一种准确鉴定洋葱S/N细胞质基因型的双显性标记及其应用的制作方法

本发明属于植物育种技术领域，涉及一种洋葱育种的分子标记及其应用，尤其涉及一种鉴定洋葱s/n细胞质基因型的双显性分子标记及其应用，能够应用于分子标记辅助育种来准确的选择洋葱雄性不育系和配套保持系。

背景技术：

洋葱(alliumcepa.l)，别名球葱、圆葱、玉葱、葱头、荷兰葱、皮牙子等，是两年生二倍体植物，属于百合科葱属作物，据记载已有5000多年的栽培历史，洋葱近代传入我国，在我国栽培仅有100多年的历史，但是由于洋葱适应性强又耐贮藏和运输，在我国种植历史虽然短，但发展速度却非常快，在全国各地广泛栽培。产地主要有云南、四川、、江苏、山东、甘肃、内蒙古、新疆等地。目前，我国具有世界最大的洋葱生产面积和产量，其总产量和面积占全世界总产量和面积的近30％，是洋葱生产量较大的4个国家(中国、印度、美国、日本)之一。洋葱不仅可鲜食，还大量用于加工制品，富含多种硫化物和类黄酮类物质，具有降低和预防血栓形成，降血脂、降血糖、抗氧化、抗老化、消炎防癌等保健作用，被誉为蔬菜皇后，深受消费者的喜爱。

1936年美国的jones和emsweller首次在“意大利红”(italianred)品种中发现雄性不育株，其不育性由单个核基因和细胞质共同控制[jonesha.andemswellersl.amalesterileonion.proc.amer.soc.hort.sci.1936,34:582-585]。1943年jones和clarke又发现了雄性不育系[joneshaandclarkea.inheritanceofmalesterilityintheonionandtheproductionofhybridseed.procamer.soc.hort.sci.1943,43:189-194]，随后洋葱成为世界上最早利用杂种优势的蔬菜作物之一。质核互作控制洋葱的育性，用于洋葱杂交种生产有着极大的优势。但是，由于ms基因或者s型细胞质高频率的存在，从一些栽培品种很难成功的得到保持系，比如：“texas1015y”(unitedstates)、“sapporoki”(japan)、“pukekohelongkeeper”(newzealand)。因此，洋葱雄性不育保持系的选育是一项非常费时费力的工作。

近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于dna变异的新手段，即分子标记技术。它直接以dna形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制。havey等研究发现洋葱叶绿体dna上的trnt和trnl间存在高度变异区，即n型细胞质与s型细胞质相比，2个基因间有一段100bp的插入序列，据此设计引物获得了可鉴别洋葱s型和n型细胞质的特征谱带[haveymj.identificationofcytoplasmsusingthepolymerasechainreactiontoaidintheextractionofmaintainerlinesfromopen-pollinatedpopulationsofoniontheorapplgenet.1995,90:263-268.]。后来根据这一插入序列开发出scar标记(ms7/ms8)，在s型细胞质中扩增出850bp的特异片段，而在n型细胞质中扩增出950bp的特异片段，从而可以有效鉴别洋葱n型和s型细胞质[choks，yangtj，kwonys，woojg.developmentandapplicationofscarmarkersrelatedtocytoplamicfactorofmalesterilityinonion.journalofkoreasocietyforhorticulturalsciences.2001,42(5)：527-532.]。sato发现在洋葱s型细胞质的线粒体cob基因上游有一段特异的叶绿体基因的插入序列，利用这一特异序列设计引物进行pcr扩增，在s型细胞质中扩增出1条414bp的特异片段，而在n型细胞质中扩增出1条180bp的特异片段，利用该标记可以快速、准确鉴定洋葱s型、n型细胞质[satoy.pcramplificationofcms-specificmitochondrialnucleotidesequencestoidentifycytoplasmicgenotypesofonion(alliumcepal.)theorapplgenet.1998,96:367-370.]。engelke等发现在细香葱中用来区分细胞质育性的线粒体基因orfa501也存在于洋葱线粒体中，以细香葱雄性不育细胞质线粒体dna的atp9基因的特定序列设计引物orfa501，扩增洋葱线粒体dna，成功开发出了特异pcr标记，可以将可育的n型与不育(s型或t型)细胞质区分开来[engelket,terefed,tatlioglut.apcr-basedmarkersystemmonitoringcms-(s),cms-(t)and(n)-cytoplasmintheonion(alliumcepal.)theoreticalandappliedgenetics.2003,107(1):162-167.]。kim等在s型和t型细胞质中发现了一个嵌合的开放阅读框orf725，并且开发了一个分子标记，能通过一次简单的pcr区分三种洋葱细胞质类型[kims,leeet,chody,hant,bangh,patilbs,ahnyk,yoonmk.identificationofanovelchimericgene,orf725,anditsuseindevelopmentofamolecularmarkerfordistinguishingamongthreecytoplasmtypeinonion(alliumcepal.)theorapplgenet.2009,118:433-441.]。李永博等通过染色体步移获得了细香葱orfa501的侧翼序列，开发了鉴定洋葱细胞质基因型的scar标记，该标记在洋葱不育系中扩增出一条2175bp的特异条带和1053bp的条带，而保持系中仅扩增出1053bp的条带[李永博,刘冰江,霍雨猛,缪军,杨建平,吴雄,杨妍妍.洋葱细胞质雄性不育基因分子标记的开发.山东农业科学.2015,(6):1-4.]，与传统的“测交-回交、自交”等方法相比，这种技术可大大缩短两系的选育年限，提高育种效率。

洋葱起源于中亚地区，传入我国的历史较短。由于洋葱是两年生植物，其育种年限是白菜、萝卜等蔬菜的2-4倍，而且我国洋葱的种质资源相对匮乏，雄性不育技术在蔬菜上的利用也远落后于其他发达国家，杂交种的市场几乎是被国外品种所垄断。随着农业产业结构的调整，对洋葱优良品种的需求日益增加，生产上主要以品种引进和常规品种选育为主，缺少具有我国自主知识产权的杂交一代品种，需要花费大量的外汇从国外进口种子，使洋葱的生产成本居高不下。因此，要改变我国在洋葱育种领域上的落后局面，关键在于尽快广泛收集品种资源，走现代分子生物学技术与常规育种相结合的道路。加快分子标记辅助选择洋葱保持系的研究，从而缩短育种年限，尽快选育出具有我国自主知识产权的而且满足市场需求的洋葱杂交种。因此，优良雄性不育系和保持系的选育是洋葱育种中亟待解决的关键环节，也是洋葱产业化的源头工作。

基因标记的目的是实现分子标记辅助育种(markerassistedselection,mas)。无论是与细胞质位点还是与核基因连锁的标记的辅助选择都可减少工作量，提高育种效率。利用与细胞质位点连锁的标记，可鉴别出单株的细胞质类型，淘汰可育材料中s型细胞质，只从n型细胞质类型的单株中选保持系，从而减少测交组合数和自交株数，减少工作量，避免盲目性，提高选择效果。在洋葱实际育种工作中，从一个未知细胞质类型的群体中选择n型细胞质单株是最关键的核心工作。前期发明人课题组已经开发了一个洋葱细胞质雄性不育scar标记(专利授权号：zl201410153951.2)，利用该标记在s型细胞质能扩增出2175bp的特异条带和1053bp的条带，而n型细胞质中仅扩增出1053bp的条带。虽然该标记能够有效的避免因为实验操作失误和无效的pcr扩增而导致细胞质类型错误分类的情况，但是由于缺乏稳定的n型细胞质特异性标记，在大的群体中选择保持系时，无法从混合群体样品提取dna进行初步筛选有无保持系单株，只能进行单株验证，影响了选择效率。因此开发一种新的n型细胞质特异性标记，尤其是s/n特异的双显性标记，对于洋葱选育不育系和保持系配套，选育洋葱杂交种具有重要意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明一种准确鉴定洋葱s/n细胞质基因型的双显性标记。本发明以洋葱(alliumcepal.)雄性不育系和保持系为试材，对洋葱线粒体全基因组中的58个orfs进行差异表达分析，发现了一个表达差异片段orf393。利用orf393的全长引物对洋葱s型细胞质雄性不育系s118和保持系n218的基因组dna进行pcr扩增，orf393在不育系和保持系中的扩增片段大小有微小的差异。经过回收、克隆、测序和dna序列比对发现，orf393在洋葱保持系中的扩增片段与不育系相比，缺失了36个碱基，根据orf393在不育系和保持系中的差异序列，开发了鉴定洋葱细胞质基因型的双显性scar标记。利用得到的分子标记对洋葱材料的细胞质类型进行快速而又准确的判断，不仅避免了实验操作失误和无效的pcr扩增而导致的细胞质基因型的错误分类，而且在大量的群体中选择保持系时，可以混合群体样品提取dna进行初步筛选有无保持系单株，大大提高了选择效率，节约了时间和成本，加快洋葱保持系的选育，建立新型的洋葱杂交种亲本选配体系。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明公开了一种鉴定洋葱s/n细胞质基因型的双显性标记，所述分子标记的特异片段长度分别为232bp和196bp，其中，特异片段长度为232bp的标记为s型细胞质特有的，其核苷酸序列如seqidno.1所示；特异片段长度为196bp的标记为n型细胞质所特有的，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

其次，本发明公开了一种鉴定洋葱细胞质基因型的双显性scar标记引物，所述引物分别为：

正向引物：gxx-f1：5'-cccgaaggagtgactttttctgattt-3'(seqidno.5)；

反向引物：gxx-r1：5'-tctctggagcaccgactgaaggg-3'(seqidno.6)。

基于该双显性scar标记引物，本发明还公开了一种鉴定洋葱细胞质基因型的试剂盒，所述试剂盒包括上述双显性scar标记引物，此外还包括常规pcr扩增试剂。

此外，本发明公开了上述双显性标记、线粒体orf393或双显性scar标记引物在洋葱育种中的应用，尤其是洋葱保持系的选育。

该应用中，orf393在洋葱不育系中的扩增片段大小为1179bp，其核苷酸序列如seqidno.3所示；orf393在洋葱保持系中的扩增片段大小为1143bp，其核苷酸序列如seqidno.4所示。

具体的实施方式中，上述双显性标记、线粒体orf393或双显性scar标记引物用于鉴定洋葱s/n细胞质基因型。

所述双显性标记作为分子标记应用于辅助选育洋葱雄性不育系和配套保持系，具体应用方式为：利用双显性标记的引物对待测个体的基因组dna进行pcr扩增，若待测个体只扩增出232bp的片段，则该待测个体的细胞质类型为s型细胞质，若扩增出196bp的片段，则该待测个体的细胞质类型为n型细胞质。结合申请人之前开发的判断细胞核类型的技术(授权专利号：zl201310125445.8)，可直接筛选洋葱雄性不育系和保持系。

基于上述应用，具体的本发明公开了一种洋葱混合群体样品筛选保持系的方法，所述方法包括针对上述双显性标记、线粒体orf393设计引物并扩增的过程；或者利用上述双显性scar标记引物进行扩增的过程。

具体的，在大的群体中选择保持系时，可以混合群体样品提取dna进行初步筛选有无保持系单株，如果混合群体dna中扩增出196bp的特异性条带说明此群体中存在n型细胞质，有必要进行单株筛选。

本发明以洋葱(alliumcepal.)雄性不育系和保持系为试材，对洋葱线粒体全基因组中的58个orfs进行差异表达分析，发现了一个表达差异片段orf393。利用orf393的全长引物对洋葱s型细胞质雄性不育系s118和保持系n218的基因组dna进行pcr扩增，结果在不育系和保持系中的扩增片段大小有微小的差异。本发明人对差异片段经过回收测序和dna序列比对分析，orf393在洋葱不育系中的扩增片段大小为1179bp，其核苷酸序列如seqidno.3所示；而orf393在洋葱保持系中的扩增片段大小为1143bp，其核苷酸序列如seqidno.4所示，与不育系相比缺失了36个碱基。根据orf393在不育系和保持系中的差异序列，应用primerpremier5.0本发明人设计了一对分子标记引物，正向引物：gxx-f1：5'-cccgaaggagtgactttttctgattt-3'；反向引物：gxx-r1：5'-tctctggagcaccgactgaaggg-3'。使用正向引物gxx-f1和反向引物gxx-r1，对洋葱细胞质雄性不育系s118及其相应的保持系n218的总dna进行pcr扩增，不育系s118均扩增出了一条232bp的特异性条带，相应的保持系n218扩增出了一条196bp的特异性条带。对具有不同遗传背景的已知细胞质基因型的10个组合材料进行pcr验证(见表1)，所有的不育系中均扩增出一条232bp的特异性条带，所有的保持系均扩增出一条196bp的特异性条带，pcr结果与田间判断结果吻合。说明应用这对引物完全可以准确的鉴别洋葱的s和n型细胞质，不仅避免了实验操作失误和无效的pcr扩增而导致的细胞质基因型的错误分类，而且在大量的群体中选择保持系时，可以混合群体样品提取dna进行初步筛选有无保持系单株，大大提高了选择效率。

上述分子标记引物的筛选过程如下：

(1)选用洋葱细胞质雄性不育系118和对应的保持系n218；

(2)采用北京天根生化科技有限公司生产的快捷型植物基因组提取试剂盒和rnapreppure植物总rna提取试剂盒分别提取洋葱基因组总dna和rna；

(3)对洋葱线粒体全基因组中的58个orfs进行差异表达分析，发现了一个表达差异片段orf393。

(4)利用表达差异片段orf393的全长引物扩增洋葱细胞质雄性不育系和保持系的总dna；

(5)从不育系和保持系中回收片断，经连接、转化、克隆测序后，获得不育系和保持系之间的dna差异序列；

(6)利用dna差异序列设计引物，对不育系s118和保持系n218进行验证；

(7)利用200份已知基因型的其他个体材料验证该标记的可行性，获得了一种鉴定洋葱s/n细胞质类型的双显性标记。

本发明取得了以下有益效果：

本发明选用洋葱细胞质雄性不育系s118及其相应的保持系n218的总dna进行pcr扩增，获得了区分s/n细胞质的稳定的双显性标记，标记稳定可靠，为洋葱分子标记辅助选择育种体系奠定了基础。与目前技术相比，其优点是：本发明涉及的鉴定洋葱细胞质基因型的分子标记，在s型细胞质中有一条232bp的特异条带，在n型细胞质中均能扩增出一条196bp的条带，是一种双显性标记。这种扩增结果不仅避免了实验操作失误和无效的pcr扩增而导致的细胞质基因型的错误分类，而且在大的群体中选择保持系时，可以混合群体样品提取dna进行初步筛选有无保持系单株，如果混合群体dna中扩增出196bp的特异性条带说明此群体中存在n型细胞质，有必要进行单株筛选。如果混合群体dna中只扩增出232bp的特异性条带，说明该群体中没有n型细胞质单株，则可以直接群体淘汰，大大提高了选择效率。既保证了鉴定结果的准确可靠性，又节约了时间和成本。

附图说明

图1不育系及其保持系的dna电泳图谱。其中：m为marker，1-8为不育单株，9-16为可育单株。

图2不育系及其保持系的rna电泳图谱。其中：m为marker，1-5为不育单株，6-10为可育单株。

图358个orfs的部分pcr扩增结果。其中：其中：m为marker，s为s118的不育单株，n为n218的可育单株。

图4引物gxx-f1和gxx-r1对洋葱不育系及其保持系的pcr扩增结果。其中：m为marker，s为s118的不育单株，n为n218的可育单株。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

实施例1

(一)材料与方法

1、dna和rna的提取与检测

洋葱细胞质雄性不育系及其相应的保持系基因组dna的提取方法参照北京天根生化科技有限公司生产的快捷型植物基因组提取试剂盒说明书，总rna的提取参照北京天根生化科技有限公司生产的rnapreppure植物总rna提取试剂盒说明书，琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测dna和rna的质量。

2、表达差异片段的获得

在已公开的洋葱cms-s线粒体全基因组序列(genbankaccession:ku318712)中，发现了58个新的orfs，本发明人以洋葱不育系s118和保持系n218的cdna为模版，对58个orfs进行差异表达分析，获得了一个表达差异片段orf393(图3)。

3特异条带回收纯化、克隆与测序

利用orf393的全长引物对洋葱s型细胞质雄性不育系s118和保持系n218的基因组dna进行pcr扩增，结果在不育系和保持系中的扩增片段大小有微小的差异。本发明人对差异片段经过回收测序和dna序列比对分析，orf393在洋葱不育系中的扩增片段大小为1179bp，其核苷酸序列如seqidno.3所示；而orf393在洋葱保持系中的扩增片段大小为1143bp，其核苷酸序列如seqidno.4所示，与不育系相比缺失了36个碱基。

特异条带的回收参照biospingelextractionkit使用说明书；特异条带的分子克隆采用分子克隆ii的方法

4引物的设计与合成

根据orf393在洋葱不育系和保持系dna序列上的差异，应用primerpremier5.0本发明人设计了一对分子标记引物，正向引物：gxx-f1：5'-cccgaaggagtgactttttctgattt-3'；反向引物：gxx-r1：5'-tctctggagcaccgactgaaggg-3'。由北京博尚生物技术有限公司合成，page纯化。

dna序列测定委托北京博尚生物技术有限公司完成。

5、pcr扩增及检测

pcr扩增在美国伯乐的tc-xp-d型基因扩增仪上进行，25μl体系，其中2×taqpcrmastermix12.5μl，primer1、2(0.5μmol/l)各1.0μl，dna1.0μl，ddh2o9.5μl，反应程序为94℃预变性5min，[94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec]，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；pcr产物于2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离分析，溴化乙啶染色，凝胶成像系统自动成像。

6、单株验证

通过田间观察判断各株系的育性，从而得到不育系和保持系10个组合，从每个组合的不育系和保持系中各随机抽取10株材料，提取基因组总dna，用正向引物gxx-f1：5'-cccgaaggagtgactttttctgattt-3'和反向引物：gxx-r1：5'-tctctggagcaccgactgaaggg-3'，对这些已知育性的200份材料进行pcr扩增验证，反应体系及程序同5。

(二)结果与分析

1、不育系及其相应的保持系基因组dna和rna的检测分析

参照北京天根生化科技有限公司生产的快捷型植物基因组提取试剂盒说明书提取洋葱基因组总dna，0.8％琼脂糖凝胶电泳结果(图1)显示，提取的dna在点样孔处无明显的残留，说明多糖和蛋白质含量都不高；dna带位于同一位置，带型清晰、无弥散、无降解现象。由图2可以看出，提取的总rna带型清晰，均存在28s和18s两条带，且无dna和蛋白残留。所以，提取到的dna和rna均能满足后续实验的需要。

2、pcr扩增结果

在已公开的洋葱cms-s线粒体全基因组序列(genbankaccession:ku318712)中，发现了58个新的orfs，本发明人以洋葱不育系s118和保持系n218的cdna为模版，对58个orfs进行差异表达分析，获得了一个表达差异片段orf393(图3)。利用orf393的全长引物对洋葱s型细胞质雄性不育系s118和保持系n218的基因组dna进行pcr扩增，结果在不育系和保持系中的扩增片段大小有微小的差异。本发明人对差异片段经过回收测序和dna序列比对分析，orf393在洋葱不育系中的扩增片段大小为1179bp，其核苷酸序列如seqidno.3所示；而orf393在洋葱保持系中的扩增片段大小为1143bp，其核苷酸序列如seqidno.4所示，与不育系相比缺失了36个碱基。

根据orf393在洋葱不育系和保持系dna序列上的差异，应用primerpremier5.0本发明人设计了一对分子标记引物，正向引物：gxx-f1：5'-cccgaaggagtgactttttctgattt-3'；反向引物：gxx-r1：5'-tctctggagcaccgactgaaggg-3'。使用正向引物gxx-f1和反向引物gxx-r1，对洋葱细胞质雄性不育系s118及其相应的保持系n218的总dna进行pcr扩增，结果见图4，图中可以清楚的看到，不育系s118均扩增出了一条232bp的特异性条带，相应的保持系n218扩增出了一条196bp的特异性条带。

3、个体验证

为了验证该双显性标记在洋葱分子标记辅助育种应用中的可行性，利用具有不同遗传背景的已知细胞质基因型的10个组合材料进行pcr验证(表1)，2％的琼脂糖凝胶电泳结果显示，所有的不育系中均扩增出232bp的条带，而相应的保持系中扩增出196bp的的片段，pcr扩增结果与田间判断结果完全吻合。在不育系单株中有232bp的特异条带，而保持系单株中扩增出196bp的特异条带，说明应用这对引物完全可以应用于洋葱的细胞质基因型的鉴别，据此可得知orf393与洋葱细胞质雄性不育有联系。

表1双显性标记在洋葱雄性不育系和保持系中的单株验证结果

注：s：雄性不育系；n：保持系；+：有扩增片段，-：没有扩增片段。

sequencelisting

<110>山东省农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>一种准确鉴定洋葱s/n细胞质基因型的双显性标记及其应用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>洋葱细胞质双显性标记的s型细胞质特异dna片段

<400>1

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<213>洋葱细胞质双显性标记的n型细胞质特异dna片段

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<213>orf393在s型细胞质中的扩增片段

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<213>orf393在n型细胞质中的扩增片段

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<210>5

<211>26

<212>dna

<213>正向引物：gxx-f1

<400>5

cccgaaggagtgactttttctgattt26

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>反向引物：gxx-r1

<400>6

tctctggagcaccgactgaaggg23