VP53B基因及蛋白在制备防治对虾白斑综合征的药物中的应用的制作方法

本发明涉及水产养殖的疾病防治领域，具体地说，涉及vp53b基因及蛋白在制备防治对虾白斑综合征的药物中的应用。

背景技术：

对虾白斑综合征是一种在对虾养殖业较为常见的爆发性流行性疾病，其具有传播宿主广、致死速度快、致死率高等特点。对虾白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus，wssv)为导致对虾白斑综合征的病原体病毒。宿主范围具体包括对虾、螯虾等在内的大约98种甲壳类动物。宿主感染wssv后的症状包括：食欲减退，常浮于水面，部分宿主体表出现白斑，附肢无力，肝胰腺褪色等现象。wssv感染对虾后，可导致对虾在三到七天内死亡，且死亡率接近100％。

对虾白斑综合征给世界的虾养殖业造成了巨大的损失。自上世纪九十年代初在中国爆发以来，对虾白斑综合征陆续在亚洲、美洲、欧洲等国相继爆发。相关统计数据显示，由于对虾白斑综合征的爆发所造成的经济损失已经达到80-150亿美元，并且该损失以每年10亿美元的速度递增，占到世界虾养殖年产量的十分之一。然而，迄今为止，依然没有相对有效的方法去防治wssv。

随着对于wssv研究的深入，人们对于wssv的了解也逐步加深。目前关于wssv病毒的病毒结构、病毒宿主范围、病毒分类都有了较为深入的了解。

wssv病毒粒子的结构特征及其分类：wssv病毒粒子呈长杆状，无包涵体，尾部有类似鞭毛的附着结构，该结构的功能尚不清楚。病毒颗粒长约250nm-330nm，宽约80-120nm，为双链dna病毒。其病毒粒子的结构从外至内共有三部分，包括三层囊膜结构、桥连结构和核衣壳结构。由于wssv颗粒形状与杆状病毒类似，所以最初认为其属于杆状病毒(baculoviridae)。后来，国际病毒分类委员会将其划分为nimaviridae科whispovirus属的唯一种。whispovirus属是一种新划分的病毒属，随着对病毒分类研究的深入，将可能会有越来越多的病毒划分到该属，其潜在病毒种包括b病毒、b1病毒、tau病毒、baculo-a病毒和baculo-b病毒。

wssv囊膜蛋白在病毒侵染中的作用研究进展：wssv的结构蛋白根据其在病毒位置的不同，通常划分三种蛋白，即囊膜蛋白、桥连蛋白和核衣壳蛋白。一般认为，病毒的囊膜蛋白由于能够直接作用于受体相关细胞而在病毒的感染过程中往往起到了相当重要的作用。因此，对于wssv囊膜蛋白的研究已成为wssv研究领域的热点。目前已经鉴定的wssv囊膜蛋白共33以上，包括vp12b、vp13b、vp14、vp19、vp28、vp31、vp32、vp33、vp37、vp38a、vp39b、vp41a、vp41b、vp51a、vp51b、vp53a、vp53b、vp60a、vp68、vp90、vp110、vp124、vp180、vp187、vp281和vp466等。其中，vp28在wssv囊膜蛋白中含量大约60％，是wssv的主要囊膜蛋白。相对而言，对于vp28蛋白的功能性研究也较为深入。其次研究较多的为vp14、vp19和vp37。

虽然关于wssv囊膜蛋白已有了初步的研究和探索，人们发现了一些囊膜蛋白参与了wssv的侵染过程，并在虾体内找到了相应的受体，然而，wssv病毒较为特殊，几乎没有其他病毒与其同源，这给wssv囊膜蛋白的结构和功能性研究造成了一定的困难。目前为止，wssv依然有很多囊膜蛋白在病毒侵染过程中的功能尚未清楚。尝试了多种wssv囊膜蛋白，无论是沉默受体蛋白，还是用蛋白抗体包埋wssv病毒，抑或是直接用蛋白作为口服疫苗免疫，在wssv经口感染中和实验中，都没有取得较为理想的结果。所以，关于wssv蛋白和受体直接的相互作用还有待进一步研究，以期能够找到wssv经口侵染中最为关键的囊膜蛋白，并制备相应的小分子药物以期能够封闭该蛋白，从而达到抑制wssv经口感染的目的。

vp53b是wssv的囊膜蛋白，其功能尚未完全明确。有相关研究表明，vp53b可能与对虾虾体内的几丁质结合蛋白相结合。vp53b开放阅读框为wsv115，理论分子量108kda，在病毒颗粒上的实际分子量为53kda。2007年li通过itraq技术证实vp53b为wssv囊膜蛋白。蛋白质组学分析推测vp53b与离子传导通路相关。2007年chen通过酵母双杂交的方式发现vp53b可以与pmcbp结合。

经检索发现，专利文献cn1831009a，公开日2006.09.13，将编码wssv膜蛋白vp68、vp28、vp466的多核苷酸序列分别克隆到质粒载体pgex4t-2中，转染至大肠杆菌中并诱导表达出wssv膜蛋白的融合蛋白vp68、vp281、vp466，用纯化的融合蛋白vp68、vp281、vp466分别免疫小鼠，制备vp68、vp281、vp466的特异性多克隆抗体，通过皮下肌肉注射的抗病毒实验证明这些抗体具有抗wssv感染的能力。而目前未见使用vp53b制备防治对虾白斑综合征的药物，尤其是口服药物的相关报道，vp53b在wssv感染中的作用还不明确。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供vp53b在wssv感染中的作用，以及vp53b基因及蛋白的用途。

第一方面，本发明提供了vp53b基因、蛋白或它们的片段在制备防治对虾白斑综合征的药物中的应用。

作为一个优选例，所述的药物为口服剂型。

作为一个优选例，vp53b蛋白的序列如seqidno:5所示。

第二方面，本发明提供了vp53b基因、蛋白或它们的片段的抑制剂在制备防治对虾白斑综合征的药物中的应用。

作为一个优选例，所述的药物为口服剂型。

作为一个优选例，vp53b蛋白的序列如seqidno:5所示。

第三方面，本发明提供了一种防治对虾白斑综合征的药物组合物，所述的药物组合物包含vp53b蛋白或其片段，或包含用vp53b蛋白或其片段免疫动物而获得的抗体。

作为一个优选例，所述的药物组合物为口服剂型。本申请中，所述的“vp53b基因、蛋白或它们的片段”是指vp53b的完整基因、vp53b完整基因中的任一片段、vp53b的完整蛋白或vp53b完整蛋白中的任一片段，还包含vp53b的完整基因、vp53b完整基因中的任一片段、vp53b的完整蛋白或vp53b完整蛋白中的任一片段的类似物，还包含在vp53b的完整基因、vp53b完整基因中的任一片段、vp53b的完整蛋白或vp53b完整蛋白中的任一片段的基础上的任意修饰。优选地，vp53b完整蛋白的序列如seqidno:5所示，该序列的序列号为：aal33119.1，参见网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/17016513。

所述的“vp53b基因、蛋白或它们的片段的抑制剂”包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够抑制vp53b基因、蛋白或它们的片段。抑制剂可以是化合物、化学小分子、生物分子。抑制剂的抑制作用包括降低vp53b基因、蛋白或它们的片段的活性，降低vp53b基因、蛋白或它们的片段的稳定性，下调vp53b基因、蛋白或它们的片段的表达，减少vp53b基因、蛋白或它们的片段的有效作用时间等。本发明优点在于：

1、vp53b在wssv囊膜蛋白中的占比很小，而且vp53b蛋白分子量很大，难以进行表达纯化，因此在wssv感染机制研究中，vp53b的功能验证一直被人们忽略，在技术手段上也难以操作。本申请探索了vp53b在wssv经口感染的作用，发明人基于丰富的经验和大量的实验研究，筛选得到vp53b和vp110部分蛋白片段，并生产了多克隆抗体，分别对wssv的病毒颗粒进行孵育，并且将抗体-病毒复合物经口注射到克氏原螯虾体内，通过死亡率的观察及其后续qpcr检测螯虾体内病毒拷贝数，来确认蛋白的多克隆抗体对螯虾的保护效果。平行试验后研究结果显示，vp53b的多克隆抗体保护率可以达到85％。qpcr结果则表明，注射抗体病毒存活的螯虾体内病毒拷贝数浓度在10³copies/mg以下，较之注射病毒对照组病毒拷贝数浓度10⁶-10⁷copies/mg区别明显，这说明vp53b的多克隆抗体可以显著的抑制wssv病毒的经口侵染能力。vp53b很可能是wssv经口感染中的关键蛋白。

2、将vp53b和vp110两种多克隆抗体同时和wssv孵育时，其保护率可以达到90％，几乎可以完全抑制wssv在螯虾中的经口感染能力，二者具有协同效应。

综上，本发明阐明了vp53b在wssv经口感染的作用，为防治对虾白斑综合征提供了一种新的药物作用靶点，可有效预防wssv的感染和传播。

附图说明

图1是vp53b抗体血清包埋wssv经口感染实验结果。

图2是验证兔血清是否对vp53b有中和作用的经口感染实验结果。

图3是vp53b抗体血清包埋wssv肌肉注射实验结果。

图4是vp110抗体血清包埋wssv经口注射螯虾中和实验结果。

图5是vp110和vp53b抗体血清包埋wssv经口注射螯虾中和实验结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

在本发明的研究中，选用克氏原螯虾(procambarusclarkii)作为研究对象，采用wssv囊膜蛋白抗体虾体内中和实验验证功能。

克氏原螯虾俗称淡水小龙虾，也是wssv的重要感染对象之一。由于其相对于对虾具有易实验室驯化、易获得(四季皆有)等优势，常常作为研究wssv的重要实验对象。

研究wssv囊膜蛋白在病毒侵染中的作用所采用的常见方法一般分为三种，包括重组蛋白的疫苗保护、rna干扰基因沉默虾体内相应的受体蛋白以及制备wssv囊膜蛋白抗体在虾体内进行中和实验。具体而言：重组蛋白的疫苗保护主要通过真核或者原核表达系统对研究的目标蛋白进行表达纯化，得到重组蛋白后，按照一定的比例加入到用于投喂实验用虾的饲料中去。经口投喂或注射wssv病毒液后，一段时间后观察实验组虾的死亡及病毒侵染情况确定重组蛋白的保护效果及保护率。rna干扰沉默虾体内的受体蛋白方法的使用条件一般是已经发现wssv的囊膜蛋白可能与虾受体的某种蛋白相结合，通过基因沉默虾体内该种蛋白的表达，使目的蛋白无法与受体相结合，进行攻毒试验后，观察实验组虾死亡率确定该目的蛋白是否为wssv侵染的关键蛋白。抗体中和实验的方法同样需要对研究蛋白进行蛋白表达纯化，通过蛋白样品制备单克隆或多克隆抗体，再利用该抗体对wssv病毒颗粒进行孵育包埋从而阻断目的蛋白与受体蛋白的结合，使用经抗体包埋后的病毒颗粒经口或肌肉注射至虾体内，同样通过观察实验组虾的死亡率及病毒在虾体内的富集情况来判断实验目标蛋白是否是wssv侵染的关键蛋白。在本实验中则采用第三种方法，第三种方法相对于前两种而言，手段更有针对性且更加直接——直接包埋目标蛋白，使其部分丧失其生物活性，研究结果也较为稳定，具有一定的可靠性。

实施例1wssv囊膜蛋白vp53b的功能研究

通过一系列软件预测与分析找到vp53b抗原决定簇最多的一条片段并利用新西兰兔子制备多克隆兔抗血清及多克隆抗体。具体地，利用在线软件bepipred1.0server及iedbanalysisresource对vp53b进行抗原表位预测分析，选择并合成vp53b多肽片段srykqrdphtglp(seqidno:1)免疫新西兰大白兔获取抗vp53b多克隆抗体。抗体的制备由上海佑隆生物科技有限公司完成。采用westernblotting及elisa等方法，验证抗体特异性和灵敏度。结果该抗体具备很高的特异性和灵敏度。

为验证vp53b是wssv经口感染关键因子，采用vp53b多抗包埋wssv病毒颗粒，分别采用经口、肌肉注射的方式，选取螯虾为实验对象，通过观察实验组螯虾的死亡情况和qpcr检测螯虾体内病毒含量，得到vp53b多抗在螯虾体内中和效果，从而确定vp53b是否是wssv经口感染关键因子。

1材料与方法

1.1实验样品

健康的螯虾2015年4月至2016年12月分别购买自上海浦东新区芦潮港水产市场和江苏苏州吴江水产市场，体长(7.5±0.4)cm，体重(15.3±1.5)g。1.2实验试剂

海洋动物组织提取试剂盒，质粒小提试剂盒，克隆菌株top10购自天根生化技术有限公司。pcr相关试剂(pcrmixbuffer，双蒸水)购自takara公司。100bpdna分子标尺，λdna分子标尺loadingbuffer，加有氨苄的lb固体培养基(氨苄与培养基体积比为1:1000)，lb液体培养基，t4dna连接酶购自上海生工生物技术有限公司。vp53b多克隆抗体兔血清(由上海佑隆生物科技有限公司制备)，wssvqpcr绝对定量标准质粒(实验室自有)。sybrgreenmasterqpcr荧光染料购自roche公司。其他基本试剂购自国药试剂公司及上海生工生物技术有限公司。wssv-tw病毒(台湾株)原液(来自台湾成功大学罗竹芳老师实验室)。

1.3方法

1.3.1螯虾本体检测

采取qpcr的方法对螯虾进行wssv本体检测。将提取后的螯虾基因组(200ng)作为模板加入qpcr反应体系，得到qpcr结果以确定螯虾是否感染wssv。qpcr引物为vp28-140f(seqidno:2)：aggtgtggaacaacacatcaag/vp28-140r(seqidno:3)：tgccaacttcatcctcatca，每个qpcr反应体系为20μl：vp28-140f(10μm)0.6μl，vp28-140r(10μm)0.6μl，sybrgreenmaster(rox)1μl，ddh2o2μl，螯虾基因组2μl。

1.3.2经口侵染实验

在实验室暂养一周后的螯虾中(养殖水温约25℃)，挑选60只形态完好，活力较好，体型相似的螯虾分为三组：实验组、阳性对照组和阴性对照组，每组各20只。具体各组处理方式为：

(1)实验组

将100μl10⁷copies/μl的wssv病毒液和100μlvp53b多克隆抗体血清稀释液(根据vp28的肌肉注射实验中，病毒剂量和抗体剂量的比例，确定稀释倍数为20000倍)混合，28℃，300rpm在金属浴中孵育60min，每只螯虾利用移液枪(灭菌后的枪头前端用软管包裹住以防对螯虾口器造成物理损伤)经口注射200μl孵育液。

(2)阳性对照组

将病毒液稀释至5×10⁶copies/μl，取200μl稀释后的病毒液在28℃，300rpm金属浴中放置60min后，经口注射至螯虾体内。

(3)阴性对照组

取200μltne溶液(0.05mtris-hcl，0.1mnacl，0.001medta，ph＝7.4)在28℃，300rpm金属浴中放置60min后，经口注射至螯虾体内。

表1vp53b经口感染实验分组

为了排除抗体制备过程中兔血清对vp53b的中和作用，特别做了一次中和实验：阳性对照组为wssv-tw，阴性对照组为tne，试验组1为wssv-tw+兔血清，试验组2为wssv-tw+vp53b多抗。试验组1处理方式为：将100μl10⁷copies/μl的wssv病毒液和100μl不含vp53b多克隆抗体血清稀释液(稀释倍数和实验组相同)混合，28℃，300rpm在金属浴中孵育60min，每只螯虾利用移液枪(灭菌后的枪头前端用软管包裹住以防对螯虾口器造成物理损伤)经口注射200μl孵育液。

采用试验方案如下：

表2验证兔血清对wssv经口侵染效果分组

观察18天后收集实验结果：螯虾虾死亡率；qpcr定量螯虾虾肌肉中的wssv颗粒数量；重复实验三次。

1.3.3肌肉注射实验

参照设置相似的试验组。各组注射液处理方式与经口注射相似。采取肌肉注射的方式感染健康螯虾。注射方式为无菌注射器29号针头注射健康螯虾的第四腹节。各组处理方式如下：

表3vp53b肌肉注射实验分组

观察18天后收集实验结果：螯虾虾死亡率；qpcr定量螯虾虾肌肉中的wssv颗粒数量。

2结果与分析

2.1螯虾本体检测结果

对十只螯虾qpcr(eff＝100.53％，r²＝0.999)本体检测结果显示，螯虾中不含有wssv病毒，可以确定为未被wssv病毒感染。

2.2经口侵染实验结果

经口感染试验，实验平行三次。第一次经口感染实验中，阴性对照组在实验观察期内并无螯虾死亡，阳性对照组在实验第十天开始死亡，之后在实验第十五天死亡率达到100％。对所有死亡螯虾进行wssv检测，20只螯虾均检测到wssv，且浓度在1.34×10⁷-1.73×10⁸copies/mg。实验组在实验第十四天有2只螯虾死亡，后四天并无死亡。累积死亡率仅为10％(图1)。

第二次经口感染试验，阴性对照组与第一次结果相同，阳性对照组在实验第十一天开始死亡，之后在实验第十七天死亡率达到100％。对所有死亡螯虾进行wssv检测，20只螯虾均检测到wssv，且浓度在2.14×10⁷-1.72×10⁸copies/mg。实验组在实验第十四天有3只螯虾死亡，后四天并无死亡，累计死亡率为15％。

第三次实验与第二次实验结果类似，最终实验组累计死亡率仅为20％，远低于阳性对照组100％的累计死亡率，而对螯虾进行qpcr检测发现，存活的螯虾wssv的浓度在10³copies/mg以下，远低于阳性对照组wssv的平均浓度10⁷-10⁸copies/mg，说明vp53b蛋白抗体保护效果明显，进一步验证了vp53b是wssv经口感染的关键因子。

在兔血清是否对vp53b有中和作用的经口感染实验中，阴性对照组仍然与第一次结果相同，阳性对照组在实验第十天开始死亡，之后在实验第十七天死亡率达到100％。对所有死亡螯虾进行wssv检测，20只螯虾均检测到wssv，且浓度在1.58×10⁷-2.31×10⁸copies/mg。实验组1在实验第十一天开始死亡，之后在实验第十八天死亡率达到100％。对所有死亡螯虾进行wssv检测，20只螯虾均检测到wssv，且浓度在8.45×10⁶-1.22×10⁸copies/mg。实验组2共有4只螯虾死亡，累积死亡率仅为20％。对4只死亡的螯虾进行wssv检测，发现少量的wssv(浓度皆在10³copies/mg以下)。说明兔血清对经口注射wssv的螯虾没有保护效果(图2)。

2.3肌肉注射实验结果

阴性对照组在实验观察期内并无螯虾死亡，阳性对照组在实验第二天开始死亡，之后在实验第八天死亡率达到100％。对所有死亡螯虾进行wssv检测，20只螯虾均检测到wssv，且浓度在1.44×10⁷-1.17×10⁸copies/mg。实验组在实验第二天开始死亡，之后在实验第七天死亡率达到100％。对所有死亡螯虾进行wssv检测，20只螯虾均检测到wssv，且浓度在5.48×10⁶-1.62×10⁸copies/mg。说明vp53b抗体对于wssv肌肉注射感染方式没有保护效果(图3)。

3结论

我们的实验发现经过vp53b抗体包埋过的wssv病毒基本失去了经口感染能力，说明vp53b是wssv的经口感染关键因子，在经口感染中起到了相当重要的作用。通过抗体所封闭的vp53b中的抗原决定簇很可能在抗原和螯虾肠道受体结合的过程中起到决定性作用。而在肌肉注射实验中，vp53b抗体没有表现出保护效果，说明vp53b可能并不参与病毒在细胞内的增殖和复制。尽管vp53b在wssv囊膜中占的比重很小，但其多克隆抗体却表现出了优于其他病毒囊膜蛋白抗体的保护作用。然而，具体到vp53b如何在wssv侵染中发挥作用，是帮助病毒粘附到螯虾肠道细胞表面还是帮助病毒进入到螯虾细胞内，亦或是有其他作用，还需要进一步的探究。

实施例2wssv囊膜蛋白vp110的功能研究

与vp53b相似，vp110也是存在于wssv囊膜中的一种蛋白。采用与探究vp53b功能的类似方法，同样采用通过vp110多克隆抗体和wssv病毒相结合的方法，来观察经过vp110多克隆抗体包埋过的病毒是否仍然具有经口感染螯虾的能力。为此，我们实验室选取了vp110n端150aa-600aa这一片段进行蛋白的原核表达与纯化，成功纯化出小片段蛋白。使用在线软件bepipred1.0server(http://www.cbs.dtu.dk/services/bepipred/)和iedbanalysisresource(http://tools.iedb.org/main/)对vp110进行抗原决定簇预测分析。选择亲水性高、表面可能性和抗原决定簇多而且最保守的一段vp110多肽gedpkpycws(seqidno:4)，由上海佑隆生物科技有限公司免疫新西兰大白兔获取抗vp110的多克隆抗体，采用westernblotting及elisa方法，验证抗体特异性和抗体效价。本实验将采用该抗体进行wssv病毒的包埋。

1材料与方法

1.1实验样品

实验样品详见1.1实验样品。

1.2试剂

vp110多克隆抗体(效价1:243000)，其他试剂与1.2相同。

1.3方法

1.3.1经口侵染实验

在实验室暂养一周后的螯虾中(养殖水温约25℃)，挑选45只形态完好，活力较好，体型相似的螯虾分为三组：实验组、阳性对照组和阴性对照组，每组各15只。具体各组处理方式为：

(1)实验组

将100μl10⁷copies/μl的wssv病毒液和100μlvp110多克隆抗体混合，28℃，300rpm在金属浴中孵育60min，每只螯虾利用移液枪(灭菌后的枪头前端用软管包裹住以防对螯虾口器造成物理损伤)经口注射200μl孵育液。

(2)阳性对照组

将病毒液稀释至5×10⁶copies/μl，取200μl稀释后的病毒液在28℃，300rpm金属浴中放置60min后，经口注射至螯虾体内。观察20天后收集实验结果：螯虾虾死亡率；qpcr定量螯虾虾肌肉中的wssv颗粒数量。

(3)阴性对照组

取200μltne溶液(0.05mtris-hcl，0.1mnacl，0.001medta，ph＝7.4)在28℃，300rpm金属浴中放置60min后，经口注射至螯虾体内。

表4vp110经口感染实验分组

观察20天后收集实验结果：螯虾虾死亡率；qpcr定量螯虾虾肌肉中的wssv颗粒数量；重复实验三次。

2结果与分析

2.1vp110攻毒实验结果

平行三次实验，使用经vp110抗体包埋过的wssv经口侵染螯虾，螯虾在二十天内的累计死亡率分别为46％、40％和46％，阴性对照组未发生螯虾死亡，阳性对照组在十五天内全部死亡。根据qpcr对实验组和阴性对照组死亡螯虾肌肉的检测结果，发现死亡的螯虾均是由于wssv病毒侵染所致，其病毒感染量达到约为10⁷到10⁸copies/mg，这一结果与之前的实验结果类似，而通过qpcr在实验组存活的螯虾中发现了相对较低载量的wssv病毒，其感染量在10⁴copies/mg以下，证明vp110抗体确实部分抑制了wssv经口感染螯虾的能力(图4)。然而，相对于vp53b，从实验组螯虾的死亡率及实验组存活螯虾肌肉的病毒载量看，vp110的抗体抑制病毒侵染能力的效果逊色很多。

实施例3wssv囊膜蛋白vp53b和vp110协同作用分析

实验证明，vp110和vp53b单个蛋白多抗包埋过的病毒经口感染能力下降明显，分别有超过40％和80％的螯虾经口注射后存活。故使用vp110和vp53b多抗共包埋wssv病毒，观察两种蛋白多抗在螯虾体内的中和效果。

1材料与方法

1.1实验样品

实验样品详见1.1实验样品。

1.2试剂

vp110多克隆抗体(效价1:243000)，其他试剂与1.2相同。

1.3方法

1.3.1经口侵染实验

实验室暂养一周后的螯虾中，挑选45只活力较好，体型相似的螯虾分为三组：实验组，阳性对照组和阴性对照组，每组各15只。各组处理方式为：

(1)实验组

将100μl10⁷copies/μl的wssv病毒液和100μlvp110多抗血清稀释液以及100μlvp53b多抗血清稀释液混合(稀释倍数为20000倍)，28℃，300rpm在金属浴中孵育60min，每只螯虾利用移液枪(灭菌后的枪头用细软管包裹住以防对螯虾口器造成物理损伤)经口注射300μl孵育液。

(2)阳性对照组

将病毒液稀释至3.3×10⁶copies/μl，取300μl稀释后的病毒液在28℃，300rpm金属浴中放置60min后，经口注射至螯虾体内。观察24天后收集实验结果：螯虾虾死亡率；qpcr定量螯虾虾肌肉中的wssv颗粒数量。

(3)阴性对照组

取300μltne溶液(0.05mtris-hcl，0.1mnacl，0.001medta，ph＝7.4)，在28℃，300rpm金属浴中放置60min后，经口注射至螯虾体内。

表5vp110多抗和vp53b多抗包埋wssv经口注射实验分组

观察19天后收集实验结果：螯虾虾死亡率；qpcr定量螯虾虾肌肉中的wssv颗粒数量。

2结果与分析

阴性对照组在实验观察期内并无螯虾死亡，阳性对照组在实验第十天开始死亡，之后在实验第十七天死亡率达到100％。对所有死亡螯虾进行wssv检测，20只螯虾均检测到wssv，且浓度在1.86×10⁷-1.28×10⁸copies/mg。实验组在实验第十三天有1只螯虾死亡，后六天并无死亡。累积死亡率仅仅为5％(图5)。

3讨论

在vp110和vp53b抗体共同包埋wssv病毒颗粒的实验中，我们发现在被抗体处理过的病毒其经口感染能力显著下降，对螯虾所造成的死亡率仅有5％，这一结果也好于仅使用vp110或vp53b单一一种抗体处理病毒的方式。对比肌肉注射和经口注射，在自然条件下，经口感染是wssv病毒的主要传播方式，所以，研究wssv经口感染具有相当的现实意义，而在vp110抗体和vp53b抗体的共同作用下，wssv几乎丧失经口感染能力这一发现，将为未来研究并解决对虾白斑综合征提供新的思路。

在以上实施例的实验设计上，200μl及300μl的注射体积已经不会影响病毒对机体的侵染，都已经远远超过自然界中病毒侵染的剂量，我们选择用100μl的抗体进行中和后发现，vp53b及vp110的抗体均起一定的保护作用，那么在同等剂量的试验下，我们发现将这两种抗体同时包埋病毒颗粒的时候，其保护效果是叠加的，并没有互相抵抗或抗原表位竞争，可以说明其作用效果是叠加的，而不是因为浓度的大小导致侵染的效果降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>上海海洋大学

<120>vp53b基因及蛋白在制备防治对虾白斑综合征的药物中的应用

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