋白序列中的定位。位置可以顺序编号，或者根据已建立的形式例如kabat中的eu索引编号。例如，位置297是人抗体igg1中的位置。
本文所用的“靶抗原”意指被给定抗体的可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白、碳水化合物、脂、或其他化合物。
本文所用的“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。
本文所用的“可变区”意指包含一个或多个ig结构域的免疫球蛋白区域，所述一个或多个ig结构域基本上由分别构成κ、λ、和重链免疫球蛋白基因座的vκ、vλ、和/或vh基因的任一种编码。
本文所谓的“野生型或wt”意指天然存在的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。wt蛋白具有未被有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本发明涉及与fcrn的结合受调控的抗体(调控包括结合增加以及降低)。例如，在某些情况下，增加的结合导致抗体的细胞再循环并且由此增加了半衰期，例如用于治疗抗体的情况。可选择地，降低的fcrn结合是期望的，例如，对于含有放射性标记的诊断抗体或治疗抗体。此外，表现出与fcrn结合增加并且与其他fc受体例如fcγr的结合有所改变的抗体可用于本发明。因此，本发明提供了抗体。
抗体
本申请涉及包含调节与fcrn的结合的氨基酸修饰的抗体。特别感兴趣的是最低限度地包含fc区或其功能变体的抗体，所述fc区在较低的ph下表现出增加的结合亲和力，而在较高的ph下不表现出实质的结合改变。
传统的抗体结构单位通常包含四聚体。各四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(通常具有约25kda的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kda的分子量)。人轻链被分为κ和λ轻链。重链被分为μ、δ、γ、α、或ε，它们分别将抗体同种型定义为igm、igd、igg、iga、和ige。igg具有几个亚类，包括但不限于igg1、igg2、igg3、和igg4。igm具有包括但不限于igm1和igm2的亚类。因此，本文所用的“同种型”意指通过免疫球蛋白恒定区的化学和抗原特征所定义的任何免疫球蛋白亚类。已知的人免疫球蛋白同种型为igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm1、igm2、igd、和ige。
各链的氨基末端部分包括约100至110或更多个氨基酸的可变区，该可变区主要负责抗原识别。在可变区中，重链和轻链的每个v结构域集合了三个环以形成抗原结合位点。每个环称为互补决定区(后面称为“cdr”)，其中氨基酸序列的变异是最显著的。
各链的羧基末端部分定义了恒定区，该恒定区主要负责效应子功能。kabat等人收集了重链和轻链可变区的大量主要序列。根据序列的保守程度，他们将个体的主要序列分为cdr和框架，并制作了它们的列表(参见sequencesofimmunologicalinterest(具有免疫学重要性的序列),第5版,nihpublication,no.91-3242,e.a.kabat等人,其通过引用整体并入)。
在免疫球蛋白的igg亚类中，重链中具有几个免疫球蛋白结构域。本文所谓的“免疫球蛋白(ig)结构域”意指具有独特的三级结构的免疫球蛋白区域。本发明中所感兴趣的是重链结构域，包括重链恒定(ch)结构域和铰链结构域。在igg抗体的背景下，每个igg同种型具有三个ch区。因此，在igg背景下的“ch”结构域如下：“ch1”是指根据kabat中的eu索引的位置118-220，“ch2”是指根据kabat中的eu索引的位置237-340，并且“ch3”是指根据kabat中的eu索引的位置341-447。
另一类重链ig结构域是铰链区。本文所谓的“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”意指包含抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，iggch1结构域在eu位置220处结束，并且iggch2结构域在eu位置237处的残基开始。因此，对于igg，抗体铰链在本文中定义为包括位置221(igg1中的d221)至236(igg1中的g236)，其中编号根据kabat中的eu索引进行。在某些实施方式中，例如在fc区的背景下，包含较低的铰链，其中“较低的铰链”通常是指位置226或230。
本发明所特别感兴趣的是fc区。如本文所用的“fc”和“fc区”意指包含抗体的恒定区，而不包含第一恒定区免疫球蛋白结构域和在一些情况下的部分铰链的多肽。因此，fc是指iga、igd、和igg的后两个恒定区免疫球蛋白结构域；ige和igm的后三个恒定区免疫球蛋白结构域；以及这些结构域n末端的柔性铰链。对于iga和igm，fc可以包括j链。对于igg，如图1中所示，fc包含免疫球蛋白结构域c伽马2和c伽马3(cg2和cg3)以及c伽马1(cg1)和c伽马2(cg2)之间的较低的铰链区。尽管fc区的界线可以变化，但是人igg重链fc区通常被定义为包括残基c226或p230至其羧基末端，其中编号是根据kabat中的eu索引进行。如下文所述，fc可以指分离状态的这个区域，或在fc多肽背景下的这个区域。如本文所用的“fc多肽”意指构成全部或部分的fc区的多肽。fc多肽包括抗体、fc融合体、分离的fc、和fc片段。
在一些实施方式中，抗体为全长的。本文所谓的“全长抗体”意指构成天然生物学形式的抗体的结构，包括可变区和恒定区，包括一个或多个本文所列出的修饰。
可选择地，抗体可以为多种结构，包括但不限于：抗体片段、单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体(minibody)、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合体(有时称为“抗体轭合物”)以及它们每种各自的片段。
抗体片段
在一个实施方式中，抗体是抗体片段。特别感兴趣的是包含fc区、fc融合体、和重链恒定区(ch1-铰链-ch2-ch3)的抗体，还包括重链恒定区融合体。
具体的抗体片段包括但不限于：(i)包含vl、vh、cl和ch1结构域的fab片段；(ii)包含vh和ch1结构域的fd片段；(iii)包含单个抗体的vl和vh结构域的fv片段；(iv)包含单个可变区的dab片段(ward等人,1989,nature341:544-546，其通过引用整体并入本文)；(v)分离的cdr区；(vi)f(ab')2片段，包含两个连接的fab片段的二价片段；(vii)单链fv分子(scfv)，其中vh结构域和vl结构域通过肽连接子连接，该肽连接子容许两个结构域结合形成抗原结合位点(bird等人,1988,science242:423-426；huston等人,1988,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:5879-5883，它们通过引用整体并入)；(viii)双特异性单链fv(wo03/11161，通过引用并入本文)；以及(ix)“双链抗体”或“三链抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(tomlinson等人,2000,methodsenzymol.326:461-479；wo94/13804；holliger等人,1993,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6444-6448，它们都通过引用整体并入)。抗体片段可以被修饰。例如，可以通过掺入连接vh和vl结构域的二硫桥来稳定分子(reiter等人,1996,naturebiotech.14:1239-1245，通过引用整体并入)。
嵌合抗体和人源化抗体
在一些实施方式中，骨架组分可以为来自不同物种的混合物。同样地，如果蛋白为抗体，则此抗体可以为嵌合抗体和/或人源化抗体。一般来说，“嵌合抗体”和“人源化抗体”都是指组合了来自不止一个物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”在传统上包含来自小鼠(或在某些情况下为大鼠)的可变区和来自人的恒定区。“人源化抗体”一般是指具有交换为人抗体中所存在的序列的可变结构域框架区的非人抗体。一般而言，在人源化抗体中，除cdr外，整个抗体是由人来源的多核苷酸编码，或者与由人来源的多核苷酸编码的抗体在cdr之外具有同一性。一些或所有的cdr是由非人生物体来源的核酸编码的，将它们移植到人抗体可变区的β片层框架区以产生抗体，该抗体的特异性由植入的cdr决定。这类抗体的制备描述于：例如，wo92/11018；jones,1986,nature321:522-525；verhoeyen等人,1988,science239:1534-1536，它们的全文通过引用并入。通常需要将所选的受体框架残基“回复突变”为相应的供体残基以重新获得在最初的移植构建体中丢失的亲和力(us5530101；us5585089；us5693761；us5693762；us6180370；us5859205；us5821337；us6054297；us6407213，它们都通过引用整体并入)。人源化抗体最佳地还含有至少一部分免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白的恒定区，因此通常包含人fc区。人源化抗体还可以使用具有遗传工程化的免疫系统的小鼠制备。roque等人,2004,biotechnol.prog.20:639-654，其通过引用整体并入。用于人源化和改造非人抗体的多种技术和方法是本领域内所熟知的(参见tsurushita和vasquez,2004,humanizationofmonoclonalantibodies(单克隆抗体的人源化),molecularbiologyofbcells,533-545,elsevierscience(usa)；和本文所引用的参考文献，它们都通过引用整体并入)。人源化方法包括但不限于下列文献所述的方法：jones等人,1986,nature321:522-525；riechmann等人,1988；nature332:323-329；verhoeyen等人,1988,science,239:1534-1536；queen等人,1989,procnatlacadsci,usa86:10029-33；he等人,1998,j.immunol.160:1029-1035；carter等人,1992,procnatlacadsciusa89:4285-9；presta等人,1997,cancerres.57(20):4593-9；gorman等人,1991,proc.natl.acad.sci.usa88:4181-4185；o’connor等人,1998,proteineng11:321-8，它们都通过引用整体并入。人源化或降低非人抗体可变区免疫原性的其他方法可以包括表面重建方法，例如roguska等人,1994,proc.natl.acad.sci.usa91:969-973中所述的方法，所述文献通过引用整体并入。在一个实施方式中，如本领域内所已知的，亲本抗体具有成熟的亲和力。如ussn11/004,590中所述，可以采用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟。可以采用基于选择的方法使抗体可变区人源化和/或亲和力成熟，所述方法包括但不限于下列文献中所述的方法：wu等人,1999,j.mol.biol.294:151-162；baca等人,1997,j.biol.chem.272(16):10678-10684；rosok等人,1996,j.biol.chem.271(37):22611-22618；rader等人,1998,proc.natl.acad.sci.usa95:8910-8915；krauss等人,2003,proteinengineering16(10):753-759，它们都通过引用整体并入。其他人源化方法可包括仅将cdr的部分移植，包括但不限于下列文献中所述的方法：ussn09/810,510；tan等人,2002,j.immunol.169:1119-1125；depascalis等人,2002,j.immunol.169:3076-3084，它们都通过引用整体并入。
双特异性抗体
在一个实施方式中，本发明的抗体为多特异性抗体，尤其是双特异性抗体，有时还称为“双链抗体”。它们是结合两个(或更多个)不同抗原的抗体。双链抗体可以通过本领域内已知的多种方法制备(holliger和winter,1993,currentopinionbiotechnol.4:446-449，其通过引用整体并入)，例如，以化学方法制备或从杂交瘤制备。
微型抗体
在一个实施方式中，抗体是微型抗体。微型抗体是包含连接至ch3结构域的scfv的最小化抗体样蛋白。hu等人,1996,cancerres.56:3055-3061，通过引用整体并入。在一些情况下，scfv可以连接到fc区，并且可以包含一些或整个的铰链区。
人抗体
在一个实施方式中，抗体为具有至少一个本文所列出的修饰的完全的人抗体。“完全的人抗体”或“全部的人抗体”是指具有源自人染色体的具有本文所列出的修饰的抗体基因序列的人抗体。
抗体融合体
在一个实施方式中，本发明的抗体是抗体融合蛋白(有时在本文中称为“抗体轭合物”)一种类型的抗体融合体包括fc融合体，它连接了fc区与轭合配偶体。如本文所用的“fc融合体”意指其中一个或多个多肽可操作地连接至fc区的蛋白。本文中的fc融合体意指与已有技术中所用的术语“免疫粘附素”、“ig融合体”、“ig嵌合体”、和“受体球蛋白”(有时用破折号)(chamow等人,1996,trendsbiotechnol14:52-60；ashkenazi等人,1997,curropinimmunol9:195-200，它们通过引用整体并入)是同义的。fc融合体组合了免疫球蛋白fc区与融合配偶体，该融合配偶体通常可以为任何蛋白或小分子。事实上，任何蛋白或小分子都可以连接至fc以产生fc融合体。蛋白融合配偶体可以包括但不限于：任何抗体的可变区、受体的靶结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子、或一些其他的蛋白或蛋白结构域。小分子融合配偶体可以包括将fc融合体导向治疗靶的任何治疗剂。这种靶可以为疾病所涉及的任何分子，优选为胞外受体。因此，可以将igg变体连接至一个或多个融合配偶体。在一个替代性实施方式中，igg变体与另一种治疗化合物轭合或可操作地连接。治疗化合物可以为细胞毒素剂、化疗剂、毒素、放射性同位素、细胞因子或其他治疗活性剂。igg可以连接至多种非蛋白性聚合物中的一种，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
除了fc融合体之外，抗体融合体包括重链恒定区与一个或多个融合配偶体(还包括任何抗体的可变区)的融合体，而其他抗体融合体则基本上或全部为具有融合配偶体的全长抗体。在一个实施方式中，融合配偶体的作用是介导靶结合，因此其在功能上类似于抗体可变区(事实上，可以是抗体可变区)。事实上，任何蛋白或小分子都可以连接至fc以制备fc融合体(或抗体融合体)。蛋白融合配偶体可以包括但不限于：受体的靶结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子、或一些其他的蛋白或蛋白结构域。小分子融合配偶体可以包括将fc融合体导向治疗靶的任何治疗剂。这种靶可以为疾病所涉及的任何分子，优选为胞外受体。
轭合配偶体可以是蛋白性的或非蛋白性的；后者一般使用抗体上和轭合配偶体上的官能团制备。例如，连接子是本领域中已知的；例如同型或异型双功能连接子是熟知的(参见，1994piercechemicalcompanycatalog,technicalsectiononcross-linkers(pierce化学公司1994年的目录，交联剂的技术部分),第155-200页，通过引用并入本文)。
合适的轭合物包括但不限于：如下文所述的标记，药物和细胞毒素剂，包括但不限于细胞毒性药物(例如，化疗剂)或毒素或此类毒素的活性片段。适合的毒素和它们的相应片段包括白喉a链、外毒素a链、蓖麻毒素a链、相思豆毒素a链、泻果素、巴豆毒素、酚霉素、依诺霉素等。细胞毒素剂还包括放射性化学物质，它们通过将放射性同位素轭合至抗体或将放射性核素结合至已经共价连接至抗体的螯合剂来制备。其他的实施方式使用刺孢霉素、auristatins、格尔德霉素、美登素、和倍癌霉素(duocarmycin)和类似物；对于后者，参见u.s.2003/0050331a1，其通过引用整体并入。
抗体的共价修饰
抗体的共价修饰包括在本发明的范围内，并且一般但并非总是在翻译后进行。例如，通过使抗体的特定氨基酸残基与能够与所选择的侧链或n末端或c末端残基反应的有机衍生剂反应将几种类型的抗体共价修饰引入分子中。
半胱氨酰残基最通常的是与诸如氯乙酸或氯乙酰胺的α-卤代乙酸酯(和对应的胺)反应以得到羧甲基或羧氨基甲基衍生物。半胱氨酰残基还可以通过与下列物质的反应来衍生：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸、n-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚、或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑等。
组氨酰残基通过在ph5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应来衍生，因为这个试剂对组氨酰侧链是相对特异的。也可使用对-溴苯甲酰甲基溴化物；该反应优选在ph6.0下在0.1m二甲胂酸钠中进行。
赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸或其他羧酸酐反应。使用这些试剂的衍生具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。用于衍生含α氨基的残基的合适试剂包括亚氨酸酯，如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；o-甲基异脲；2,4-戊二酮；和转氨酶所催化的与乙醛酸的反应。
精氨酰残基通过与一种或几种常规试剂反应来修饰，尤其是苯乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮、和水合茚三酮。精氨酸残基的衍生需要反应在碱性条件下进行，这是因为胍官能团的pka较高。此外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基反应。
可以进行酪氨酰残基的特定修饰，尤其感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应而将光谱标记引入酪氨酰残基中。最常见的是，使用n-乙酰基咪唑和四硝基甲烷来分别形成o-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。使用125i或131i将酪氨酰残基碘化以制备用于放射性免疫测定的标记蛋白，上文所述的氯胺t法是合适的。
羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)选择性地通过与碳二亚胺(r'—n＝c＝n--r')反应来修饰，其中r和r’任选地为不同的烃基，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应而转化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。
用双官能剂进行的衍生可用于将抗体交联至水不溶性支持体基质或表面以供多种方法使用，包括下面所述的方法。常用的交联剂包括：例如，1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷；戊二醛；n-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮水杨酸的酯；同型双官能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、和双官能的马来酰亚胺，如双-n-马来酰亚胺基-1,8-辛烷。诸如甲基-3-[(对叠氮苯基)二硫基]丙亚胺酯的衍生剂会产生光活化的中间体，该中间体能够在存在光的条件下形成交联。可选择地，可以采用反应性的水不溶性基质如溴化氰活化的碳水化合物和美国专利第3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537、和4,330,440号中所述的反应性基质来进行蛋白固定，所述专利都通过引用整体并入。
谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基经常分别脱酰胺化为对应的谷氨酰和天冬胺酰残基。可选择地，这些残基在弱酸条件下进行脱酰胺化。这些残基的任一形式都属于本发明的范围。其他修饰包括：脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸、和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(t.e.creighton,proteins:structureandmolecularproperties(蛋白质：结构和分子特性),w.h.freeman&co.,sanfrancisco,第79-86页[1983]，通过引用整体并入)；n-末端胺的乙酰化；和任何c-末端羧基的酰胺化。
糖基化
另一种类型的共价修饰是糖基化。在另一个实施方式中，本文所公开的igg变体可以被修饰以包含一种或多种工程化糖形。如本文所用的“工程化糖形”意指共价连接至igg的碳水化合物组合物，其中所述碳水化合物组成在化学上与亲本igg的碳水化合物组成不同。工程化糖形可用于多种目的，包括但不限于增强或降低效应子功能。工程化糖形可以通过许多本领域内已知的方法制备(
多肽的糖基化通常为n-连接的或o-连接的。n-连接的是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。其中x为除脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸，是碳水化合物部分与天冬酰氨侧链酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列的任一种的存在产生可能的糖基化位点。o-连接的糖基化是指糖n-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，所述羟基氨基酸最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
抗体中糖基化位点的添加是通过改变氨基酸序列使其含有上述三肽序列的一种或多种来方便地完成(用于n-连接的糖基化位点)。改变还可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加到初始序列或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代初始序列来进行(用于o-连接的糖基化位点)。为了方便，抗体氨基酸序列优选通过在dna水平的改变来改变，尤其是通过在预选的碱基突变编码靶多肽的dna使得产生将翻译成所需的氨基酸的密码子。
增加抗体上碳水化合物部分数目的其他方法为将糖苷化学偶联或酶促偶联至蛋白。这些方法的有利之处在于它们不需要在宿主细胞中产生具有用于n-连接的和o-连接的糖基化的糖基化能力的蛋白。依据所用的偶联方式，糖可以连接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，如半胱氨酸的游离巯基；(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸、或羟脯氨酸的游离羟基；(e)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述在wo87/05330以及aplin和wriston,1981,crccrit.rev.biochem.,第259-306页，它们都通过引用整体并入。
可以通过化学法或酶法完成初始抗体上所存在的碳水化合物部分的移除。化学去糖基化需要将蛋白暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。这种处理导致了除了连接糖(n-乙酰基葡糖胺或n-乙酰基半乳糖胺)之外大部分或所有的糖被裂解，而多肽则保持完整。化学去糖基化描述在hakimuddin等人,1987,arch.biochem.biophys.259:52和edge等人,1981,anal.biochem.118:131中，它们通过引用整体并入。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用多种内切和外切糖苷酶来达成，如thotakura等人,1987,meth.enzymol.138:350中所述，其全文通过引用并入。可以通过使用化合物衣霉素来防止在可能的糖基化位点的糖基化，如duskin等人,1982,j.biol.chem.257:3105中所述，其全文通过引用并入。衣霉素阻断蛋白-n-糖苷键形成。
另一种类型的抗体共价修饰包括将抗体连接至多种非蛋白性的聚合物上，包括但不限于，多种多元醇，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，这通过下列文献中所述的方法进行：例如，2005-2006pegcatalogfromnektartherapeutics(2005-2006年来自nektar治疗剂的peg目录)(可得自nektar网站)美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337，它们都通过引用全文并入。此外，如本领域中已知的，氨基酸取代可以在抗体中的多个位置进行，以促进诸如peg的聚合物的添加。参见，例如美国公开第2005/0114037a1号，其通过引用整体并入。
标记的抗体
在一些实施方式中，本发明抗体的共价修饰包括添加一个或多个标记。在一些情况下，考虑的是抗体融合体。术语“标记基团”意指任何检测标记。在一些实施方式中，标记基团经由各种长度的间隔子臂偶联至抗体上以降低可能的位阻。标记蛋白的各种方法是本领域内已知的，可以使用它们进行本发明。
一般来讲，标记依据检测它们的测定分为多种类型：a)同位素标记，它可以是放射性同位素或重同位素；b)磁性标记(例如磁性粒子)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶；碱性磷酸酶)；e)生物素化基团；和f)被二级报道物所识别的预先确定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些实施方式中，标记基团经由各种长度的间隔子臂偶联至抗体上以降低可能的位阻。标记蛋白的各种方法是本领域内已知的，可以使用它们进行本发明。
具体的标记包括光学染料，包括但不限于：生色团、磷光体和荧光团，其中后一种具体用于许多情况中。荧光团可以为“小分子”荧光或蛋白性荧光。
所谓“荧光标记”意指可以经由其固有的荧光特性检测的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于：荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、藻红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石绿(malacitegreen)、均二苯乙烯、荧光黄、cascadebluej、德克萨斯红、iaedans、edans、bodipyfl、lc红640、cy5、cy5.5、lc红705、俄勒冈绿(oregongreen)、alexa-fluor染料(alexafluor350、alexafluor430、alexafluor488、alexafluor546、alexafluor568、alexafluor594、alexafluor633、alexafluor660、alexafluor680)、cascadeblue、cascadeyellow和r-藻红蛋白(pe)(molecularprobes,eugene,or)、fitc、罗丹明、和德克萨斯红(pierce,rockford,il)、cy5、cy5.5、cy7(amershamlifescience,pittsburgh,pa)。包括荧光团的合适的光学染料描述在richardp.haugland的melecularprobeshandbook(分子探针手册)中，该手册通过引用整体并入。
合适的蛋白性荧光标记还包括但不限于：绿色荧光蛋白，包括renilla、ptilosarcus、或aequorea种类的gfp(chalfie等人,1994,science263:802-805)；egfp(clontechlaboratories,inc.,genbank登录号u55762)；蓝色荧光蛋白(bfp,quantumbiotechnologies,inc.1801demaisonneuveblvd.west,8thfloor,montreal,quebec,canadah3h1j9；stauber,1998,biotechniques24:462-471；heim等人,1996,curr.biol.6:178-182)；加强型黄色荧光蛋白(eyfp,clontechlaboratories,inc.)；荧光素酶(ichiki等人,1993,j.immunol.150:5408-5417)；β半乳糖苷酶(nolan等人,1988,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2603-2607)和renilla(wo92/15673、wo95/07463、wo98/14605、wo98/26277、wo99/49019、美国专利第5292658、5418155、5683888、5741668、5777079、5804387、5874304、5876995、5925558号)。本段中上面所引用的所有参考文献特意通过引用并入本文。
igg变体
在一个实施方式中，本发明提供变体igg蛋白。最低限度下，igg变体包含含有重链ch2-ch3区的抗体片段。此外，合适的igg变体包含fc结构域(例如，包括较低的铰链区)，而且包含重链恒定区(ch1-铰链-ch2-ch3)的igg变体也可用于本发明，它们都可以与融合配偶体融合。
igg变体包括相对于亲本igg多肽的一种或多种氨基酸修饰，在一些情况下为相对于野生型igg的一种或多种氨基酸修饰。igg变体可以具有一种或多种优化的性质。igg变体由于至少一个氨基酸修饰而与其亲本igg的氨基酸序列不同。因此，igg变体与其亲本相比具有至少一个氨基酸修饰。可选择地，igg变体与亲本相比可以具有多于一个氨基酸修饰，例如与亲本相比具有约1至50个氨基酸修饰，优选约1至10个氨基酸修饰，最优选约1至约5个氨基酸修饰。
因此，igg变体的序列和亲本fc多肽的序列是基本上同源的。例如，本文中的变体igg变体序列具有与亲本igg变体序列约80％的同源性，优选至少约90％的同源性，并且最优选至少约95％的同源性。修饰可以使用分子生物学以遗传方法进行，或者可以酶促或化学方法进行。
抗体的靶抗原
事实上，任何抗原都可以被igg变体靶向，包括但不限于属于下列靶抗原中的蛋白、亚基、结构域、基序、和/或表位，所述靶抗原包括可溶性因子如细胞因子和膜结合因子，所述膜结合因子包括跨膜受体：17-ia、4-1bb、4dc、6-酮-pgf1a、8-异-pgf2a、8-氧-dg、a1腺苷受体、a33、ace、ace-2、激活蛋白、激活蛋白a、激活蛋白ab、激活蛋白b、激活蛋白c、激活蛋白ria、激活蛋白riaalk-2、激活蛋白ribalk-4、激活蛋白riia、激活蛋白riib、adam、adam10、adam12、adam15、adam17/tace、adam8、adam9、adamts、adamts4、adamts5、地址素、afgf、alcam、alk、alk-1、alk-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-v/β-1拮抗物、ang、ang、apaf-1、ape、apj、app、april、ar、arc、art、artemin、抗id、aspartic、心房利钠因子、av/b3整联蛋白、axl、b2m、b7-1、b7-2、b7-h、b-淋巴细胞刺激因子(blys)、bace、bace-1、bad、baff、baff-r、bag-1、bak、bax、bca-1、bcam、bcl、bcma、bdnf、b-ecgf、bfgf、bid、bik、bim、blc、bl-cam、blk、bmp、bmp-2bmp-2a、bmp-3成骨蛋白、bmp-4bmp-2b、bmp-5、bmp-6vgr-1、bmp-7(op-1)、bmp-8(bmp-8a、op-2)、bmpr、bmpr-ia(alk-3)、bmpr-ib(alk-6)、brk-2、rpk-1、bmpr-ii(brk-3)、bmps、b-ngf、bok、铃蟾肽、骨源性神经营养因子、bpde、bpde-dna、btc、补体因子3(c3)、c3a、c4、c5、c5a、c10、ca125、cad-8、降钙素、camp、癌胚抗原(cea)、癌相关抗原、组织蛋白酶a、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c/dppi、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶h、组织蛋白酶l、组织蛋白酶o、组织蛋白酶s、组织蛋白酶v、组织蛋白酶x/z/p、cbl、cci、cck2、ccl、ccl1、ccl11、ccl12、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、ccl3、ccl4、ccl5、ccl6、ccl7、ccl8、ccl9/10、ccr、ccr1、ccr10、ccr10、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、cd1、cd2、cd3、cd3e、cd4、cd5、cd6、cd7、cd8、cd10、cd11a、cd11b、cd11c、cd13、cd14、cd15、cd16、cd18、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd25、cd27l、cd28、cd29、cd30、cd30l、cd32、cd33(p67蛋白)、cd34、cd38、cd40、cd40l、cd44、cd45、cd46、cd49a、cd52、cd54、cd55、cd56、cd61、cd64、cd66e、cd74、cd80(b7-1)、cd89、cd95、cd123、cd137、cd138、cd140a、cd146、cd147、cd148、cd152、cd164、ceacam5、cftr、cgmp、cinc、肉毒杆菌(clostridiumbotulinum)毒素、产气荚膜芽孢杆菌(clostridiumperfringen)毒素、ckb8-1、clc、cmv、cmvul、cntf、cntn-1、cox、c-ret、crg-2、ct-1、ctack、ctgf、ctla-4、cx3cl1、cx3cr1、cxcl、cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl4、cxcl5、cxcl6、cxcl7、cxcl8、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl15、cxcl16、cxcr、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、dan、dcc、dcr3、dc-sign、衰变加速因子、des(1-3)-igf-i(脑igf-1)、dhh、地高辛、dnam-1、dna酶、dpp、dppiv/cd26、dtk、ecad、eda、eda-a1、eda-a2、edar、egf、egfr(erbb-1)、ema、emmprin、ena、内皮素受体、脑啡肽酶、enos、eot、嗜酸细胞活化趋化因子1、epcam、ephrinb2/ephb4、epo、ercc、内皮细胞选凝素、et-1、因子iia、因子vii、因子viiic、因子ix、成纤维细胞活化蛋白(fap)、fas、fcr1、fen-1、铁蛋白、fgf、fgf-19、fgf-2、fgf3、fgf-8、fgfr、fgfr-3、纤维蛋白、fl、flip、flt-3、flt-4、促卵泡激素、分形素(fractalkine)、fzd1、fzd2、fzd3、fzd4、fzd5、fzd6、fzd7、fzd8、fzd9、fzd10、g250、gas6、gcp-2、gcsf、gd2、gd3、gdf、gdf-1、gdf-3(vgr-2)、gdf-5(bmp-14、cdmp-1)、gdf-6(bmp-13、cdmp-2)、gdf-7(bmp-12、cdmp-3)、gdf-8(肌肉生长抑制素(myostatin))、gdf-9、gdf-15(mic-1)、gdnf、gdnf、gfap、gfra-1、gfr-α1、gfr-α2、gfr-α3、gitr、胰高血糖素、glut4、糖蛋白iib/iiia(gpiib/iiia)、gm-csf、gp130、gp72、gro、生长激素释放因子、半抗原(np-capornip-cap)、hb-egf、hcc、hcmvgb包膜糖蛋白、hcmv)gh包膜糖蛋白、hcmvul、造血生长因子(hgf)、hepbgp120、类肝素酶、her2、her2/neu(erbb-2)、her3(erbb-3)、her4(erbb-4)、单纯孢疹病毒(hsv)gb糖蛋白、hsvgd糖蛋白、hgfa、高分子量黑素瘤相关抗原(hmw-maa)、hivgp120、hiviiibgp120v3loop、hla、hla-dr、hm1.24、hmfgpem、hrg、hrk、人心肌肌球蛋白、人巨细胞病毒(hcmv)、人生长激素(hgh)、hvem、i-309、iap、icam、icam-1、icam-3、ice、icos、ifng、ig、iga受体、ige、igf、igf结合蛋白、igf-1r、igfbp、igf-i、igf-ii、il、il-1、il-1r、il-2、il-2r、il-4、il-4r、il-5、il-5r、il-6、il-6r、il-8、il-9、il-10、il-12、il-13、il-15、il-18、il-18r、il-23、干扰素(inf)-α、inf-β、inf-γ、抑制素、inos、胰岛素a-链、胰岛素b-链、胰岛素样生长因子1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5(αv)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、ip-10、i-tac、je、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶l1、激肽释放酶l2、激肽释放酶l3、激肽释放酶l4、kc、kdr、角质形成细胞生长因子(kgf)、层粘连蛋白5、lamp、lap、lap(tgf-1)、潜伏性tgf-1、潜伏性tgf-1bp1、lbp、ldgf、lect2、lefty、路易斯(lewis)-y抗原、路易斯-y相关抗原、lfa-1、lfa-3、lfo、lif、light、脂蛋白、lix、lkn、lptn、l-选择蛋白、lt-a、lt-b、ltb4、ltbp-1、肺表面活性物质、黄体生成素、淋巴毒素β受体、mac-1、madcam、mag、map2、marc、mcam、mcam、mck-2、mcp、m-csf、mdc、mer、metalloproteases、mgdf受体、mgmt、mhc(hla-dr)、mif、mig、mip、mip-1-α、mk、mmac1、mmp、mmp-1、mmp-10、mmp-11、mmp-12、mmp-13、mmp-14、mmp-15、mmp-2、mmp-24、mmp-3、mmp-7、mmp-8、mmp-9、mpif、mpo、msk、msp、粘蛋白(muc1)、muc18、苗勒(mullerian)抑制物质、mug、musk、naip、nap、ncad、n-钙粘蛋白、nca90、ncam、ncam、中性溶酶、神经营养蛋白-3、-4或-6、neurturin、神经元生长因子(ngf)、ngfr、ngf-β、nnos、no、nos、npn、nrg-3、nt、ntn、ob、ogg1、opg、opn、osm、ox40l、ox40r、p150、p95、padpr、甲状旁腺激素、parc、parp、pbr、pbsf、pcad、p-钙粘蛋白、pcna、pdgf、pdgf、pdk-1、pecam、pem、pf4、pge、pgf、pgi2、pgj2、pin、pla2、胎盘碱性磷酸酶(plap)、plgf、plp、pp14、胰岛素原、松弛素原、蛋白c、ps、psa、psca、前列腺特异性膜抗原(psma)、pten、pthrp、ptk、ptn、r51、rank、rankl、rantes、rantes、松弛素a-链、松弛素b-链、肾素、呼吸道合胞病毒(rsv)f、rsvfgp、ret、类风湿因子、rlip76、rpa2、rsk、s100、scf/kl、sdf-1、serine、血清白蛋白、sfrp-3、shh、sigirr、sk-1、slam、slpi、smac、smdf、smoh、sod、sparc、stat、steap、steap-ii、tace、taci、tag-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、tarc、tca-3、t-细胞受体(例如，t-细胞受体α/β)、tdt、teck、tem1、tem5、tem7、tem8、tert、睾丸plap-样碱性磷酸酶、tfr、tgf、tgf-α、tgf-β、tgf-β泛特异性(panspecific)、tgf-βri(alk-5)、tgf-βrii、tgf-βriib、tgf-βriii、tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4、tgf-β5、凝血酶、胸腺ck-1、促甲状腺激素、tie、timp、tiq、组织因子、tmeff2、tmpo、tmprss2、tnf、tnf-α、tnf-αβ、tnf-β2、tnfc、tnf-ri、tnf-rii、tnfrsf10a(trailr1apo-2、dr4)、tnfrsf10b(trailr2dr5、killer、trick-2a、trick-b)、tnfrsf10c(trailr3dcr1、lit、trid)、tnfrsf10d(trailr4dcr2、trundd)、tnfrsf11a(rankodfr、trancer)、tnfrsf11b(opgocif、tr1)、tnfrsf12(tweakrfn14)、tnfrsf13b(taci)、tnfrsf13c(baffr)、tnfrsf14(hvematar、hvea、lightr、tr2)、tnfrsf16(ngfrp75ntr)、tnfrsf17(bcma)、tnfrsf18(gitraitr)、tnfrsf19(troytaj、trade)、tnfrsf19l(relt)、tnfrsf1a(tnfricd120a、p55-60)、tnfrsf1b(tnfriicd120b、p75-80)、tnfrsf26(tnfrh3)、tnfrsf3(ltbrtnfriii、tnfcr)、tnfrsf4(ox40act35、txgp1r)、tnfrsf5(cd40p50)、tnfrsf6(fasapo-1、apt1、cd95)、tnfrsf6b(dcr3m68、tr6)、tnfrsf7(cd27)、tnfrsf8(cd30)、tnfrsf9(4-1bbcd137、ila)、tnfrsf21(dr6)、tnfrsf22(dctrailr2tnfrh2)、tnfrst23(dctrailr1tnfrh1)、tnfrsf25(dr3apo-3、lard、tr-3、tramp、wsl-1)、tnfsf10(trailapo-2配体、tl2)、tnfsf11(trance/rank配体odf、opg配体)、tnfsf12(tweakapo-3配体、dr3配体)、tnfsf13(apriltall2)、tnfsf13b(baffblys、tall1、thank、tnfsf20)、tnfsf14(lighthvem配体、ltg)、tnfsf15(tl1a/vegi)、tnfsf18(gitr配体aitr配体、tl6)、tnfsf1a(tnf-a连接素(conectin)、dif、tnfsf2)、tnfsf1b(tnf-blta、tnfsf1)、tnfsf3(ltbtnfc、p33)、tnfsf4(ox40配体gp34、txgp1)、tnfsf5(cd40配体cd154、gp39、higm1、imd3、trap)、tnfsf6(fas配体apo-1配体、apt1配体)、tnfsf7(cd27配体cd70)、tnfsf8(cd30配体cd153)、tnfsf9(4-1bb配体cd137配体)、tp-1、t-pa、tpo、trail、trailr、trail-r1、trail-r2、trance、转移受体、trf、trk、trop-2、tsg、tslp、肿瘤相关抗原ca125、表达路易斯y相关碳水化合物的肿瘤相关抗原、tweak、txb2、ung、upar、upar-1、尿激酶、vcam、vcam-1、vecad、ve-钙粘蛋白、ve-钙粘蛋白-2、vefgr-1(flt-1)、vegf、vegfr、vegfr-3(flt-4)、vegi、vim、病毒抗原、vla、vla-1、vla-4、vnr整联蛋白、冯维勒布兰德(vonwillebrand)因子、wif-1、wnt1、wnt2、wnt2b/13、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9a、wnt9b、wnt10a、wnt10b、wnt11、wnt16、xcl1、xcl2、xcr1、xcr1、xedar、xiap、xpd、以及激素和生长因子的受体。
本领域内的技术人员应了解上述所列的靶不只是指具体的蛋白和生物分子，而是指生物化学通路或包含它们的通路。例如，提到ctla-4作为靶抗原意指构成t细胞共刺激通路的配体和受体也是靶，所述配体和受体包括ctla-4、b7-1、b7-2、cd28、以及任何其他未发现的配体或受体。因此，如本文所用的靶不仅是指具体的生物分子，而是指与所述靶相互作用的一组蛋白和所述靶所属于的生物化学通路的成员。本领域的技术人员还应了解上述靶抗原、结合它们的配体或受体、或它们的相应生物化学通路的其他成员中的任何一种可以可操作地连接至本发明的fc变体以产生fc融合体。因此，例如，靶向egfr的fc融合体可以通过将fc变体可操作地连接至egf、tgf-b、或发现的或未发现的结合egfr的任何其他配体来构建。因此，本发明的fc变体可以可操作地连接至egfr以产生结合egf、tgf-b、或发现的或未发现的结合egfr的任何其他配体的fc融合体。因此，事实上，任何多肽，无论是配体、受体还是一些其他的蛋白或蛋白结构域，包括但不限于上述靶和构成它们的相应生物化学通路的蛋白，都可以可操作地连接至本发明的fc变体以得到fc融合体。
合适抗原的选择取决于所需的应用。对于抗癌治疗，期望具有表达限制在癌细胞内的靶。已证明特别适于抗体治疗的一些靶是具有信号传导功能的那些。其他治疗抗体通过抑制受体与其轭合配体之间的结合阻断受体的信号传导来发挥其作用。治疗抗体的另一个作用机制是引起受体下调。其他抗体不通过它们的靶抗原的信号传导起作用。在一些情况下，使用针对传染病的抗体。
在一个实施方式中，将本发明的fc变体整合到抗细胞因子的抗体中。可选择地，将fc变体与细胞因子融合或轭合。如本文所用的“细胞因子”意指用于由一个细胞群释放的作为细胞间调节物作用于另一细胞的蛋白的通用术语。例如，penichet等人,2001,jimmunolmethods248:91-101中所述，其特意通过引用并入，细胞因子可以与抗体融合以提供许多期望的特性。这些细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子、和传统的多肽激素。细胞因子中包括：生长激素，如人生长激素、n-甲硫氨酰基人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)、和黄体生成素(lh)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒抑制物质；小鼠促性腺素相关肽；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(tpo)；神经生长因子，如ngf-β；血小板生长因子；转化生长因子(tgf)，如tgf-α和tgf-β；胰岛素样生长因子-i和胰岛素样生长因子-ii；促红细胞生成素(epo)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(csfs)，如巨噬细胞-csf(m-csf)、粒细胞-巨噬细胞-csf(gm-csf)、和粒细胞-csf(g-csf)；白细胞介素(il)，如il-1、il-1α、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12；il-15，一种如tnfα或tgf-β的肿瘤坏死因子；c5a；以及其他多肽因子，包括lif和kit配体(kl)。如本文所用的术语细胞因子包括来自天然来源或重组细胞培养物的蛋白和天然序列细胞因子的生物活性等同物。
细胞因子和可溶性靶如tnf超家族成员是用于本发明变体的优选靶。例如，抗vegf、抗ctla-4、和抗tnf抗体或它们的片段是用于增加fcrn结合的fc变体的特别好的抗体。针对这些靶的治疗剂常涉及到自身免疫性疾病的治疗，并且需要在长的时间期间内进行多次注射。因此，由本发明的变体所实现的较长的血清半衰期和较低频率的治疗是特别优选的。
已经被批准用于临床试验或正在开发的许多抗体和fc融合体可获益于本发明的fc变体。这些抗体和fc融合体在本文中称为“临床产品和候选物”。因此，在优选的实施方式中，本发明的fc多肽可用于一系列的临床产品和候选物中。例如，靶向cd20的许多抗体可受益于本发明的fc多肽。例如，本发明的fc多肽可用于基本上与下列物质类似的抗体：利妥昔单抗(
可以将本发明的fc多肽整合到上述临床候选物和产品中，或者整合到基本上与它们类似的抗体和fc融合体中。可以将本发明的fc多肽整合到人源化、亲和力成熟、工程化、或以一些其他方式修饰的形式中的上述临床候选物和产品中。
在一个实施方式中，本发明的fc多肽用于治疗自身免疫适应症、炎性适应症、或移植适应症。与这些疾病相关的靶抗原和临床产品和候选物包括但不限于：抗α4β7整联蛋白抗体，如ldp-02；抗β2整联蛋白抗体，如ldp-01；抗补体(c5)抗体，如5g1.1；抗cd2抗体，如bti-322、medi-507；抗cd3抗体，如okt3；smart抗cd3、抗cd4抗体，如idec-151、mdx-cd4、okt4a；抗cd11a抗体；抗cd14抗体，如ic14；抗cd18抗体；抗cd23抗体，如idec152；抗cd25抗体，如赛尼哌；抗cd40l抗体，如5c8、antova、idec-131；抗cd64抗体，如mdx-33；抗cd80抗体，如idec-114；抗cd147抗体，如abx-cbl；抗内皮细胞选凝素抗体，如cdp850；抗gpiib/iiia抗体，如reopro/阿昔单抗；抗icam-3抗体，如icm3；抗ice抗体，如vx-740；抗fcr1抗体，如mdx-33；抗ige抗体，如rhumab-e25；抗il-4抗体，如sb-240683；抗il-5抗体，如sb-240563、sch55700；抗il-8抗体，如abx-il8；抗干扰素γ抗体；抗tnf(tnf、tnfa、tnfa、tnf-α)抗体，如cdp571、cdp870、d2e7、英夫利昔单抗、mak-195f；和抗vla-4抗体，如antegren。
本发明的fc变体，如与fcrn的结合增加的那些，可用于tnf抑制剂分子中以提供增强的特性。可用的tnf抑制剂分子包括抑制哺乳动物中tnf-α作用的任何分子。合适的实例包括fc融合体
在一些实施方式中，使用抗传染病的抗体。抗真核细胞的抗体包括靶向酵母细胞的抗体，所述酵母细胞包括但不限于：酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、多形汉森酵母(hansenulapolymorpha)、脆壁克鲁维酵母(kluyveromycesfragilis)和乳酸克鲁维酵母(k.lactis)、季也蒙毕赤酵母(pichiaguilliermondii)和巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)、和耶罗威亚解脂酵母(yarrowialipolytica)。
也可以使用抗其他真菌细胞的抗体，包括与下列菌株相关的靶抗原：念珠菌属菌株，包括光滑念珠菌(candidaglabrata)、白色念珠菌(candidaalbicans)、克鲁斯念珠菌(c.krusei)、葡萄牙念珠菌(c.lusitaniae)和麦芽糖念珠菌(c.maltosa)；以及曲霉属(aspergillus)、隐球菌属(cryptococcus)、组织胞浆菌属(histoplasma)、球孢子菌属(coccidioides)、芽生菌属(blastomyces)、和青霉菌属(penicillium)等。
直接针对与原生动物相关的靶抗原的抗体包括但不限于与下列原生动物有关的抗体：锥虫属(trypanosoma)；利什曼原虫属(leishmania)，包括杜氏利什曼原虫(leishmaniadonovani)；疟原虫属(plasmodiumspp.)；卡氏肺囊虫(pneumocystiscarinii)、小球隐孢子虫(cryptosporidiumparvum)、兰伯贾第虫(giardialamblia)、溶组织内阿米巴(entamoebahistolytica)、和卡耶塔环孢子虫(cyclosporacayetanensis)。
也可使用抗原核抗原的抗体，包括抗合适的细菌的抗体，合适的细菌如致病的和不致病的原核生物，包括但不限于：芽孢杆菌属(bacillus)，包括炭疽杆菌(bacillusanthracis)；弧菌属(vibrio)，例如霍乱弧菌(v.cholerae)；埃希氏菌属(escherichia)，例如肠毒性的大肠杆菌(e.coli)；志贺氏菌属(shigella)，例如，痢疾志贺氏菌(s.dysenteriae)；沙门氏菌属(salmonella)，例如，伤寒沙门氏菌(s.typhi)；分支杆菌属(mycobacterium)，例如，结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、麻风分支杆菌(m.leprae)；梭状芽孢杆菌属(clostridium)，例如肉毒杆菌(c.botulinum)、破伤风杆菌(c.tetani)、艰难梭菌(c.difficile)、产气荚膜杆菌(c.perfringens)；棒杆菌属(cornyebacterium)，例如白喉棒状杆菌(c.diphtheriae)；链球菌属(streptococcus)，酿脓链球菌(s.pyogenes)、肺炎链球菌(s.pneumoniae)；葡萄球菌属(staphylococcus)，例如金黄色葡萄球菌(s.aureus)；嗜血杆菌属(haemophilus)，例如，流感嗜血杆菌(h.influenzae)；奈瑟氏菌属(neisseria)，例如，脑膜炎奈瑟氏球菌(n.meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(n.gonorrhoeae)；耶尔森氏菌属(yersinia)，例如，y.lamblia、鼠疫耶尔森氏菌(y.pestis)；假单胞菌属(pseudomonas)，例如绿脓假单胞菌(p.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(p.putida)；衣原体属(chlamydia)，例如，沙眼衣原体(c.trachomatis)；博德特氏菌属(bordetella)，例如百日咳博德特氏菌(b.pertussis)；密螺旋体属(treponema)，例如，梅毒密螺旋体(t.palladium)；炭疽芽孢杆菌(b.anthracis)、鼠疫耶尔森氏菌、布鲁氏菌属(brucellaspp.)、土拉热弗朗西丝氏菌(f.tularensis)、鼻疽假单胞菌(b.mallei)、类鼻疽假单胞菌(b.pseudomallei)、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、肉毒杆菌、沙门氏菌属(salmonellaspp.)、sebv.霍乱毒素b、大肠杆菌o157:h7、李斯特菌属(listeriaspp.)、白色毛孢子菌(trichosporonbeigelii),红酵母属(rhodotorulaspecies)、异常汉森酵母(hansenulaanomala)、肠杆菌属(enterobactersp.)、克雷伯氏菌属(klebsiellasp.)、李斯特菌属(listeriasp.)、支原菌属(mycoplasmasp.)等。
在一些方面，抗体是针对病毒感染的，这些病毒包括但不限于：包括正粘液病毒(例如，流感病毒)、副粘液病毒(例如，呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒)、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼肠孤病毒、披膜病毒(例如，风疹病毒)、细小病毒、痘病毒(例如，类天花病毒、痘苗病毒)、肠道病毒(例如，脊髓灰质炎病毒、柯萨奇肠道病毒)、肝炎病毒(包括甲型、乙型和丙型)、疱疹病毒(例如，单纯孢疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、eb病毒)、轮状病毒、诺瓦克(norwalk)病毒、汉坦病毒、沙粒病毒、杆状病毒(例如，狂犬病毒)、逆转录病毒(包括hiv、htlv-i和htlv-ii)、乳多泡病毒(例如，乳头瘤病毒)、多瘤病毒、和细小核糖核酸病毒等。
优化的igg变体特性
本申请还提供经过优化而具有多种治疗相关特性的igg变体。被工程化或预测显示一种或多种优化的特性的igg变体在本文中称为“优化的igg变体”。可以被优化的最优选特性包括但不限于增强或降低fcrn亲和力并增加或降低体内半衰期。合适的实施方式包括显出如下特性的抗体：在较低的ph下，如在与内体相关的ph如ph6.0下与fcrn结合亲和力增加，而在较高的ph如7.4下保持较低的亲和力，从而容许进入内体的摄取增加，但释放速率则正常。类似地，这些具有被调控的fcrn结合的抗体可以任选地具有其他期望的特性，例如，被调控的fcγr结合，如在u.s.s.n.11/174,287、11/124,640、10/822,231、10/672,280、10/379,392、和2005年10月21日提交的申请号为11/256,060且题目为“具有优化的效应子功能的igg免疫球蛋白变体”的专利申请中所述的。也就是说，优化的特性还包括但不限于对fcγr的亲和力增强或减弱。在一任选的实施方式中，igg变体被优化为具有除了fcrn结合特性之外，还具有增强的对人活化fcγr，优选fcγriiia的亲和力。在又一任选的替代性实施方式中，igg变体被优化为具有降低的对人抑制性受体fcγriib的亲和力。也就是说，具体的实施方式涵盖了显示增加的与fcrn的结合和增加的与fcγriiia的结合的抗体的用途。其他实施方式利用了显示增加的与fcrn的结合和增加的与fcγriiia的结合的抗体的用途。预计这些实施方式在人中提供具有增强的治疗特性例如增强的效应子功能和较高的抗癌效力的igg多肽。在替代性实施方式中，igg变体被优化为具有增加的或降低的对fcrn的亲和力和增加的或降低的对人fcγr的亲和力，人fcγr包括但不限于fcγri、fcγriia、fcγriib、fcγriic、fcγriiia、和fcγriiib，包括它们的等位基因变异。预计这些实施方式在人中提供具有增强的治疗特性例如增强的血清半衰期和降低的效应子功能的igg多肽。在其他实施方式中，igg变体提供增强的对fcrn的亲和力和增强的对一种或多种fcγr的亲和力，而降低的对一种或多种其他fcγr的亲和力。例如，igg变体可以具有增强的与fcrn和fcγriiia的结合，而降低的与fcγriiib的结合。可选择地，igg变体可以具有降低的与fcrn和与fcγr结合。在另一实施方式中，igg变体可以具有降低的对fcrn的亲和力和增强的对fcγriib的亲和力，而降低的对与一种或多种活化fcγr的亲和力。在另一实施方式中，igg变体可以具有增加的血清半衰期和降低的效应子功能。
优选的实施方式包括与人fcrn和fcγr结合的优化，然而，在替代性实施方式中，igg变体具有增强的或降低的对来自非人生物体的fcrn和fcγr的亲和力，非人生物体包括但不限于啮齿动物和非人的灵长类。被优化用于结合非人fcrn的igg变体可用于实验中。例如，可以使用用于多种疾病的小鼠模型，该小鼠模型能够测试给定药物候选物的特性，如效力、毒性和药代动力学特性。如本领域中所已知的，可以将癌细胞移植或注入小鼠以模拟人的癌症，此过程称为异种移植。包括被优化用于fcrn的igg变体的igg变体的测试可以提供关于蛋白的清除特征、其清除机制等的有价值信息。还可以优化igg变体以具有增强糖基化形式的官能度和/或溶解特性。fc配体包括但不限于：fcrn、fcγr、c1q、和蛋白a和g，它可以来自任何来源，包括但不限于：人、小鼠、大鼠、兔、或猴，优选为人。在替代性优选实施方式中，将igg变体优化为比亲本igg变体的糖基化形式更稳定和/或更可溶。
igg变体可以包括调控与非fcrn和fcγr的fc配体之间的相互作用的修饰，所述非fcrn和fcγr的fc配体包括但不限于补体蛋白和fc受体同源物(fcrh)。fcrh包括但不限于fcrh1、fcrh2、fcrh3、fcrh4、fcrh5、和fcrh6(davis等人,2002,immunol.reviews190:123-136，其通过引用整体并入)。
优选地，igg变体的fc配体特异性将决定它的治疗效用。用于治疗目的的给定igg变体的效用取决于靶抗原的表位或形式以及所治疗的疾病或适应症。对于大多数的靶和适应症，增强的fcrn结合可能是优选的，因为增强的fcrn结合可以导致血清半衰期的增加。较长的血清半衰期容许治疗剂较低频率的给药或较少给药。这在治疗剂是为了响应需要重复施用的适应症而提供时是尤其优选的。对于某些靶和适应症，降低的fcrn亲和力可能是优选的。这在期望变体fc具有增强的清除率或降低的血清半衰期时，例如在用作成像剂或辐射治疗剂的fc多肽中时是尤其优选的。
可以使用包括这样的igg变体的igg变体：提供增强的对fcrn的亲和力和对增强的活化fcγr的亲和力和/或降低的对抑制性fcγr的亲和力。对于某些靶和适应症，还有利的是使用对不同的活化fcγr提供不同的选择性的igg变体，例如，在一些情况下可能期望增强与fcγriia和fcγriiia而非fcγri的结合，而在其他情况下，仅增强与fcγriia的结合可能是优选的。对于某些靶和适应症，可能优选的是利用改变fcrn结合并增强fcγr介导的效应子功能和补体介导的效应子功能二者的igg变体，而对于其他情况下，可能有利的是利用增强fcrn结合或血清半衰期以及fcγr介导的或补体介导的效应子功能的igg变体。对于某些靶或癌症适应症，可能有利的是降低或消除一个或多个效应子功能，例如通过敲除与c1q、一种或多种fcγr、fcrn、或一种或多种其他fc配体的结合进行。对于其他靶和适应症，可能优选的是利用提供与抑制性fcγriib结合增强，而与活化fcγr结合为野生型水平、被降低或消除的igg变体。这在例如当igg变体的目标是抑制炎性或自身免疫性疾病或以某种方式调控免疫系统的时候是特别可用的。由于自身免疫性疾病通常持续很久并且治疗要重复给药，用具有增加的半衰期而不是增加的fcrn的fc变体进行它们的治疗是尤其优选的。
可以进行修饰来改善igg稳定性、溶解性、功能、或临床用途。在优选的实施方式中，igg变体可以包括在人中降低的免疫原性的修饰。在最优选的实施方式中，使用ussn11/004,590中所述的方法降低igg变体的免疫原性，ussn11/004,590通过引用整体并入。在替代性实施方式中，igg变体是人源化的(clark,2000,immunoltoday21:397-402，通过引用整体并入)。
igg变体可以包括降低免疫原性的修饰。降低免疫原性的修饰可以包括降低源自亲本序列的加工肽与mhc蛋白的结合的修饰。例如，可以工程化氨基酸修饰以便没有或有最少数目的免疫表位预计与任何主要mhc等位基因高亲和力结合。本领域内已知在蛋白序列中鉴定mhc结合表位的若干方法，它们可以用于对在igg变体中的表位评分。参见，例如wo98/52976；wo02/079232；wo00/3317；ussn09/903,378；ussn10/039,170；ussn60/222,697；ussn10/754,296；pctwo01/21823；和pctwo02/00165；mallios,1999,bioinformatics15:432-439；mallios,2001,bioinformatics17:942-948；sturniolo等人,1999,naturebiotech.17:555-561；wo98/59244；wo02/069232；wo02/77187；marshall等人,1995,j.immunol.154:5927-5933；以及hammer等人,1994,j.exp.med.180:2353-2358，它们都通过引用整体并入。可以使用基于序列的信息来确定给定肽-mhc相互作用的结合评分(参见，例如mallios,1999,bioinformatics15:432-439；mallios,2001,bioinformatics17:第942-948页；sturniolo等人,1999,naturebiotech.17:555-561，它们都通过引用整体并入)。
工程化igg变体
本发明的变体可以通过多种方法设计。本文所述的变体可以是插入、缺失、取代、其他修饰、或这些的组合和其他改变。本发明的一个特别新颖的实施方式是改善或降低fc多肽与fc配体的结合的插入和缺失的设计。如本文所公开的，可以进行插入或缺失以增加或降低fc多肽对fcrn的亲和力。可以通过合理的方法或通过包括使用随机组分例如随机或半随机的文库产生或筛选的方法来设计插入和缺失。在替代性实施方式中，公开了增加或降低fc多肽对fcrn的亲和力的取代。
骨架修饰：插入和缺失
变体fc多肽可以通过用变体氨基酸取代fc多肽位置的亲本氨基酸产生。通过将fc多肽中的一个或多个氨基酸取代为变体氨基酸，改变了那些位置上的侧链。最可用的取代通过改变fc侧链而更改fc特性。取代的侧链可以直接或间接与和fc功能或特性相关的fc结合配偶体相互作用。该至少一个取代改变了亲本fc多肽的一个或多个侧链的共价结构。
可选择地，可以产生改变亲本fc多肽的骨架的共价结构的变体fc多肽。蛋白中的骨架原子是肽氮、α碳、羰基或肽碳和羰基氧。改变骨架的共价结构提供改变fc多肽的特性的另外的方法。fc骨架的共价结构可以通过添加原子到骨架中来改变，例如，通过插入一个或多个氨基酸；或从骨架中减去原子来改变，例如通过缺失一个或多个氨基酸。骨架的共价结构还可以通过将骨架的各原子改变为其他原子来改变(deechongkit等人,jamchemsoc.2004.126(51):16762-71，通过引用整体并入)。如本领域内所已知的和本文所示例的，fc多肽中氨基酸的插入或缺失可以通过插入或缺失编码fc多肽的dna中的相应核苷酸来进行。可选择地，如本领域中所已知，氨基酸的插入或缺失可以在fc多肽合成期间进行。
改变fc多肽与一个或多个结合配偶体(例如，fcγr、fcrn、c1q)的相互作用的氨基酸插入或缺失的设计可以通过考虑fc多肽及其结合配偶体的复合体的结构来进行。在次优选的实施方式中，该设计可以通过考虑fc多肽的结构和关于参与与结合配偶体的结合的fc区的信息来进行。这种信息可以通过诱变实验、噬菌体展示实验、同源性比较、计算机建模或其他方法获得。
影响fc结合相互作用但是不影响fc多肽的整体结构、稳定性、表达或fc用途的插入或缺失的氨基酸序列的优选位置为参与fc/fc结合配偶体相互作用的环。为了改变fcrn与fc多肽的结合，位置244-257、279-284、307-317、383-390、和428-435是插入或缺失的优选环位置(根据kabat等人的eu索引编号，burmeister等人,1994,nature,372:379-383；martin等人,2001,molcell7:867-877，它们都通过引用整体并入)。为了改变fcγ受体与fc多肽的结合，位置229-239、266-273、294-299、和324-331是插入或缺失的优选环位置(根据kabat等人的eu索引编号，pdb编号1e4k.pdb，sondermann等人nature.2000406:267，它们都通过引用整体并入)。环是不参与α螺旋或β片层结构的多肽区域。环位置是不在α螺旋或β片层结构中的位置(vanholde,johnson和ho.principlesofphysicalbiochemistry(物理生化原理).prenticehall,newjersey1998，第1章，第2-67页，通过引用整体并入)。环位置是优选的是因为骨架原子与α螺旋和β片层的骨架原子相比通常是更柔韧的并且不太可能参与氢键。因此，由于一个或多个氨基酸的插入或缺失而引起的环的加长或缩短不太可能引起fc多肽的大的破坏性改变，包括稳定性、表达或其他问题。
可以使用插入和缺失来改变多肽的长度。例如，在环区域，改变环长度会导致环的柔性和构象熵改变。环中的插入通常增加环的构象熵，环的构象熵用boltzman常数乘以可能的构象数的自然对数来定义(vanholde,johnson和ho.principlesofphysicalbiochemistry(物理生化原理).prenticehall,newjersey1998,第78页，通过引用整体并入)。通过将至少一个氨基酸插入到多肽中，多肽可用的构象总数增加了。这些额外的构象可能有益于形成有利的fc/fc结合配偶体相互作用，因为fc多肽可以使用额外构象之一来结合fc结合蛋白。在这种情况下，插入可能导致较强的fc/fc结合配偶体相互作用。如果额外的构象没有用于结合界面，则插入可能导致较弱的fc/fc结合配偶体相互作用，因为额外的构象会与结合活性构象相竞争。类似地，多肽片段的缺失也可能导致较强或较弱的fc/fc结合配偶体相互作用。如果降低可能的骨架构象数的片段的缺失移除了结合活性构象，则该缺失可能导致较弱的fc/fc结合配偶体相互作用。如果缺失不移除结合活性构象，则该缺失可能导致较强的fc/fc结合配偶体相互作用，因为该缺失可能移除与结合活性构象竞争的构象。
可以使用插入和缺失来改变fc多肽中氨基酸的位置和取向。因为插入和缺失引起骨架的共价结构改变，它们必然会引起骨架原子的位置改变。图7比较了在三个不同的骨架中标记为l1至l4的相同环片段的骨架位置。参考骨架结构含有4个环片段，而缺失骨架缺乏片段l1，插入片段在片段l1之前即片段l1的n-末端包含额外的片段。插入和缺失会引起插入或缺失位点附近的骨架结构的最大改变。通过缺失环的n-末端附近的片段，例如，片段l1，环缩短了，并且剩余的片段的位置向更接近环n-末端的位置移动。这具有将l2片段向之前的l1片段位置和向环n-末端移动的效果。这种l2片段向l1片段的位置移动可能增强fc/fc结合配偶体复合体的结合，并且在当现有信息表明位于l2的一个或多个氨基酸在位于l1时能够促进fc结合配偶体的相互作用时这是优选的。例如，如果l2含有丙氨酸和酪氨酸，并且之前将两个l1氨基酸取代为丙氨酸和酪氨酸导致fc变体的结合增加，则l1缺失可能产生对fc结合配偶体的亲和力增加的fc变体。
类似地，在环的n末端侧将多肽片段插入fc多肽中会引起环片段的位置移向环的c-末端侧。在图7中，在片段l1之前即片段l1的n-末端插入一个或多个氨基酸改变了骨架构象，包括使l1片段移至环的c-末端。这种类型的插入在已知位于片段l1的氨基酸位于l2位置时能够促进相互作用的时候是优选的，因为该插入可能导致较强的fc/fc结合配偶体相互作用。如果期望较弱的fc/fc结合配偶体相互作用，则可以使用插入来将不利的氨基酸移至新的位置。插入的、缺失的和参考片段(图7中的l1至l4)可以是fc多肽中的一个或多于一个的氨基酸。
可选择地，可以在环的c-末端以类似于环的n-末端的插入或缺失的方式使用插入或缺失。环c-末端的插入可能导致插入的n-末端位置向环n-末端移动。环c-末端的缺失可能导致缺失的n-末端位置向环c-末端移动。在环的n-末端还是c-末端使用插入或缺失的选择基于位于环中的氨基酸、对增加或降低fc/fc结合配偶体亲和力的期望、和所需的位置移动。
插入或缺失可用于fc多肽的任何区域，包括环、α螺旋和β片层区。优选的插入和缺失位置包括环区域，它是非α螺旋或β片层区的那些区域。环是优选的是因为它们一般能比α螺旋或β片层更好地接受骨架中的改变。导致较强的蛋白/蛋白相互作用的插入或缺失的尤其优选的位置在环的n-末端或c-末端边缘。如果环的侧链参与了fc/fc结合配偶体相互作用，则在边缘的插入或缺失会导致结合相互作用中强的有害改变的可能性较低。环的正中心的缺失更可能移除fc/fc结合配偶体界面的重要残基，环的正中心的插入更可能产生fc/fc结合配偶体界面的不利相互作用。缺失或插入的残基数目可以通过所需的骨架改变的大小来决定，其中15个或更少的残基的插入或缺失是优选的，10个或更少的残基的插入或缺失是更优选的，并且5个或更少的残基的插入或缺失是最优选的。
一旦设计出fc缺失变体的位置和大小，便完全确定了整个多肽序列，可以通过本领域内已知的方法构建多肽。
然而fc插入变体则具有设计要插入的至少一个氨基酸的序列的额外步骤。包括ser、thr、asn、gln、ala、gly、his的极性残基的插入优选在预期在fc多肽中暴露的位置。包括ser、thr、和ala的较小氨基酸是尤其优选的，因为小尺寸位阻干扰fc/fc结合配偶体相互作用的可能性较小。ser和thr还具有与fc结合配偶体上的原子形成氢键的能力。
插入还具有增加的灵活性，插入的多肽可以设计成有利于与fc结合配偶体的相互作用，如在需要较强的fc/fc结合配偶体结合时所期望的。骨架插入的长度可以通过对具有简单通用的插入序列的变体骨架建模来确定。例如，可以构建不同长度的聚丝氨酸、聚甘氨酸或聚丙氨酸插入，并进行建模。建模可以通过多种方法进行，包括基于包含插入的同源物的已知三维结构的同源物建模，可以通过包括如下的计算机建模进行：modeller(m.a.marti-renom等人.annu.rev.biophys.biomol.struct.29,291-325,2000)和rosetta(kuhlman等人(2003).science302,1364-8)，它们都通过引用整体并入。通常，最初制备多种骨架构象，最终的骨架结构则在确定侧链特征之后确定。侧链可以通过
可以进行插入和缺失来以类似于所述用于改变fcrn结合特性的方法的方式改变fc多肽与fcγr的结合。fc结构域在图1中所指示的位置结合fcγr。fc/fcγr复合体的结构包括pdb编号1t89和1iis(radaevs等人j.biol.chem.第276卷,第16469-16477页，通过引用整体并入)展示了两种结构之间的相互作用残基和环。诸如在us11/124620和us6737056(它们都通过引用整体并入)中所发现的那些诱变结果全都可用于确定适当的骨架定位移动。
可以通过本文所述的方法将插入和缺失设计在fc多肽之外的任何多肽中。例如，tnf超家族成员april的插入或缺失可以借助于其三维结构(pdb编号1xu1.pdb,hymowitz,等人(2005)j.biol.chem.280:7218，通过引用整体并入)来设计。可以设计插入或缺失来增加april与其受体taci的结合。优选作为插入或缺失位点的环残基为残基ser118-val124、asp164-phe167、pro192-ala198、pro221-lys226。这些环与april/taci复合体中的taci相互作用并且介导结合。
整合多肽的变体
igg变体可以基于人igg序列，因此人igg序列用作其他序列与之比较的“基本”序列，其他序列包括但不限于来自其他生物体的序列，如啮齿动物和灵长类序列。igg变体还可以包含来自其他免疫球蛋白种类的序列，如iga、ige、igd、igm等。本发明包括：尽管igg变体是在一个亲本igg的背景下工程化的，但是可以将变体工程化到或转移到另一个第二亲本igg的背景中。这通过确定第一和第二igg之间的“等同”或“对应”残基和取代来进行，通常是基于igg序列之间的序列或结构同源性进行。为了确定同源性，将本文所列的第一igg的氨基酸序列直接与第二igg的序列进行比较。使用容许必须的插入和缺失以保持比对(即，避免通过任意缺失和插入消除保守残基)的本领域内已知的一种或多种同源比对程序(例如使用物种之间的保守残基)比对序列后，定义等同于第一igg变体的一级序列的具体氨基酸的残基。保守残基的比对优选应保留100％的这种残基。然而，大于75％或小至50％的保守残基比对也足以定义等同残基。等同残基还可以通过测定第一和第二igg的结构同源性来定义，结构同源性在结构已经被确定的igg的三级结构水平进行。在这种情况下，等同残基被定义为在比对后亲本或前体的具体氨基酸残基的两个或多个主链原子的原子坐标(n上的n，ca上的ca、c上的c和o上的o)在0.13nm之内且优选为0.1nm的残基。在最佳的模型被定向和定位以使蛋白的非氢蛋白原子的原子坐标最大程度的重叠之后，便完成了比对。无论如何确定等同或对应残基，也无论制备igg的亲本igg的身份如何，所传达的意思是由此发现的igg变体可以被工程化到与igg变体具有明显的序列或结构同源性的任何第二亲本igg中。因此，例如，如果通过使用上述方法或测定等同残基的其他方法制备了其中亲本抗体为人igg1的变体抗体，则可以将变体抗体工程化到结合不同抗原的另一igg1亲本抗体、人igg2亲本抗体、人iga亲本抗体、小鼠igg2a或igg2b亲本抗体等中。同样，如上文所述，亲本igg变体背景不会影响igg变体转移至其他亲本igg的能力。
提供了工程化、制备、和筛选igg变体的方法。所述方法不旨在限制于任何具体的应用或操作理论。相反，所提供的方法旨在一般性地示例出可以用实验方法工程化、制备和筛选一种或多种igg变体以获得具有优化的效应子功能的igg变体。ussn10/754,296和ussn10/672,280中描述了用于设计、制备和测试抗体和蛋白变体的多种方法，ussn10/754,296和ussn10/672,280都通过引用整体并入。
可以使用多种蛋白工程化方法来设计具有优化的效应子功能的igg变体。在一个实施方式中，可以使用基于结构的工程化方法，其中使用可用的结构信息来指导取代、插入或缺失。在优选的实施方式中，可以使用计算筛选方法，其中根据它们在计算机计算中的能量适合性(energeticfitness)来设计取代。参见，例如ussn10/754,296和ussn10/672,280、以及本文所引用的参考文献，它们都通过引用整体并入。
可以使用序列比对来指导在指定位置的取代。本领域的技术人员应了解序列信息的使用可以控制可能不利于蛋白结构的取代的引入。序列来源可能广泛地变化，并且包括一个或多个已知的数据库，所述数据库包括但不限于：kabat数据库(美国西北大学)；johnson&wu,2001,nucleicacidsres.29:205-206；johnson&wu,2000,nucleicacidsres.28:214-218)；imgt数据库(imgt,theinternationalimmunogeneticsinformation
可选择地，可以使用随机或半随机诱变法在所需位置进行氨基酸修饰。在这些情况下，位置是随机选择的，或者使用简单化的规则进行氨基酸改变。例如，可以将所有残基都突变为丙氨酸，这称为丙氨酸扫描。这类方法可以与采用选择法来筛选较高水平的序列多样性的更复杂的工程化方法结合。如本领域所已知的，多种选择技术可以用于此类方法，包括：例如，展示技术，如噬菌体展示、核糖体展示、细胞表面展示等，如下文所描述的。
制备和筛选igg变体的方法是本领域内所熟知的。抗体分子生物学、表达、纯化和筛选的一般方法描述于：antibodyengineering(抗体工程化),duebel&kontermann编辑,springer-verlag,heidelberg,2001；和hayhurst&georgiou,2001,curropinchembiol5:683-689；maynard&georgiou,2000,annurevbiomedeng2:339-76中。还参见ussn10/754,296；ussn10/672,280；和ussn10/822,231；以及11/124,620中所描述的方法，它们都通过引用整体并入。本发明的优选变体包括图8中出现的那些。本发明的替代性优选变体包括图9中出现的那些。本发明的另外的替代性优选变体包括图10中出现的那些。如实施例中所示例的，这些变体显示与fc受体fcrn的结合增加。
制备igg变体
igg变体可以通过本领域内已知的任何方法制备。在一个实施方式中，可以使用igg变体序列来制备编码成员序列的核酸，如果需要可以然后将该核酸克隆到宿主细胞中，表达并测定。这些实践使用熟知的方法进行，并且可以使用的多种方法描述在：molecularcloning-alaboratorymanual(分子克隆-实验室手册),第3版(maniatis,coldspringharborlaboratorypress,newyork,2001)；和currentprotocolsinmolecularbiology(现代分子生物学实验技术)(johnwiley&sons)中，它们都通过引用整体并入。可以将编码igg变体的核酸整合到表达载体中以表达蛋白。表达载体通常包括与控制或调节序列、选择标志物、任何融合配偶体和/或另外的元件可操作地连接即置于功能关系的蛋白。可以通过在合适的条件下培养用核酸，优选含有编码igg变体的核酸的表达载体转化的宿主细胞以诱导或引起蛋白表达来制备igg变体。可以使用多种合适的宿主细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞和酵母。例如，可以使用的多种细胞系描述在自美国标准培养物保藏中心(americantypeculturecollection)获得的atcc细胞系目录中，其通过引用整体并入。将外源核酸引入宿主细胞的方法是本领域内所熟知的，并且可以随所用的宿主细胞而变化。
在优选的实施方式中，在igg变体表达后，将其纯化或分离。抗体可以用本领域的那些技术人员所已知的多种方法来分离或纯化。标准的纯化方法包括：色谱技术、电泳、免疫、沉淀、透析、过滤、浓缩、和色谱聚焦技术。如本领域内所熟知的，多种天然蛋白结合抗体，例如细菌蛋白a、g和l，并且这些蛋白可用于纯化。通常，能够通过特定融合配偶体来进行纯化。例如，如果使用gst融合体，则可以使用谷胱甘肽树脂来纯化蛋白；如果使用his标签，则使用ni+2亲和色谱，或如果使用flag标签，则使用固定的抗flag抗体。对于合适的纯化技术的一般指南，参见：antibodypurification:principlesandpractice(抗体纯化：原理与实践),第3版,scopes,springer-verlag,ny,1994，其通过引用整体并入。
筛选igg变体
fc变体可以使用多种方法来筛选，包括但不限于：使用体外测定、体内和基于细胞的测定以及选择技术的那些方法。可以将自动和高通量筛选技术用于筛选方法。筛选可以采用融合配偶体或标记，例如，免疫标记、同位素标记、或小分子标记，如荧光或发色染料。
在优选的实施方式中，在体外测定中筛选fc变体的功能和/或生物物理特性。在优选的实施方式中，筛选蛋白的官能度，例如其催化反应的能力或其与其靶的结合亲和力。
如本领域中所已知的，筛选方法的亚类为选择文库的有利成员的那些方法。该方法在本文中称为“选择方法”，并且这些方法可用于在本发明中筛选fc变体。当使用选择方法筛选蛋白文库时，仅繁殖、分离、和/或观察那些有利的文库成员，即符合一些选择标准的成员。可用于本发明中筛选蛋白文库的许多选择方法是本领域内所已知的。可用于本发明中的其他选择方法包括不依赖于展示如体内方法的方法。称为“定向进化”法的一组选择方法是包括在选择期间配对或延伸有利序列，有时会掺入新的突变的那些方法。
在优选的实施方式中，使用一种或多种基于细胞的测定或体内测定来筛选fc变体。对于这类测定，通常外源地添加纯化的或非纯化的蛋白以便使细胞暴露于属于文库的单个变体或变体库。这些测定通常但不总是基于fc多肽的功能；即，fc多肽结合其靶并介导诸如效应子功能、配体/受体结合抑制、凋亡等的一些生物化学事件的能力。这些测定通常包括监控细胞对igg的反应，例如细胞存活、细胞死亡、细胞形态改变、或转录激活，如天然基因或报道基因的细胞表达。例如，这些测定可以测量fc变体引起adcc、adcp、或cdc的能力。对于一些测定，可能需要添加另外的细胞或组分即除靶细胞之外的细胞或组分，例如血清补充物、或效应子细胞，如外周血单核细胞(pbmc)、nk细胞、巨噬细胞等。这些额外的细胞可以来自任何生物体，优选人、小鼠、大鼠、兔、和猴。抗体可能引起表达靶的某些细胞系凋亡，或它们可能介导被添加到测定中的免疫细胞对靶细胞的攻击。监控细胞死亡或存活率的方法是本领域内已知的，包括染料、免疫化学、细胞化学、和放射性试剂的使用。转录激活还可以作为在基于细胞的测定中测定功能的方法。可选择地，基于细胞的筛选使用被用编码变体的核酸转化或转染的细胞来进行。也就是说，fc变体不是外源地添加到细胞中的。
igg变体的生物特性可以在细胞、组织和整个生物体实验中表征。如本领域所已知的，药物通常在动物中测试以测量药物治疗疾病或疾病模型的效力或测量药物的药代动力学、毒性和其他特性，所述动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪和猴。这些动物可以被称为疾病模型。治疗剂通常在小鼠中测试，所述小鼠包括但不限于裸小鼠、scid小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。此实验可以提供测定蛋白用作治疗剂的可能的有意义的数据。可以使用任何生物体，优选哺乳动物进行测试。例如，由于猴与人的遗传相似性，它们可能是合适的治疗模型，因此可以用于测试igg的效力、毒性、药代动力学或其他特性。在人中的测试最终需要被批准作为药物，因此当然包括了这些实验。因此，可以在人中测试igg以测定它们的治疗效力、毒性、免疫原性、药代动力学、和/或其他临床特性。
使用igg变体的方法
igg变体可用于大量产品中。在一个实施方式中，igg变体为治疗试剂、诊断试剂、或研究试剂，优选为治疗试剂。igg变体可用于单克隆或多克隆的抗体组合物中。在优选的实施方式中，igg变体用于杀伤具有靶抗原的靶细胞，例如癌细胞。在替代性实施方式中，igg变体用于阻断、拮抗或激动靶抗原，例如拮抗细胞因子或细胞因子受体。在替代性的优选实施方式中，igg变体用于阻断、拮抗或激动靶抗原并杀伤具有靶抗原的靶细胞。
igg变体可用于多种治疗目的。在优选的实施方式中，将包含igg变体的抗体施用给患者以治疗抗体相关病症。为了该目的的“患者”包括人和其他动物，优选哺乳动物并且最优选为人。本文所谓的“抗体相关病症”或“抗体反应性病症”或“病况”或“疾病”意指可以通过施用包含igg变体的药物组合物而改善的病症。抗体相关病症包括但不限于：自身免疫性疾病、免疫疾病、传染病、炎性疾病、神经疾病、以及肿瘤和瘤形成性疾病，包括癌症。本文所谓的“癌症(cancer)”和“癌症(cancerous)”是指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长上调的生理病况。癌症的实例包括但不限于：癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、施万细胞瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病和恶性淋巴瘤。
在一个实施方式中，igg变体是施用给患者的唯一治疗活性剂。可选择地，igg变体与一个或多个其他治疗剂组合施用，所述其他治疗剂包括但不限于细胞毒素剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管发生剂、保心剂、或其他治疗剂。igg变体可以与一种或多种其他治疗方案同时施用。例如，igg变体可以与化疗、放疗、或化疗和放疗两者一起施用给患者。在一个实施方式中，igg变体可以与可能是或不是igg变体的一种或多种抗体结合施用。根据另一实施方式，使用igg变体和一个或多个其他抗癌治疗来治疗离体的癌细胞。包括了这种离体治疗可用于骨髓移植，并且尤其是自体骨髓移植。当然包括了可以与另外的治疗技术如手术组合使用igg变体。
可以使用多种其他治疗剂来与igg变体一起施用。在一个实施方式中，igg与抗血管发生剂一起施用。本文所用的“抗血管发生剂”意指在某种程度上阻断、或干扰血管发育的化合物。抗血管发生剂因子可以为：例如与参与促进血管发生的生长因子或生长因子受体结合的小分子或蛋白，例如抗体、fc融合体、或细胞因子。本文优选的抗血管发生因子为与血管内皮生长因子(vegf)结合的抗体。在替代性实施方式中，igg与诱导或增强获得性免疫反应的治疗剂例如靶向ctla-4的抗体一起施用。在替代性实施方式中，igg与酪氨酸激酶抑制剂一起施用。本文所用的“酪氨酸激酶抑制剂”意指在某种程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在替代性实施方式中，igg变体与细胞因子一起施用。
包括了其中配制了igg变体和一种或多种治疗活性剂的药物组合物。通过混合具有所需纯度的igg与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(remington'spharmaceuticalsciences(雷明顿药物科学)第16版,osol,
a.编辑,1980，通过引用整体并入)以冻干制剂或水溶液的形式制备用于储存的igg变体制剂。用于体内施用的制剂优选为无菌的。这通过用无菌滤膜过滤或其他方法容易实现。本文所公开的igg变体和其他治疗活性剂还可以配制成免疫脂质体和/或装入微胶囊中。
治疗活性igg变体在制剂中的浓度可以按重量计从约0.1％至100％变化。在优选的实施方式中，igg的浓度在0.003至1.0摩尔的范围内。为了治疗患者，可以施用治疗有效剂量的igg变体。本文所谓的“治疗有效剂量”意指产生其所施用的效果的剂量。准确的剂量取决于治疗目的，并且可由本领域的技术人员使用已知的技术来确定。剂量可以在0.01mg/kg至100mg/kg体重或更大的范围内，例如0.01、0.1、1.0、10、或50mg/kg体重，优选为1至10mg/kg。如本领域内所已知的，可能需要调整蛋白降解、全身性递送或是局部递送、新蛋白酶合成的速率、以及年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病况严重程度，并且这可以由本领域的那些技术人员使用常规实验确定。
包含igg变体的药物组合物优选为无菌水溶液形式的施用可以以多种方法进行，包括但不限于：口服、皮下、静脉内、肠胃外、鼻内、耳内、眼内、直肠、阴道、经皮、局部(例如，凝胶、药膏、洗剂、乳剂等)、腹膜内、肌内、肺内(例如从aradigm商购获得的
实施例
下面提供实施例来示例本发明。这些实施例不旨在将本发明限制于任何具体的应用或操作理论。对于本发明所讨论的所有位置，编号根据kabat的eu索引(kabat等人,1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(具有免疫学重要性的蛋白序列),第5版,unitedstatespublichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,其通过引用整体并入)进行。抗体领域内的那些技术人员应了解该规定包括在特定免疫球蛋白序列区的非顺序编号，这使得免疫球蛋白家族的保守位置具有标准化的参考。因此，如通过eu索引所定义的任何给定免疫球蛋白的位置不需要对应于其顺序序列。
实施例1：fc变体的dna构建、表达和纯化
使用人igg1fc结构域和曲妥单抗(
使用quikchangetm方法(stratagene)进行定点诱变。在oneshottop10大肠杆菌细胞(invitrogen)中繁殖含有所需的取代、插入、和缺失的质粒，并使用hi-speedplasmidmaxi试剂盒(qiagen)将其纯化。进行dna测序以确定序列的保真性。
将含有重链基因(vh-cγ1-cγ2-cγ3)(野生型或变体)的质粒与含有轻链基因(vl-cκ)的质粒共转染到293t细胞中。转染后5天收获培养基，并使用蛋白a亲和色谱(pierce)从上清液中纯化抗体。一些被修饰的fc的蛋白a结合特征显示在图26中。通过二辛可宁酸(bicinchoninicacid，bca)测定(pierce)来确定抗体浓度。
实施例2：结合亲和力测量
fc多肽与fc配体的结合使用表面等离子体共振测量来测定。表面等离子体共振(spr)测量使用biacore3000仪器(biacoreab)进行。使用固定的蛋白l(piercebiotechnology,rockford,il)捕获野生型或变体抗体，并测量它们与受体分析物的结合。使用n-羟基琥珀酰亚胺/n-乙基-n’-(-3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺(nhs/edc)以5μl/min的流速将蛋白l在cm5传感芯片上以在10mm乙酸钠ph4.5中为1μm的浓度共价偶联到cm5传感芯片上。每个传感芯片的液体池1用nhs/edc模拟以作为结合的阴性对照。运行缓冲液为0.01mhepesph7.4、0.15mnacl、3mmedta、0.005％v/v表面活性剂p20(hbs-ep,biacore,uppsala,sweden)，并且芯片再生缓冲液为10mm甘氨酸-hclph1.5。将125nm野生型或变体抗her2抗体在hbs-ep中以1μl/min与蛋白lcm5芯片结合5分钟。在hbs-ep中以10μl/min注射在1和250mm之间系列稀释的fcrn-his-gst分析物，fcrn-his-gst分析物为融合至his标签和谷胱甘肽s转移酶的fcrn，对于结合注射20分钟，对于解离注射10分钟。在受体注射后1200秒获得以共振单位(ru)测量的反应，它反映了近稳定状态的结合。抗体和缓冲液的循环仅提供了基线反应。制作ru与1/log浓度的曲线并用graphpadprism使用非线性回归将其与s形剂量反应进行拟合。
还使用alphascreentm(amplifiedluminescentproximityhomogeneousassay(放大的发光近似性同源测定))测定fc多肽与fc配体的结合。alphascreentm是基于珠子的非放射性发光近似性测定。供体珠子的激光激发会激活氧，如果氧与受体珠子足够近则会产生级联的发光事件，最终导致在520-620nm处的荧光发射。alphascreentm的主要优点为其敏感性。因为，一个供体珠子每秒钟发射多达60,000个激活的氧分子，信号扩大极高，使得能够进行低至渺摩尔(attomolar，10-18)级别的检测。通过标准方法将野生型抗体生物素化以连接至链酶亲和素供体珠子，并且被标记的fc配体，例如fcrn、fcγr或蛋白a与谷胱甘肽螯合物受体珠子结合。alphascreentm用于直接结合测定，其中fc/fc配体相互作用将供体和受体珠子连在一起以产生测量信号。此外，alphascreentm用于筛选设计的fc多肽的竞争性测定。在不存在竞争性fc多肽的情况下，野生型抗体和fcrn相互作用并产生520-620nm的信号。未带标签的fc结构域与野生型fc/fcrn相互作用相竞争，从数量上降低荧光，使得能够测定相对的结合亲和力。
实施例3：fc变体的fcrn结合特性
igg1fc与fcrn的结合亲和力使用alphascreentm用变体抗体测量。fc多肽为阿仑单抗或曲妥单抗的一部分。阿伦单抗(
收集竞争性alphascreentm数据以测量在0.1m磷酸钠ph6.0和25mm氯化钠中fc变体与野生型抗体相比的相对结合。alphascreentm信号作为竞争剂抗体的函数的实例显示在图12中。显示的12个变体的曲线，即p257l、p257n、v279e、v279q、v279y、^281s、e283f、v284e、l306y、t307v、v308f、和q311v的曲线，证明亲和力增加了，因为每个变体曲线在它们的框中移至野生型曲线的左侧。本发明的fc变体的竞争性aphascreentm数据总结在图13和14中。在0.1m磷酸钠ph6.0与125mm氯化钠中的另外的竞争性aphascreentm数据总结在图21中。列出了变体与野生型相比的相对fcrn结合。大于1的值表明fc变体与fcrn的结合与野生型相比有所改善。例如，变体e283l和v284e分别具有比野生型强9.5倍和26倍的结合。如图15和16所示，一些变体的表面等离子体共振测量还显示出增加的与fcrn的结合。
在位置257，所有移除了亚氨基酸、脯氨酸并且取代为没有与侧链共价键合的骨架n的氨基酸的变体容许骨架更具灵活，这容许fc结构域更自由，从而更好地结合fcrn。具体地，在位置257处为l和n的变体在ph6下具有强的fcrn结合，这表明4个原子的侧链和侧链的γ分支模式有助于fc结构域产生生产性的即强的fcrn相互作用。位置308与位置257相互作用。这两个位置继而都与h310相互作用，h310直接参与fc/fcrn相互作用(表2，burmeister等人(1994)nature372:379-383，通过引用整体并入)。fc变体v308f与v08y的fcrn亲和力与野生型相比具有2.9倍和4.3倍的增加(图13)。位置279和385以变体v279e、v279q和v279y和g385h和g385n与fcrn相互作用，它们都具有较强的fcrn相互作用。这些变体都变为了能够进行氢键键合的氨基酸。包含本发明的各种修饰的人igg1fc区序列显示在图23中。
如图13中所显示，fc变体n434y在ph6.0下与fcrn的结合特别强。单变体n434y的结合增加了16倍。这个变体与其他修饰的组合会引起甚至更强的结合。例如，p257l/n434y、^281s/n434y和v308f/n434y显示出增加了830倍、180倍、和350倍的fcrn结合。
实施例4：整合了插入和缺失的变体
构建改变fc/fcrn相互作用强度的插入和缺失并测量它们与各种fc配体的结合特性。设计在使用kabat等人的eu编号的残基281和282之间插入有ser残基的fc变体以增加fc结构域的fcrn结合特性。这个变体称为^281s，其中“^”意指所给定的位置之后的插入。alphascreentm数据显示^281s的结合有所改善，该数据显示在图12b和21a中。可以为多于1个残基的插入序列在位置编号之后提供。使用本文所公开的方法将这种fc变体构建在κ,igg1抗her2抗体曲妥单抗(
alphascreentm数据显示了^281s变体和其他变体与fcrn的结合。以直接结合测定收集这种alphascreentm数据。较高水平的化学发光信号表明较强的结合。测定中变体浓度越增加，则产生的信号越强。图17a和17b中在ph6.0下的这些数据表明^281s、p257l、p257l/^281s(组合的取代/插入变体)和其他变体与野生型fc相比亲和力增加了。还显示了一种双取代t250q/m428l，之前已显示该双取代在猴中具有增加的血清半衰期(hinton等人,2004,j.biol.chem.279(8):6213-6216，通过引用整体并入)。单独的插入^281s增加了fc/fcrn结合。此外，如在约40nm的数据点所显示的，在以变体p257/^281s形式组合两种修饰时，^281s还能增加p257l的结合。图17c中的数据表明这些变体在ph7.0下不显示fcrn结合的增加。在ph7.0下的亲和力降低是增加体内半衰期所需的，因为它容许从fcrn释放fc多肽到胞外间隙，这是fc再循环的重要步骤。
表面等离子体共振实验还表明^281s与fcrn的结合有所改善。图18显示各种fc变体结合至芯片表面的fcrn时所产生的响应单位。在容许变体完全结合到芯片之后，记录响应单位并显示在纵坐标上。插入^281s显示与本文所显示的其他变体相当的结合特性，与野生型相比具有增加的fcrn亲和力(参见例如图13、14和15)。
包含n286缺失、n286#的缺失变体还显示比野生型增加的fcrn亲和力。如图13所显示，该变体具有增加了2.0倍的fcrn亲和力。本文的数据还有在ph6.0下的竞争性实验所收集的alphascreentm数据。将用于抑制野生型fc结合的变体连接在供体珠子上，并将fcrn连接在受体珠子上。为抑制供体/受体珠子通过fc/fcrn复合体的结合需要比游离的野生型fc少两倍的游离的n286#。这表明n286#比野生型的结合紧密2倍。
包含插入或缺失的其他fc变体具有降低的fcrn亲和力。如同从变体的性质和定位所预计的一样，插入变体^254n具有显著降低的fcrn结合。该变体将asn插入设置在fcrn结合环的中间。该插入仅具有野生型结合亲和力的1.1％的结合(图13)。
实施例5：具有改变的fcrn和fcγr特征的组合变体
如图13b中关于抗her2抗体所显示的，fc变体p257l相对于野生型具有增加的对fcrn的亲和力。p257l在添加有25mmnacl的ph6.0的磷酸盐缓冲液中得到了中值为2.6倍增加的对于人fcrn的fcrn亲和力。i332e或s239d/i332e向p257l变体中的添加产生了双变体和三变体，p257l/i332e和s239d/p257l/i332e，它们保持增加的对fcrn的亲和力。如图14b中的alphascreentm测定所显示，变体s239d/i332e与野生型相比具有基本上未改变的fcrn结合。这些双变体和三变体具有增加了5倍和4倍的亲和力。i332e和s239d/i332e变体具有改善的与fcγr尤其fcγriiia的结合(参见，us11/124620，通过引用整体并入)。本发明一些变体的fcγr结合特性显示在图25中。本发明一些变体的蛋白a结合特性显示在图26中。在含fc的蛋白的纯化期间常使用蛋白a结合。取代v308f也改善了在ph6.0下的fcrn结合(图13e)。v308f作为抗her2抗体曲妥单抗(herceptintm,genentech)中的单取代具有增加了3倍的亲和力，并且在与诸如i332e、s239d/i332e和s298a/e333a/k334a的增加fcγr结合的取代组合时也具有增加的亲和力(lazar等人2006proc.nat.acad.sciusa.103(111):4005-4010；shields等人2001j.biol.chem.276:6591-6604，它们都通过引用整体并入)。当g385h与改善fcγr的取代组合时，尤其是在三取代变体s239d/i332e/g385h中，也保持g385h的增加的fcrn结合。
具有增加的与fcrn结合的变体可以与降低或敲除与fcγr和补体蛋白c1q结合的变体组合。改善的与fcrn的结合增加保护性受体的作用，从而容许半衰期改善。还可以将含fc的蛋白引入细胞中并通过它们与fcγr和c1q蛋白的相互作用进行代谢。如果fc/fcγr和fc/c1q蛋白相互作用不是抗体效力所需要的，则可以缺失这些相互作用。这些相互作用的缺失还可以降低降解性受体的作用，从而容许半衰期改善。具体地，变体234g、235g、236r、237k、267r、269r、325a、325l、和328r(us11/396,495，通过引用整体并入)可以与改善fcrn的变体组合以产生具有增加的fcrn亲和力和降低的fcγr或c1q亲和力的变体。这些变体包括235g/257c、325a/385h、325a/257l、234g/308f、234g/434y、和269r/308f/311v。这些变体可以在来自igg1的fc结构域中制备，然而与fcγr或c1q的相互作用的降低还可以通过将这些突变设置在含有来自igg2、igg4或igg3的fc结构域的蛋白中来实现。将fcrn修饰，如257n、257l、257m、308f、311v引入igg2中容许fcγr结合降低和fcrn相互作用增加。
具有降低的与fcrn结合的变体可以与具有增加的fcγr或c1q结合的变体组合。降低的fcrn结合与增加的fcγr结合的组合可能有利于增加可用于不正当效应子功能的含fc的蛋白的量。降低fcrn结合可以降低被fcrn隔离的含fc的蛋白的量，并且会因此影响生物可用性。诸如i253v、s254n、s254#(缺失254)、t255h、和h435n的修饰降低fc/fcrn结合(图13)并且可以与具有改善的fcγr结合的变体如s239d、i332e、h268e、g236a组合。所得的fc结构域，如包含i253v/s239d/i332e、i332e/h435n、或s254n/h268e的那些具有降低的fcrn结合和增加的fcγr结合。
具有降低的fcrn结合的变体可以与具有降低的fcγr结合的变体组合。这种降低的fcrn和fcγr结合的组合在诸如其中用放射性或毒性示踪物标记含fc的蛋白的成像的应用中是有利的。理想地，包含放射性示踪物的蛋白的半衰期与放射性核素本身的半衰期类似。这容许示踪物在放射性核素衰退的同时从体内清除。降低的fcγr相互作用还容许含fc的蛋白对于其靶具有最佳的可用性。例如，如果含fc的蛋白是抗体，则降低fcγr结合容许更多的抗体可被抗原评估。影响fcrn和fcγr的变体的组合，如235g/254n、236r/435n、269r/i253v对于这种应用是较佳的。
实施例6：抗体ost577中的fc变体与人fcrn的结合
ost577是抗乙型肝炎表面抗原抗体(ehrlich等人(1992)hum.antibodieshybridomas3:2-7，通过引用整体并入)。重链和轻链序列取自kabat数据库，它们是kadbid000653(重链)和kadbid007557(轻链)(martinac,proteins.1996may；25(1):130-3，通过引用整体并入)。编码重链和轻链的dna由blueheronbiolotechnology,bothell,wa合成。如实施例1中的抗her2(曲妥单抗)变体一样表达和纯化野生型和变体ost577抗体。biacoretm结合测定如实施例2中一样进行，其中将人fcrn/谷胱甘肽d转移酶(gst)融合蛋白连接至芯片表面。如图19所示，本发明的fc变体具有改变的与人fcrn的结合。具有增加的结合的变体更容易与表面的fcrn粘附并且能引起较高的响应单位(ru)增加。在fcrn结合区域显示有修饰的变体均具有比野生型蛋白增加的对fcrn的亲和力。这些变体包括p257l、p257n、v308f、n434y、p257l/n434y和p257l/v308f。在975秒ru量第三高的变体t250q/m428l显示在猕猴中增加ost577抗体的半衰期(hinton等人2004journalofbiologicalchemistry279(8):6213-6216；hinton等人2006jounalofimmunology176:346-356，它们都通过引用整体并入)。这个数据组中包括的是具有含取代s239d/i332e的杂合igg1/igg2重链恒定区的抗体。如实施例5中所描述的，这些取代增加了对fcγr的抗体亲和力。如图19中所显示的，这些取代不改变fcrn结合特性，因为杂合s239d/i332e的biacoretm图线与含κ或λcl1结构域的野生型图线重叠。
实施例7：fc变体对人、猴和小鼠fcrn的亲和力
如实施例1中所述制备抗her2抗体曲妥单抗的fc变体。如实施例2所述收集表面等离子体共振(spr)图线，不同的是将人、猕猴或小鼠的fcrn连接在芯片表面。对于每种fc变体收集连接在表面不同量的gst-fcrn的两条spr曲线。将每个曲线与1:1langmuir结合模型拟合，并且将所得的两个kd值平均以得到每个变体-受体对的代表值。结果以与野生型曲妥单抗相比的kd改善倍数显示在图20中。例如，变体v308f/q311v与人fcrn的结合比野生型的结合紧密3.4倍。v308f/q311v与猴和小鼠fcrn的结合也分别紧密了3.7倍和5.1倍。据显示变体m428l增加抗体半衰期(hinton等人2004journalofbiologicalchemistry279(8):6213-6216，全文通过引用并入)，并且它与人、猴和小鼠的fcrn结合分别增加了2.4倍、2.0倍、和2.1倍。其他变体，包括p257l、p257n、n434y、q311v、v308f、v308f/n434y、p257l/v308f、和p257l/n434y也显示能在ph6.0下增加结合。
实施例8：在各种fc结构域中的fcrn变体
可以使用本文所述的分子生物学和纯化技术，包括实施例1中的那些技术，将本发明的变体整合到任何恒定结构域。可以如图2中所列使用igg1、igg2、igg3、和igg4恒定结构域的氨基酸序列。此外，可以使用两种或多种不同恒定结构域的组合。例如，图24列出了整合到igg2和igg2杂合体中的在本发明中出现的一些修饰。这种杂合体包含igg2ch1结构域和igg1ch2和ch3结构域。在人中igg3与igg1、igg2和igg4相比具有较低的半衰期(7天相对于约21天，janeway,travers,walport,shlomchik.immunology(免疫学),第5版garlandpublishingc2001,图4-16，通过引用并入)，并且因此在某些应用中是期望的。
实施例9：抗vegf抗体中变体的制备
使用本文所述包括实施例1的方法制备结合改变的抗vegf抗体。野生型抗vegf重链包含下列氨基酸序列：
evqlvesggglvqpggslrlscaasgytftnygmnwvrqapgkglewvgwintytgeptyaadfkrrftfsldtskstaylqmnslraedtavyycakyphyygsshwyfdvwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
野生型抗vegf轻链包含下列氨基酸序列：
diqmtqspsslsasvgdrvtitcsasqdisnylnwyqqkpgkapkvliyftsslhsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqystvpwtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
结合改变的单变体和组合变体包括图28中所示的变体，图28显示了所制备的变体、所用的培养基体积和所得的抗体变体产量。变体的编号根据kabat等人的eu索引进行。图28中所列的变体在igg1或包含来自igg1和igg2两者的序列的杂合vh中制备。这些变体含有结合抗原vegf的可变区。通过尺寸排阻色谱和sds凝胶电泳判断所有的蛋白纯度都大于90％。
实施例10：抗体变体的体内半衰期
在小鼠中研究了野生型和变体抗体的药代动力学特征。所用的小鼠为小鼠fcrn表达缺陷的(b6-fcgrttm1dcr小鼠)并且为敲入人fcrn的杂合的(hfcrntg–转基因)，如petkova等人internationalimmunology2006dec；18(12):1759-69所述。petkova等人显示变体n434a在这些敲入人fcrn的小鼠中具有增加的半衰期，这与n434a变体在猴中具有增加的半衰期这一早期结果相一致(美国申请第11/208422号，公开号为us26067930a1)。用2mg/kg抗体静脉内注射9-12周龄的雌性小鼠，每种抗体注射6只小鼠的组。在1小时、1、4、8、11、15、18、21、25和28天从框下丛(oribitalflexus)收集血液样品。利用夹心elisa测定使用抗人fc抗体和铕检测测量血清中每种抗体的浓度。
研究结果显示在图27中，它是两次独立研究的代表数据。显示了4种样品的均值和平均标准偏差。很清楚的是，v308f变体具有较长的半衰期，可测量的浓度保持到了25天。野生型和p257l和p257n变体清除地较快，可测量浓度分别只持续到15、8和4天。将血清浓度与时间的函数与使用软件包winnonlin(pharsightinc)的非房室模型进行拟合。v308f变体的终末半衰期为4.9天，而野生型和p257l和p257n变体的终末半衰期分别为3.0、1.9和0.9天。v308f变体的曲线下面积(auc)为129天*μg/ml，而野生型和p257l和p257n变体的曲线下面积分别为70、38和38天*μg/ml。
实施例11：ph6.0下的fcrn结合实验
如实施例2中所述并对其进行一些修改，使用biacore测定测试本发明的抗vegf变体对人fcrn的结合能力。在10mm乙酸钠，ph4.5中使用n-羟基琥珀酰亚胺/n-乙基-n’-(-3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺(nhs/edc)以5μl/min的流速将人fcrn共价连接在cm5芯片上。所用的人fcrn含有gst和his标记的形式以有助于纯化和其他测定。大约3300ru的fcrn连接到了芯片上。液体池1用nhs/edc进行模拟以作为结合的阴性对照。运行缓冲液为25mm磷酸盐缓冲液ph6.0、150mmnacl、3mmedta和0.005％(v/v)表面活性剂p20。在ph7.4用相同的缓冲液将抗体从fcrn芯片洗脱，该过程迅速地移去了测试的所有变体。将biacore结合和解离图线与构象交换模型拟合以计算表观结合平衡常数kd。
结果表明v308f变体和一些其他的变体具有改善的与fcrn的结合。野生型抗vegf抗体具有18nm的kd，这与dall’acqua等人(dall’acqua等人journalofimmunology2002,169:5171-5180)所报道的值明显不同，这是因为测定设计和数据拟合不同。如果fcrn芯片在制备后很快使用，则我们的测定形式能得到可再现的结果。然而fcrn芯片会随着使用而降解，这可能是由于两条fcrn链的任一条与表面解离造成的。结果表明与野生型抗vegf相比，变体的结合改变了。图29显示了相对于野生型对照的结合强度的增加倍数。大于1的值显示变体抗体具有比野生型蛋白高的fcrn亲和力。例如，变体v308f与fcrn的结合比野生型抗体紧密4.5倍。变体v308f/m428l与fcrn的结合比野生型蛋白紧密12.3倍，并且变体t307p/v308f与fcrn的结合比野生型蛋白紧密3.16倍。图29中没有显示与野生型相比对fcrn亲和力降低(值小于1.0)的变体。变体n434s具有比野生型强4.4倍的fcrn结合亲和力，这与v308f相当。
实施例12：与跨膜fcrn的结合实验
fcrnα链和β-2-微球蛋白cdna为从origenetechnologiesinc(rockville,md)订购的并且将其转染到293t细胞中以在细胞表面表达功能fcrn。用脂质体(lipofectamine)(invitrogeninc.)转染20μgfcgrt和40μgβ-2-微球蛋白dna，并容许细胞在具有10％超低igg血清的dmem培养基中生长3天。也使未用两种fcrn链转染的对照细胞生长。在25mm磷酸盐缓冲液ph6.0、150mmnacl、0.5％bsa中使不同量的抗vegf抗体(野生型和变体)与细胞结合30分钟，然后在添加有0.003％igepal的25mm磷酸盐缓冲液ph6.0、150mmnacl、0.5％bsa中将其洗涤6-9次。洗涤后，通过用1％pfa的结合处理将抗体固定在表面。然后使用抗人fab结构域的pe标记的fab’2检测结合的抗体，使用bdfacscantoii测量平均荧光强度(mfi)。图30中显示每个抗体的两个样品的平均值。与图30中的数据匹配的曲线没有提供可解释的ec50值，因为一些曲线不形成使细胞饱和的上基线。然而，可以通过报道在mfi等于3000，ec(mfi＝3000)时的log[变体]而按照抗体的结合亲和力顺序将它们评级。使用这个量度，可以如下将抗体从最强的fcrn亲和力至最弱的fcrn亲和力列出：v308f/m428l、v259i/v308f、t250i/v308f、t250q/m428l、n434s、t307q/v308f、p257l、t307s/v308f、v308f、t256v/v308f、v308f/l309y、和wt。
实施例13：变体434s的特征
包含修饰434s的抗体具有使得它们成为本发明优选变体的特别有利的特性。在人igg1中，野生型残基在位置434处为天冬酰胺asn，因此该变体在igg1或在位置434处含asn，n的其他fc结构域的背景下可以被称为n434s。更一般地，该变体可以简单地被称为434s。在本文中，成功地在抗her2抗体曲妥单抗和抗vegf抗体二者中制备了434s变体。
位置434处的ser具有与fcrn直接或间接即由水或溶质分子介导氢键键合的能力。如图32所示，位置434处的ser的γ氧与fcrn分子上的gly131和pro134的羰基氧原子邻近。图32显示人fc结构域与人fcrn形成的复合体的模型。模型中的fc结构域包含了434s取代，因此图32中的残基434是ser。该模型是使用
如biacoretm测量所显示的(图29)，抗体变体n434s与野生型抗体相比具有增加了4.4倍的fcrn结合亲和力。如细胞计数测量所显示(图30)，该变体还显示与结合在细胞表面的fcrn的结合增加。
根据图29和30中所显示的结果，包含434s和其他修饰的优选的变体预计包括v308f/434s、428l/434s、252y/434s、259i/308f/434s、250i/308f/434s、和307q/308f/434s。
实施例14：另外的变体
另外的变体是基于本文所包含的数据和文献(dall’acqua等人journalofbiologicalchemistry2006aug18；281(33):23514-24；petkova等人internationalimmunity2006dec；18(12):1759-69；dall’acqua等人journalofimmunology2002,169:5171-5180；hinton等人,journalofbiologicalchemistry2004279(8):6213-6216；shields等人journalofbiologicalchemistry2001276(9):6591-6604；hinton等人journalofimmunology2006,176:346-356，它们都通过引用并入)。这些变体包括图31中所出现的那些变体。
根据图29和30的结果以及dall’acqua等人的结果(journalofbiologicalchemistry2006aug18；281(33):23514-24，通过引用并入)，优选的变体包括：y319l、t307q、v259i、m252y、v259i/n434s、m428l/n434s、v308f/n434s、m252y/s254t/t256e/n434s、m252y/s254t/t256e/v308f、m252y/s254t/t256e/m428l、v308f/m428l/n434s、v259i/v308f/n434s、t307q/v308f/n434s、t250i/v308f/n434s、v308f/y319l/n434s、v259i/v308f/m428l、v259i/t307q/v308f、t250i/v259i/v308f、v259i/v308f/y319l、t307q/v308f/l309y、t307q/v308f/y319l、和t250q/v308f/m428l。
根据图29和30的结果，更优选的变体包括：y319l、t307q、v259i、m252y、v259i/n434s、m428l/n434s、v308f/n434s、v308f/m428l/n434s、v259i/v308f/n434s、t307q/v308f/n434s、t250i/v308f/n434s、v308f/y319l/n434s、v259i/v308f/m428l、v259i/t307q/v308f、t250i/v259i/v308f、v259i/v308f/y319l、t307q/v308f/l309y、t307q/v308f/y319l、和t250q/v308f/m428l。
尽管为了示例的目的而在上文中描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的那些技术人员应了解可以在不背离所附的权利要求所述的发明的情况下进行大量的细节改变。本文所引用的所有参考文献都以其整体并入。
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<400>19
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275280285
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290295300
valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr
305310315320
glnlysserleuserleuserproglylys
325330
<210>21
<211>330
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>p257n杂合体
<400>21
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
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tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
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100105110
proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro
115120125
lysprolysaspthrleumetileserargthrasngluvalthrcys
130135140
valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnpheasntrp
145150155160
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165170175
gluglnpheasnserthrpheargvalvalservalleuthrvalval
180185190
hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn
195200205
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210215220
glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu
225230235240
metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr
245250255
proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn
260265270
asntyrlysthrthrproprometleuaspseraspglyserphephe
275280285
leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn
290295300
valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr
305310315320
glnlysserleuserleuserproglylys
325330
<210>22
<211>330
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>v308f杂合体
<400>22
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys
100105110
proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro
115120125
lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys
130135140
valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnpheasntrp
145150155160
tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu
165170175
gluglnpheasnserthrpheargvalvalservalleuthrpheval
180185190
hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn
195200205
lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysthrlysgly
210215220
glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu
225230235240
metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr
245250255
proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn
260265270
asntyrlysthrthrproprometleuaspseraspglyserphephe
275280285
leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn
290295300
valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr
305310315320
glnlysserleuserleuserproglylys
325330
<210>23
<211>330
<212>prt
<213>智人（homosapiens）
<400>23
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys
100105110
proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro
115120125
lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys
130135140
valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnpheasntrp
145150155160
tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu
165170175
gluglnpheasnserthrpheargvalvalservalleuthrvalval
180185190
hisvalasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn
195200205
lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysthrlysgly
210215220
glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu
225230235240
metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr
245250255
proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn
260265270
asntyrlysthrthrproprometleuaspseraspglyserphephe
275280285
leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn
290295300
valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr
305310315320
glnlysserleuserleuserproglylys
325330
<210>24
<211>330
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>g385h杂合体
<400>24
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys
100105110
proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro
115120125
lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys
130135140
valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnpheasntrp
145150155160
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metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr
245250255
proseraspilealavalglutrpgluserasnhisglnprogluasn
260265270
asntyrlysthrthrproprometleuaspseraspglyserphephe
275280285
leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn
290295300
valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr
305310315320
glnlysserleuserleuserproglylys
325330