专利名称：葛根素-7-o-葡萄糖醛酸苷及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷及其制备方法和用途。属于生物及化 学药物技术领域。
背景技术：
葛根素(8-i3_D-葡萄糖吡喃糖_7，4' - 二羟基异黄酮)是从野葛Pueraria lobata(ffilld.)0hwi的干燥根中提取分离得到的主要活性成分，葛根素在治疗动脉硬化、 高血压、糖尿病以及代谢综合征中具有显著的药理作用，如抗血小板聚集、扩张血管、改善 微循环、降低胆固醇、改善内皮功能、降低心率、降血压以及β受体阻滞和血管转换酶抑制 样作用。临床上葛根素广泛地应用于心脑血管疾病的治疗，但是葛根素存在溶解性极差，口 服生物利用度很低的问题。研究表明，黄酮类化合物给药后，在体内主要以II相结合产物的形式存在，如葡 萄糖醛酸结合产物、硫酸酯结合产物等。化合物在体内形成的结合产物与原型化合物比较， 其水溶性增加，有利于其排泄。越来越多的研究表明，黄酮类化合物的部分结合产物其实还 保留一定的活性，如槲皮素的代谢产物槲皮素-4' -0-葡萄糖醛酸苷、槲皮素-7-0-葡萄糖 醛酸苷具有抗氧化活性，橙皮素的代谢产物橙皮素-5-0-葡萄糖醛酸苷和橙皮素-7-0-葡 萄糖醛酸苷对细胞具有保护作用，黄芩素的代谢产物黄芩素-7-0-葡萄糖醛酸苷可抑制 DU145细胞增殖。因此，这些化合物的结合代谢产物不仅是排泄形式之一，在体内也同样可 发挥药理作用。经过研究后发现，葛根素在大鼠体内的主要代谢产物是葛根素-7-0-葡萄 糖醛酸苷。
发明内容
本发明的第一个目的是为了提供一种葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷。解决了葛根素溶解性极差，口服生物利用度很低的问题，并具有自由基清除活性 的。本发明的第二个目的是为了提供一种葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的制备方法。本发明的第三个目的是为了提供一种葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的用途。本发明的第一个目的可以通过以下技术方案达到葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷，其特征在于其分子式为C27H28O15,分子量为592. 14，
其化学结构式如下 本发明的第二个目的可以通过以下技术方案达到2、葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)收集大鼠尿液将大鼠尾静脉注射葛根素后，置于代谢笼中，收集给药后24h的尿液，将该尿液 在-15°C _25°C温度下保存；2)水浴旋蒸浓缩将1)步保存的尿液解冻后，加入2倍体积的甲醇，涡旋混勻，13000rpm离心 lOmin，取初步上清液在55 60°C温度下水浴旋蒸后浓缩，在取得的浓缩液中加入甲醇，然 后经13000rpm离心lOmin，取上清液备用；3)分离纯化将2)步制得的上清液选择不同的流动相进行三次分离纯化，第一次分离纯化流动相为甲醇乙腈冰醋酸水=20 5 0. 5 74. 5，流 速为2mL/min，收集16 20min流出液；收集的流出液在55 60°C温度下水浴旋蒸；第二次分离纯化将第一次分离纯化得到的物质用甲醇复溶(用甲醇再次制成液 体)后进行第二次分离纯化，流动相为甲醇冰醋酸水=20 0.5 79.5，流速为2!1117 min,收集25 30min流出液；收集的液体在55 60°C温度下水浴旋蒸；第三次分离纯化将第二次分离纯化得到的液体用甲醇复溶(用甲醇再次制成液 体)后进行第三次分离纯化，流动相为乙腈冰醋酸水=20 0.5 79.5，流速为2!1117 min,收集18 20min流出液；收集的液体在55 60°C温度下水浴旋蒸，得到分离纯化物；4)制成葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷将第3)制得的分离纯化物在25 35°C温度下经真空干燥，得到的白色粉末即为 葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷。本发明的第二个目的还可以通过以下技术方案达到本发明的一种实施方案是3)步中所述的分离纯化采用半制备色谱进行。本发明的一种实施方案是使用液质联用仪监测制备时葛根素-7-0-葡萄糖醛酸 苷的出峰时间，确定收集时间。本发明的第三个目的可以通过以下技术方案达到葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的用途，其特征在于1)用于清除2，2-联苯基-1-苦基胼基自由基的活性；2)用于羟自由基羟自由基的活性。本发明具有如下突出的有益效果
1、本发明具有较好的抗氧化作用，并解决了葛根素溶解性极差，口服生物利用度 很低的问题，可为心脑血管疾病的防治提供一种新的药物。2、本发明制备方法简单，容易实行，无需复杂的工艺流程，成本低廉，纯度高，可作 为葛根素代谢研究标准品，并具有自由基清除活性。
图1为葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的一级质谱图；图2为葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的二级质谱图；图3为葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的三级质谱图；图4为葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的四级质谱图。具体施方式具体实施例1 本实施例涉及的葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷，其分子式为C27H28O15,分子量为 592. 14，其化学结构式如下 本实施例的制备方法包括如下步骤1)、收集大鼠尿液通过大鼠尾静脉注射葛根素(250mg/kg)后，置于代谢笼中，收集给药后24h尿液， 在-20°C下保存。2)水浴旋蒸浓缩将1)步保存的尿液解冻后，加入2倍体积的甲醇，涡旋混勻，13000rpm离心 lOmin，取初步上清液在55 60°C温度下水浴旋蒸后浓缩，在取得的浓缩液中加入甲醇，然 后经13000rpm离心lOmin，取上清液备用；3)分离纯化将2)步制得的上清液选择不同的流动相进行三次分离纯化，第一次分离纯化流动相为甲醇乙腈冰醋酸水=20 5 0. 5 74. 5，流 速为2mL/min，收集16 20min流出液；收集的流出液在55 60°C温度下水浴旋蒸；第二次分离纯化将第一次分离纯化得到的物质用甲醇复溶(用甲醇再次制成液 体)后进行第二次分离纯化，流动相为甲醇冰醋酸水=20 0.5 79.5，流速为2!1117 min,收集25 30min流出液；收集的液体在55 60°C温度下水浴旋蒸；第三次分离纯化将第二次分离纯化得到的液体用甲醇复溶(用甲醇再次制成液 体)后进行第三次分离纯化，流动相为乙腈冰醋酸水=20 0.5 79.5，流速为2!1117min,收集18 20min流出液；收集的液体在55 60°C温度下水浴旋蒸，得到分离纯化物；4)制成葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷将第3)制得的分离纯化物在25 35°C温度下经真空干燥，得到的白色粉末即为 葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷。在进行第3)步的分离纯化时，将备用的上清液采用半制备色谱进行分离纯化。 色谱仪为Agilent 1200半制备色谱仪(含手动进样器、单元泵、VWD检测器)，色谱柱为 VenusilXBP C18 柱(10 X 250mm，5 μ m) (Agela Technologies, USA),保护柱为 Alltima C18 柱(4. 6X7. 5mm, 5 μ m) (Alltech, USA)，进样量为 2mL，检测波长为 250nm。选择不 同的流动相进行三次分离纯化，第一次分离纯化流动相为甲醇乙腈冰醋酸水= 20 5 0. 5 74. 5，流速为2mL/min，收集16 20min流出液；收集的液体经55°C水浴 旋蒸，甲醇复溶后进行第二次分离纯化流动相为甲醇冰醋酸水=20 0.5 79.5， 流速为2mL/min，收集25 30min流出液；收集的液体经55°C水浴旋蒸，甲醇复溶后进行 第三次分离纯化流动相为乙腈冰醋酸水=20 0.5 79. 5，流速为2mL/min，收集 18 20min流出液；收集的液体经55°C水浴旋蒸，30°C真空干燥后得到的白色粉末即为葛 根素-7-0-葡萄糖醛酸苷，使用液质联用仪监测制备时葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的出峰 时间，确定收集时间。葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的多级质谱图参照图1、图2、图3和图4， 其氢谱和碳谱数据见表1。
表1葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的1H-NMR与13C-NMR数据(溶于DMS0_d6) 本发明的用途是利用葛根素+Ο-葡萄糖醛酸苷的自由基清除活性能力，具体包
1、2，2_ 联苯基-1-苦基胼基(2. 2-diphenyl-l-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清 在130mM DPPH的乙醇溶液中加入800 μ L的IOOmM Tris-HCl缓冲液(ρΗ 7. 4)，再
6加入200 μ L不同浓度的葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷(每个浓度3个样品)，混勻，室温下避 光静置30min后，用紫外分光光度计(Agilent G1103A紫外分光光度计)检测，检测波长为 529nm。DPPH自由基清除率用以下公式进行计算清除率(％ ) = (1-A样品/A对照)XlOO其中A#s表示样品的紫外吸光度，A5i 表示空白溶液的紫外吸光度。2、羟自由基清除能力反应体系如下IOOmM磷酸盐缓冲液400 μ L，ImM乙二胺四乙酸100 μ L，ImM氯化 铁100 μ L，ImM抗坏血酸100 μ L，IOmM过氧化氢100 μ L，100 μ L不同浓度的葛根素-7_0_葡 萄糖醛酸苷溶液(每个浓度3个样品)，混勻，38°C孵育1小时后，加入的硫代巴比妥酸 (50mM的氢氧化钠溶解)和10%的三氯乙酸各lmL，混勻，100°C孵育IOmin后，迅速置于冰 上终止反应，并使用紫外分光光度计(Agilent G1103A紫外分光光度计)检测，检测波长为 532nm。羟自由基清除率用以下公式进行计算清除率(％ ) = (1-A样品/A对照)XlOO其中A#s表示样品的紫外吸光度，A5i 表示空白溶液的紫外吸光度。二、结果从表2可以看出，葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷对DPPH自由基和羟自由基均有不同 程度的清除能力。
浓度 DPra自由基清除能力(％) 羟自由基清除能力(％) 表2葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的自由基清除能力(η = 3)
权利要求
葛根素-7-O-葡萄糖醛酸苷，其特征在于分子式为C27H28O15，分子量为592.14，其化学结构式如下FSA00000201978300011.tif
2 将大鼠尾静脉注射葛根素后，置于代谢笼中，收集给药后24h的尿液，将该尿液 在-15°C _25°C温度下保存；2)水浴旋蒸浓缩将1)步保存的尿液解冻后，加入2倍体积的甲醇，涡旋混勻，13000rpm离心lOmin， 取初步上清液在55 60°C温度下水浴旋蒸后浓缩，在取得的浓缩液中加入甲醇，然后经 13000rpm离心lOmin，取上清液备用；3)分离纯化将2)步制得的上清液选择不同的流动相进行三次分离纯化，第一次分离纯化流动相为甲醇乙腈冰醋酸水=20 5 0. 5 74. 5，流速为 2mL/min,收集16 20min流出液；收集的流出液在55 60°C温度下水浴旋蒸；第二次分离纯化将第一次分离纯化得到的物质用甲醇复溶(用甲醇再次制成液体) 后进行第二次分离纯化，流动相为甲醇冰醋酸水=20 0.5 79. 5，流速为2mL/min， 收集25 30min流出液；收集的液体在55 60°C温度下水浴旋蒸；第三次分离纯化将第二次分离纯化得到的液体用甲醇复溶(用甲醇再次制成液体) 后进行第三次分离纯化，流动相为乙腈冰醋酸水=20 0.5 79. 5，流速为2mL/min， 收集18 20min流出液；收集的液体在55 60°C温度下水浴旋蒸，得到分离纯化物；4)制成葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷将第3)制得的分离纯化物在25 35°C温度下经真空干燥，得到的白色粉末即为葛根 素-7-0-葡萄糖醛酸苷。
3.根据权利要求2所述的葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于第3) 步中所述的分离纯化采用半制备色谱进行。
4.根据权利要求2所述的葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的制备方法，其特征在于使用 液质联用仪监测制备时葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的出峰时间，确定收集时间。
5.葛根素-7-0-葡萄糖醛酸苷的用途，其特征在于1)用于清除2，2-联苯基-1-苦基胼基自由基的活性；2)用于羟自由基羟自由基的活性。
全文摘要
本发明涉及一种葛根素-7-O-葡萄糖醛酸苷及其制备方法和用途，所述葛根素-7-O-葡萄糖醛酸苷的分子式为C27H28O15，分子量为592.14；其制备方法的特征是通过收集大鼠尿液、水浴旋蒸浓缩、分离纯化制备而成。其用途特征在于1)用于清除2，2-联苯基-1-苦基肼基自由基的活性；2)用于羟自由基羟自由基的活性。本发明具有较好的抗氧化作用，并解决了葛根素溶解性极差，口服生物利用度很低的问题，可为心脑血管疾病的防治提供一种新的药物，制备方法简单，容易实行，无需复杂的工艺流程，成本低廉，纯度高，可作为葛根素代谢研究标准品，并具有自由基清除活性。
文档编号A61P39/06GK101885748SQ20101023457
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者罗承锋, 袁牧, 陈敏生 申请人:广州医学院第二附属医院