一种β‑葡萄糖醛酸苷酶的含吲哚基的荧光探针及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖醛酸苷酶的含吲哚基的荧光探针及其应用。

背景技术：

β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)是一种糖基水解酶，能将β-葡萄糖醛酸苷类化合物水解为相应的苷元和β-葡萄糖醛酸。β-葡萄糖醛酸苷酶广泛存在于动物、植物以及微生物中，最初在动物组织中首次发现了β-葡萄糖醛酸苷酶，随后，从动物（人、猴、狗、鼠等）、植物（水稻、玉米、烟草、黄芪等）及微生物（乳酸菌、葡萄球菌、瘤胃球菌等细菌，酵母菌、青霉素和曲霉素菌等真菌）中发现该酶的分布。在动物和人体内中，由机体自身组织细胞产生、合成并分泌的β-葡萄糖醛酸苷酶，广泛分布于各种组织和体液中，如巨噬细胞、血细胞、肝、脾、肾、肠、肺、肌肉、胆汁、肠液、尿以及血清等。β-葡萄糖醛酸苷酶主要负责溶酶体中粘多糖的降解，以及皮肤素、硫酸角质素的降解。此外，β-葡萄糖醛酸苷酶还参与戊糖、葡萄糖醛酸酯、卟啉、淀粉以及蔗糖等多种内源性物质的代谢过程。除了内源性β-葡萄糖醛酸苷酶，肠道微生物也能合成分泌β-葡萄糖醛酸苷酶。肠道β-葡萄糖醛酸苷酶参与介导维生素d、甲状腺激素、胆红素以及雌性激素等物质的肝肠循环，促进体内潜在毒物、激素以及许多药物的解离，并与多种重要的中间体代谢路径相关，如参与抗坏血酸的生物合成。β-葡萄糖醛酸苷酶的催化功能，使其参与机体的生理、病理及药物代谢等过程种，从而在维持机体正常的生理活动中发挥重要作用。

β-葡萄糖醛酸苷酶在疾病的发生和发展过程中也扮演重要的角色。β-葡萄糖醛酸苷酶介导的水解反应，是维持机体代谢稳态的重要反应，缺乏此酶会表现出mucopolysaccharidosistypevii(mps-vii)或slysyndrome等症状；此外，它还能够水解基底膜中的主要成分——蛋白多糖，直接参与细胞外基质的降解过程，从而在胃癌、乳腺癌等肿瘤的侵袭和转移以及炎症的发展过程中发挥重要作用。因此，定量测定不同个体、器官组织以及其他各种生物样品中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，对内外源性物质的代谢平衡、肿瘤的预测诊断具有重要价值。

β-葡萄糖醛酸苷酶的活性常用底物的消耗或产物的生成评价，而显色/荧光底物/产物因其检测方便、灵敏度高而广泛应用于酶活性的评价中。目前，已报道的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光底物有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸脂、羟基喹啉-β-葡糖苷酸苷、对硝基苯酚基-β-葡萄糖酸苷、4-甲基伞形酮-β-葡糖苷酸等，分别利用吲哚、羟基喹啉、对硝基酚、4-甲基伞形酮等有色产物作为酶活检测指标。然而，这些底物普遍存在两个问题。首先是选择性不高，水解反应不仅被β-葡萄糖醛酸苷酶水解，还可被其他酶例如酯酶等水解；其次，采用显色反应或香豆素类荧光存在较大的基底干扰，例如生物样品等复杂体系本身带有颜色或存在波长相近的荧光。因此，开发具有高灵敏度、抗环境干扰能力强的适用于体内和体外检测β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性荧光探针底物，并建立高灵敏度的科学检测方法，在临床诊断、药物开发与合理使用方面，具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明提供一种β-葡萄糖醛酸苷酶的含吲哚基的荧光探针及其应用，该特异性荧光探针底物可被β-葡萄糖醛酸苷酶选择性的水解，生成荧光属性明显改变的水解产物，可被荧光检测器检测。利用该探针反应可对多种生物体系中β-葡萄糖醛酸苷酶的分布和功能进行定量评价，并可用于β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的筛选。

本发明公开的β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性荧光探针底物，为(e)-2-(2-(6-o-β-d-葡萄糖醛酸-2,3-二氢-1h-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚基-1-碘化物（简写为hc-glu）。

hc-glu

本发明还公开了上述化合物作为β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性荧光探针底物的应用：采用上述hc-glu作为β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性底物，进行水解反应，通过检测单位时间内水解产物的生成量来定量测定不同生物体系（包括重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞、微生物及植物等生物体系）中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性；具体反应条件如下：

——体系中以hc-glu作为特异性探针底物；底物浓度选择10μm。

——在磷酸盐缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系ph介于5.5~10.5之间，优选ph6.0为最优反应ph值；

——反应时间为0~60分钟，确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20%时终止反应；

——测定单位时间内底物减少量或水解产物生成量作为β-葡萄糖醛酸苷酶活性的评价指标。

本发明提供的β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性荧光探针底物的应用，该探针底物及其水解产物具有不同的光学属性，可采用荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测；水解产物荧光检测条件分别为：激发波长670nm，最大发射波长为718nm。

该特异性探针底物为较长发射波长荧光探针，其在β-葡萄糖醛酸苷酶活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组β-葡萄糖醛酸苷酶、人及动物组织制备液及各类组织细胞中β-葡萄糖醛酸苷酶活性的定量测定；同时也可作为载体及动物整体β-葡萄糖醛酸苷酶的探针底物，评估β-葡萄糖醛酸苷酶的个体及种属差异。该探针底物及水解代谢产物的荧光检测方法还可用于β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。

作为高特异性的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针底物，该化合物可以用来检测β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系产生的β-葡萄糖醛酸苷酶活性测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、s-9等生物样品中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性标定。

选用本发明所述β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性探针底物检测β-葡萄糖醛酸苷酶体外活性具有以下突出优势：

(1)高特异性：hc-glu可被β-葡萄糖醛酸苷酶高特异性代谢成水解产物。

(2)廉价易得：hc-glu可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。

(3)高灵敏度：hc-glu具有较长的荧光发射波长，可以较好的减弱生物背景荧光的干扰。

附图说明

图1hc-glu及其酶解产物的发射光谱。

图2不同水解酶对hc-glu的筛选实验结果。

图3β-葡萄糖醛酸苷酶水解hc-glu的抑制实验结果。

图4不同来源β-葡萄糖醛酸苷酶催化hc-glu的动力学实验结果。

图5不同个体粪便中β-葡萄糖醛酸苷酶催化hc-glu的反应速率实验结果。

具体实施方式

实施例1.体外测定不同水解酶的选择性

（1）预先准备99µl体外代谢反应体系，包括ph6.0的磷酸盐缓冲液（50mm）、不同种类水解酶(0.1mg/ml)，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

（2）向反应体系中加入1µl浓度为1mm（终浓度10μm）的hc-glu起始反应；

（3）60分钟后，加入50µl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

（4）用高速冷冻离心机在4℃、20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（hc-glu：ex=670nm，em=718nm）。结果显示，只有β-葡萄糖醛酸苷酶（glu）催化反应，反应速率远远高于其它水解酶，说明β-葡萄糖醛酸苷酶催化hc-glu的反应有很好的选择性，本发明可应用于β-葡萄糖醛酸苷酶的活性测定（图2）。

实施例2.体外β-葡萄糖醛酸苷酶的抑制实验

（1）预先准备99µl体外代谢反应体系，包括ph6.0的磷酸盐缓冲液（50mm）、β-葡萄糖醛酸苷酶(0.1mg/ml)，以及不同浓度的抑制剂（终浓度分别为50,200,600μm）于37℃条件下震荡预孵3分钟；

（2）向反应体系中加入1µl浓度为1mm（终浓度10μm）的hc-glu起始反应；

（3）60分钟后，加入50µl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

（4）用高速冷冻离心机在4℃、20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（hc-glu：ex=670nm，em=718nm）。结果显示，只有黄芩苷呈剂量依赖的抑制β-葡萄糖醛酸苷酶（glu）的催化反应，而bnpp和lap（羧酸酯酶）以及α-galactose（半乳糖）均不抑制β-葡萄糖醛酸苷酶（glu）的催化活性，说明β-葡萄糖醛酸苷酶催化hc-glu的反应有很好的选择性，本发明可应用于β-葡萄糖醛酸苷酶的抑制剂筛选（图3）。

实施例3不同来源β-葡萄糖醛酸苷酶的活性测定

（1）预先准备99µl体外代谢反应体系，包括ph6.0的磷酸盐缓冲液（50mm）、不同来源β-葡萄糖醛酸苷酶(0.1mg/ml)，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

（2）向反应体系中加入1µl浓度为1mm（终浓度10μm）的hc-glu起始反应；

（3）60分钟后，加入50µl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

（4）用高速冷冻离心机在4℃、20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（hc-glu：ex=670nm，em=718nm）。结果显示，不同来源β-葡萄糖醛酸苷酶，包括重组表达单酶以及e.coli、e.coliix和e.colivii-a等亚型大肠杆菌来源β-葡萄糖醛酸苷酶均可催化hc-glu反应，但是各种来源的β-葡萄糖醛酸苷酶具有显著不同的酶活和催化反应特点，说明hc-glu作为β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性探针底物，可以灵敏的反映不同来源的β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，本发明可应用于不同来源的β-葡萄糖醛酸苷酶的活性评价（图4）。

实施例4不同个体粪便中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性测定

（1）收集粪便样品，称取200mg，加入3倍体积生理盐水，涡旋，离心（500g，5min），上清冻融裂解，离心（10000g，20min）取上清，得到粪便酶样品。

（2）准备99µl体外代谢反应体系，包括ph7.4的磷酸盐缓冲液（50mm）、不同个体来源粪便酶(0.1mg/ml)，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

（3）向反应体系中加入1µl浓度为1mm（终浓度10μm）的hc-glu起始反应；

（4）60分钟后，加入50µl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

（5）用高速冷冻离心机在4℃、20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（hc-glu：ex=670nm，em=718nm）。结果显示，不同个体的粪便中均可催化hc-glu反应，但是不同个体的β-葡萄糖醛酸苷酶具有显著不同的反应速率，说明hc-glu作为β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性探针底物，可以灵敏的反应不同个体粪便中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，本发明可应用于个体间粪便中β-葡萄糖醛酸苷酶活的评价（见图5）。