环介导恒温扩增法检测苎麻疫霉菌的引物及其检测方法与流程

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及环介导恒温扩增法检测苎麻疫霉菌的引物及其检测方法，可用于苎麻疫霉菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于苎麻疫霉菌所引起病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术：

棉花、苎麻均是我国重要的经济作物。中国是世界上主要棉花生产国和消费国，棉花产业发展直接关系到广大农民的利益，关系到纺织工业的发展，对中国国民经济影响较大，对世界经济发展也有重要意义；苎麻是我国传统特产，中国苎麻种植面积和产量均占世界之首，加工规模和出口量在国际市场上占支配地位。在棉花和苎麻种植过程中要经受多种病虫害危害，其中由苎麻疫霉菌phytophthoraboehmeriaesawada侵染引致的棉花、苎麻疫病对棉花和苎麻威胁极大，该病原菌常导致棉花烂铃、死苗，苎麻叶斑、茎腐，是严重影响棉花和苎麻产量和品质的关键因素之一。因此建立苎麻疫霉菌快速分子检测、鉴定技术研究，开展其引起疫病的早期检测，对于防止棉花、苎麻疫病的扩散、蔓延和减少经济损失具有重要意义。

疫霉菌传统的检测鉴定方法主要通过对分离物形态学特征、生物学、致病性和生理生化特征指标作为依据，对照已有的研究资料确定其分类地位。但由于疫霉属卵菌形态变异大，一些用于分类、鉴定的形态学特征易受人为因素和环境条件影响，具有很大的不稳定性，特别是分离物不典型或不产孢时，使得鉴定工作更加困难。因此，传统检测鉴定方法不仅存在着检测所需时间太长、程序繁琐、灵敏度低和经验性强等不足，而且还存在着难以从发病初期的植株中分离鉴定出病原菌，难以对病害的早期做出准确诊断，也难以给病害防治提供有效防治时期等缺点。

近年来，随着分子生物学技术在植物病理学中的不断发展，特别是pcr技术及相关分子标记技术已广泛地应用于疫霉菌的检测鉴定中，使得疫霉菌的检测鉴定技术取得了长足的进步。相对传统生物学方法，pcr检测技术具有特异性强、灵敏度高、可重复性强、受外界因素影响较小等优点，但其检测需要昂贵精密的pcr仪等仪器设备，且检测过程繁杂、对操作人员的熟练度和专业技术水平要求比较高，且耗时较长，不利于在基层推广，而且植物病害防控的关键在于对病原微生物的快速、准确和及早的检测并确诊。因此很有必要开发一种简便易行、可以快速、准确检测疫霉菌的方法。

日本科学家notomi等于2000年研发了一种名为环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)的核酸体外扩增技术。该技术主要采用能够识别靶标基因保守dna序列中的6个特异性位点的4条引物，利用一种链置换bstdna聚合酶在60-65℃恒温条件下进行大量扩增目标dna反应。lamp反应产物可以通过浊度仪、凝胶电泳仪和肉眼识别进行检测，该方法具有操作简单、特异性高、成本低、快速、高效和经济等优点，已广泛被应用于疫霉菌的分子检测鉴定中。国内外尚未见lamp方法检测苎麻疫霉菌的报道。本发明根据苎麻疫霉菌its保守序列设计特异性引物，优化反应体系，建立了快速、灵敏和可视化的lamp检测体系，为苎麻疫霉菌的检测鉴定提供理论基础和技术方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供环介导恒温扩增法检测苎麻疫霉菌的引物及其检测方法，针对现有技术中对苎麻疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有pcr分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了苎麻疫霉菌的分子检测方法，对苎麻疫霉菌进行lamp检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1.苎麻疫霉菌lamp检测特异性引物的设计：

通过测定苎麻疫霉菌（phytophthoraboehmeriae）和其它病原菌的核糖体转录间隔区（its）基因，对疫霉属不同种间its基因序列进行比对分析，利用在线lamp引物设计软件primersoftwareexplorerv4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;eikenchemicalco.,japan)设计一套苎麻疫霉菌特异性lamp引物组，由f3、b3、fip和bip组成，引物序列如下：f3:5’-ttccttccgtgtagtcggt-3’，b3:5’-ccgaaaccaacactaccgc-3’，fip:5’-atttcaaaggactcgccgccg-gggaatgccagacgtgaag-3’，bip:5’-atgtatgttgtggaggctgcca-cctctccaaaacgcctcag-3’。

2.苎麻疫霉菌lamp检测方法的建立，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组dna。

用于检测病原菌纯培养物时，采用ctab法进行提取基因组dna，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5ml离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µl2%ctab（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%ctab；100mmol/ltris-hcl,ph8.0；20mmol/ledta，ph8.0；1.4mol/lnacl）和90µlsds（十二烷基苯磺酸钠）【注：ctab，sds需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（dna释放至缓冲液中），12000r·min^-1离心15min；取上清液700µl，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min^-1离心9min；取上清液500µl，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min^-1离心5min；取上清液350µl，加入上清液体积1/10的3mol·l^-1naac和上清液体积2倍的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min^-1离心5min；弃去上清液，加入700µl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干至无酒精味，加入30~60µlte（10mmol/ltris-hcl，0.1mmol/ledta，ph8.0）溶液进行溶解，得到dna溶液，用紫外分光光度计检测dna浓度并稀释至100ng/µl待用。

用于检测植物组织中存在苎麻疫霉菌时，采用naoh快速裂解法提取dna，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µl0.5mol/lnaoh，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5ml离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5µl加入495µl0.1mol/ltris-hcl（ph=8.0）混合均匀，取1.0µl作为pcr模板进行扩增；

用于检测土壤样品中存在苎麻疫霉菌时，采用土壤dna提取试剂盒，提取dna。

（2）lamp反应体系的建立：以步骤（1）提取的dna为模板，在pcr管中配制25μl反应体系，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2wt.%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；

（3）lamp反应条件：将配制好的pcr管于63℃水浴锅中恒温反应60min；

（4）反应结果的测定：待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，常光显色结果观察到绿色荧光的为阳性，即样品含苎麻疫霉菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不含苎麻疫霉菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含苎麻疫霉菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含苎麻疫霉菌。

本发明的有益效果：本发明建立了苎麻疫霉菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的lamp检测技术体系，可用于带菌植株组织和土壤中苎麻疫霉菌的检测，或用于苎麻疫霉菌引起病害的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强、结果可靠：本发明分析了苎麻疫霉菌和其他病原菌rdna-its在序列上的差异，选取6个特定区域，设计了4条特异性的lamp引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，具有很强的特异性。本发明利用所设计出的lamp引物基础上建立了苎麻疫霉菌lamp检测方法，只有苎麻疫霉菌能检测出来，其它病原菌均未检测出，多次试验结果均一致，说明本发明lamp检测方法特异性强，结果可靠。

2、灵敏度高：本发明对苎麻疫霉菌的检测灵敏度在dna水平上可达到10fg/μl，具有很高的灵敏性。

3、快速：应用本发明检测方法，在1～1.5h得到检测结果，而以往的pcr或巢式pcr检测需4～6h才得到检测结果，本发明所述方法大大缩短了操作时间，方便快速。

4、成本低、易操作、简单：本发明最大的优点是不需要以往pcr检测所需要的pcr仪、电泳仪、凝胶成像系统等昂贵的专业仪器，仅需一台廉价的恒温仪器，如水浴锅，省去了繁琐的操作步骤和规程，简单易行。

5、检测结果直观，肉眼可判断：本发明扩增产物可通过加显色剂进行染色，常光下显色反应绿色的为阳性，即待测样品中含苎麻疫霉菌，橙色的为阴性，说明待测样品中不含苎麻疫霉菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含苎麻疫霉菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含苎麻疫霉菌。肉眼可判断检测结果，无需电泳检测及凝胶成像。

附图说明

图1为环介导恒温扩增（lamp）引物在靶标基因its中的位点及序列(引物fip由f2和f1c组成，引物bip由引物b2和b1c组成)。

图2为本发明苎麻疫霉菌的lamp特异性检测。a为lamp扩增后的常光照射可视化显色，b为lamp扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1-3为苎麻疫霉菌，4-6分别为烟草疫霉菌、芋疫霉菌和辣椒疫霉菌，7为阴性对照，1-3显示绿色荧光。

图3为本发明苎麻疫霉菌lamp检测灵敏性。a为lamp扩增后的常光照射可视化显色，b为lamp扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1-8模板dna浓度分别为100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、10ag，9为阴性对照，1-5显示绿色荧光。

图4为本发明检测方法对发病叶片中苎麻疫霉菌的检测。a为lamp扩增后的常光照射可视化显色，b为lamp扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1为阳性对照，2-3、6-7、9为苎麻疫霉菌引起苎麻疫病的发病叶片，4-5、8为健康苎麻叶片，10为阴性对照，1-3、6-7、9显示绿色荧光。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例1：苎麻疫霉菌环介导恒温扩增（lamp）检测特异性引物的设计及引物特异性验证

1.供试菌株基因组dna的提取

采用ctab法提取供试菌株（表1）基因组dna，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5ml离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µl2%ctab（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%ctab；100mmol/ltris-hcl,ph8.0；20mmol/ledta，ph8.0；1.4mol/lnacl）和90µlsds（十二烷基苯磺酸钠）【注：ctab，sds需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（dna释放至缓冲液中），12000r.min^-1离心15min；取上清液700µl，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（酚、氯仿、异戊醇体积比25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min^-1离心9min；取上清液500µl，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min^-1离心5min；取上清液350µl，加入上清液体积1/10的3mol·l^-1naac和上清液体积2倍的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min^-1离心5min；弃去上清液，加入700µl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干至无酒精味，加入30~60µlte（10mmol/ltris-hcl，0.1mmol/ledta，ph8.0）溶液进行溶解，得到dna溶液，用紫外分光光度计检测dna浓度并稀释至100ng/µl待用。

表1供试菌株

2.苎麻疫霉菌lamp检测特异性引物的设计：

通过测定苎麻疫霉菌（phytophthoraboehmeriae）和其它病原菌的核糖体转录间隔区（its）基因，对疫霉属不同种间its基因序列进行比对分析，利用在线lamp引物设计软件primersoftwareexplorerv4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;eikenchemicalco.,japan)设计一套苎麻疫霉菌特异性lamp引物组，由f3、b3、fip和bip组成，引物序列如下：f3:5’-ttccttccgtgtagtcggt-3’，b3:5’-ccgaaaccaacactaccgc-3’，fip:5’-atttcaaaggactcgccgccg-gggaatgccagacgtgaag-3’，bip:5’-atgtatgttgtggaggctgcca-cctctccaaaacgcctcag-3’。引物在靶标基因its中的位点及序列如图1所示。

3.苎麻疫霉菌lamp检测方法的建立及引物特异性验证

以表1供试菌株的dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：63℃温育60min；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品含苎麻疫霉菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不含苎麻疫霉菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含苎麻疫霉菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含苎麻疫霉菌。

4.引物特异性验证结果

lamp扩增结果表明，供试的菌株中只有苎麻疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀，其它病原真菌显色结果为橙色、澄清透明状（图2），说明所设计的苎麻疫霉菌f3、b3、fip和bip可以将苎麻疫霉菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于苎麻疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：苎麻疫霉菌环介导恒温扩增（lamp）检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组dna的制备

用无菌超纯水对苎麻疫霉菌基因组dna进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；

2.lamp检测方法灵敏度测定及结果观察

以不同浓度的苎麻疫霉菌基因组dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2wt.%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：63℃温育60min；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，静置5min，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品含苎麻疫霉菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不含苎麻疫霉菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含苎麻疫霉菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含苎麻疫霉菌。

3.lamp扩增灵敏度检测结果

lamp扩增灵敏度检测结果表明，100pg、10pg、1pg、100fg、10fg/μl浓度的苎麻疫霉菌基因组dna显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀，其余浓度及阴性对照显色结果为橙色、透明状，说明所设计的苎麻疫霉菌引物f3、b3、fip和bip通过lamp扩增，对苎麻疫霉菌的检测灵敏度可达10fg/μl（图3）。

实施例3：发病组织中苎麻疫霉菌的lamp检测

样品采集：从福建福州采集苎麻疫病发病症状典型的叶片及健康叶片带回实验室备用；

植物组织dna的提取：采用naoh快速裂解法提取dna，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µl0.5mol/lnaoh，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5ml离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5µl加入495µl0.1mol/ltris-hcl（ph=8.0）混合均匀，取1.0µl作为pcr模板进行扩增。

扩增检测及观察：以上述提取的dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2wt.%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：63℃温育60min；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，静置5min，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品含苎麻疫霉菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不含苎麻疫霉菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含苎麻疫霉菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含苎麻疫霉菌。

检测结果：检测结果（图4）表明，苎麻疫病发病的叶片通过lamp扩增，显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀，说明存在苎麻疫霉菌，而健康叶片及阴性对照显色结果为橙色、透明状，说明不存在苎麻疫霉菌，该套技术能用于植物组织中苎麻疫霉菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>环介导恒温扩增法检测苎麻疫霉菌的引物及其检测方法

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