本发明涉及小球藻的分离领域，尤其是涉及一种高产多糖小球藻种的分离方法。
技术背景
小球藻（chlorella）为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径3-8微米，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。小球藻常单生，也有多细胞聚集。细胞球形、椭圆形，内有一个周生、杯状或片状的色素体。无性繁殖，每个细胞可以产生2、4、8或16个似亲孢子，成熟时母细胞破裂，孢子逸出，长大后即为新个体。世界各地均有分布，多生活于较小浅水，也有海产种类。天然条件下个体较少，人工培养大量繁殖。细胞内的蛋白质、脂肪和碳水化合物含量都很高，又有多种维生素，可食用和作为饵料。
小球藻多糖具有增强免疫活性的功能。小球藻这一营养成分的特殊功能使其在医疗保健领域得到应用。将小球藻经热水抽提、脱蛋白、乙醇沉淀得粗糖蛋白，粗糖蛋白经sephadex-75层析得到糖蛋白纯品。经过和单糖组分对比，小球藻糖蛋白中主要含葡萄糖、半乳糖、鼠李糖，它们的比例为7.3:1.97:1。另外还含有少量的阿拉伯糖、木糖和甘露糖。但在不同提取液中提取所含单糖的组分会不同。
关于高产多糖小球藻种的分离技术有很多方法，现有技术如申请公布号为
cn105713837a的中国发明专利，公开了一种高产多糖小球藻种的分离方法，该发明方法是在basal培养液中加入甘油、鼠李糖和维生素c配制成高产多糖小球藻种的培养液hpsc-m；从野生铁皮石斛茎上分离附生藻，并经高温干燥环境下进行压力筛选，获得高产多糖的小球藻，具有应用性强的优点，但是该发明的分离方法太过于繁琐，成本较高，太耗工时。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高产多糖小球藻种的分离方法，分离方法简单易行，成本较低，适合规模化生产。
本发明针对
背景技术：
中提到的问题，采取的技术方案为：一种高产多糖小球藻种的分离方法，包括：培养、初筛、多糖提取、复筛，具体包括以下步骤：
培养：取海水样品按1:4-5加入到培养液中，弱光下培养4-5周；5000-6000r/min离心10-20分钟收集藻细胞，使用含80-90μg/ml氨苄青霉素的生理盐水洗涤，离心去上清，重复洗涤8-10次，以无菌生理盐水洗去残余抗生素，将1-2×10-5的稀释藻液涂布于固体培养基，倒置光照培养5-7天；以氨苄青霉素筛选出小球藻，然后经扩大培养为进一步是筛选出高产多糖的小球做准备；
初筛：挑选颜色、形态、大小有差异的单藻落划线分离培养，将获得的单藻转接于培养基中扩大培养，23-26℃、2000-2500lux下培养，每天摇动3-5次，每次3-5分钟，选取藻细胞不贴壁、生长较快、生物量积累较高的藻株，用于进一步筛选高产多糖的藻种；在一定培养液及摇动条件下进行培养，初步筛选出优质藻种；
多糖提取：称取小球藻干粉末，按照料液比1:20-25混合于1.5-2.0%的氢氧化钠溶液中，80-82℃浸提3-5小时，5000-6000r/min离心10分钟，取上清加入3-5倍体积的95-99%乙醇溶液，2-4℃静置过夜后离心取沉淀；多糖提取过程简单易行，易于操作，没有加入有机试剂，有利于提高多肽提取的精确程度；
复筛：选取光照：黑暗为20-21:4-3、光照强度4000-6000lux、25-26℃、起始ph为7.0作为培养条件，在培养液中添加葡萄糖1.08-1.12g/l、尿素0.20-0.22g/l、mgso4·7h2o0.125-0.128g/l、（r）-泛内脂0.007-0.009g/l作为复筛培养基，选取初筛后多糖含量多的小球藻进行复筛培养，连续3-4次即可分离出高产多糖的小球藻；微量的（r）-泛内脂能够刺激小球藻体内促进胞内多糖分泌的酶，提高相关酶的活性，从而提高小球藻胞内多糖的产量与产率，筛选分离高产多糖小球藻的方法简单易行，可以用于规模化培养，经过筛选与分离，可以分离出超出原始多糖产量35-40%的小球藻种，分离效率较高，安全易行，是一种高效、安全的高产多糖小球藻种的分离方法。
作为优选，培养液为：nh4cl0.375-0.385g/l，mgso4·7h2o0.1-0.2g/l，cacl2·2h2o0.05-0.06g/l，k2hpo40.108-0.110g/l，kh2po40.054-0.055g/l，tris2.42-2.5g/l，冰醋酸1.0-1.2ml/l，微量元素1.0-1.2ml/l，以灭菌海水定容至1l，ph6.0-7.0，培养液中加入20-22g/l琼脂为固体培养基；培养液能够为小球藻提供充足的氮源、碳源，可以使小球藻迅速的恢复至生机巅峰的状态。
作为优选，微量元素为：乙二胺四乙酸二钠盐45-5og/l，znso4·7h2o20-22g/l，h3b0311.4-11.5g/l，mncl2·4h205.06-5.10g/l，cocl2·6h201.61-1.65g/l，cuso4·5h201.57-1.60g/l，(nh4)6mo7o24·4h2o1.10-1.20g/l，feso4·7h204.19-4.20g/l；微量元素为小球藻提供充足的锌、硼、锰、钴、铜钼等微量元素，满足小球藻生长繁殖所需。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）微量的（r）-泛内脂能够刺激小球藻体内促进胞内多糖分泌的酶，提高相关酶的活性，从而提高小球藻胞内多糖的产量与产率；2）多糖提取过程简单易行，易于操作，没有加入有机试剂，有利于提高多糖提取的精确程度；3）筛选分离高产多糖小球藻的方法简单易行，可以用于规模化培养，经过筛选与分离，可以分离出超出原始多糖产量35-40%的小球藻种，分离效率较高，安全易行，是一种高效、安全的高产多糖小球藻种的分离方法。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种高产多糖小球藻种的分离方法，包括以下步骤：
1）取海水样品按1:4加入到培养液中，弱光下培养4周；5000r/min离心10分钟收集藻细胞，使用含80μg/ml氨苄青霉素的生理盐水洗涤，离心去上清，重复洗涤8次，以无菌生理盐水洗去残余抗生素，将1×10-5的稀释藻液涂布于固体培养基，倒置光照培养5天；2）挑选颜色、形态、大小有差异的单藻落划线分离培养，将获得的单藻转接于培养基中扩大培养，23℃、2000lux下培养，每天摇动3次，每次3分钟，选取藻细胞不贴壁、生长较快、生物量积累较高的藻株，用于进一步筛选高产多糖的藻种；在一定培养液及摇动条件下进行培养，初步筛选出优质藻种；3）称取小球藻干粉末，按照料液比1:20混合于1.5%的氢氧化钠溶液中，80℃浸提3小时，5000r/min离心10分钟，取上清加入3倍体积的95%乙醇溶液，2℃静置过夜后离心取沉淀；4）选取光照：黑暗为20:4、光照强度4000lux、25℃、起始ph为7.0作为培养条件，在培养液中添加葡萄糖1.08g/l、尿素0.20g/l、mgso4·7h2o0.125g/l、（r）-泛内脂0.007g/l作为复筛培养基，选取初筛后多糖含量多的小球藻进行复筛培养，连续3-4次即可分离出高产多糖的小球藻。
实施例2：
一种高产多糖小球藻种的分离方法，包括以下步骤：
1）培养：取海水样品按1:5加入到培养液中，弱光下培养5周；6000r/min离心20分钟收集藻细胞，使用含90μg/ml氨苄青霉素的生理盐水洗涤，离心去上清，重复洗涤10次，以无菌生理盐水洗去残余抗生素，将2×10-5的稀释藻液涂布于固体培养基，倒置光照培养7天；以氨苄青霉素筛选出小球藻，然后经扩大培养为进一步是筛选出高产多糖的小球做准备；
2）初筛：挑选颜色、形态、大小有差异的单藻落划线分离培养，将获得的单藻转接于培养基中扩大培养，26℃、2500lux下培养，每天摇动5次，每次5分钟，选取藻细胞不贴壁、生长较快、生物量积累较高的藻株，用于进一步筛选高产多糖的藻种；在一定培养液及摇动条件下进行培养，初步筛选出优质藻种；
3）多糖提取：称取小球藻干粉末，按照料液比1:25混合于2.0%的氢氧化钠溶液中，82℃浸提5小时，6000r/min离心10分钟，取上清加入5倍体积的99%乙醇溶液，4℃静置过夜后离心取沉淀；多糖提取过程简单易行，易于操作，没有加入有机试剂，有利于提高多肽提取的精确程度；
4）复筛：选取光照：黑暗为21:3、光照强度6000lux、26℃、起始ph为7.0作为培养条件，在培养液中添加葡萄糖1.12g/l、尿素0.22g/l、mgso4·7h2o0.128g/l、（r）-泛内脂0.009g/l作为复筛培养基，选取初筛后多糖含量多的小球藻进行复筛培养，连续4次即可分离出高产多糖的小球藻；微量的（r）-泛内脂能够刺激小球藻体内促进胞内多糖分泌的酶，提高相关酶的活性，从而提高小球藻胞内多糖的产量与产率，筛选分离高产多糖小球藻的方法简单易行，可以用于规模化培养，经过筛选与分离，可以分离出超出原始多糖产量35-40%的小球藻种，分离效率较高，安全易行，是一种高效、安全的高产多糖小球藻种的分离方法。
培养液为：nh4cl0.385g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，cacl2·2h2o0.06g/l，k2hpo40.110g/l，kh2po40.055g/l，tris2.5g/l，冰醋酸1.2ml/l，微量元素1.2ml/l，以灭菌海水定容至1l，ph7.0，培养液中加入22g/l琼脂为固体培养基；培养液能够为小球藻提供充足的氮源、碳源，可以使小球藻迅速的恢复至生机巅峰的状态。
微量元素为：乙二胺四乙酸二钠盐5og/l，znso4·7h2o22g/l，h3b0311.5g/l，mncl2·4h205.10g/l，cocl2·6h201.65g/l，cuso4·5h201.60g/l，(nh4)6mo7o24·4h2o1.20g/l，feso4·7h204.20g/l；微量元素为小球藻提供充足的锌、硼、锰、钴、铜钼等微量元素，满足小球藻生长繁殖所需。
实施例3：
一种高产多糖小球藻种的分离方法，包括：培养、初筛、多糖提取、复筛，具体包括以下步骤：
培养：取海水样品按1:5加入到培养液中，弱光下培养4-5周；5500r/min离心15分钟收集藻细胞，使用含80μg/ml氨苄青霉素的生理盐水洗涤，离心去上清，重复洗涤8次，以无菌生理盐水洗去残余抗生素，将2×10-5的稀释藻液涂布于固体培养基，倒置光照培养6天；以氨苄青霉素筛选出小球藻，然后经扩大培养为进一步是筛选出高产多糖的小球做准备；
初筛：挑选颜色、形态、大小有差异的单藻落划线分离培养，将获得的单藻转接于培养基中扩大培养，25℃、2400lux下培养，每天摇动4次，每次3分钟，选取藻细胞不贴壁、生长较快、生物量积累较高的藻株，用于进一步筛选高产多糖的藻种；在一定培养液及摇动条件下进行培养，初步筛选出优质藻种；
多糖提取：称取小球藻干粉末，按照料液比1:22混合于1.6%的氢氧化钠溶液中，80℃浸提4小时，5500r/min离心10分钟，取上清加入4倍体积的98%乙醇溶液，3℃静置过夜后离心取沉淀；多糖提取过程简单易行，易于操作，没有加入有机试剂，有利于提高多肽提取的精确程度；
复筛：选取光照：黑暗为20:4、光照强度5000lux、25℃、起始ph为7.0作为培养条件，在培养液中添加葡萄糖1.10g/l、尿素0.20g/l、mgso4·7h2o0.126g/l、（r）-泛内脂0.008g/l作为复筛培养基，选取初筛后多糖含量多的小球藻进行复筛培养，连续3-4次即可分离出高产多糖的小球藻；微量的（r）-泛内脂能够刺激小球藻体内促进胞内多糖分泌的酶，提高相关酶的活性，从而提高小球藻胞内多糖的产量与产率，筛选分离高产多糖小球藻的方法简单易行，可以用于规模化培养，经过筛选与分离，可以分离出超出原始多糖产量35-40%的小球藻种，分离效率较高，安全易行，是一种高效、安全的高产多糖小球藻种的分离方法。
培养液为：nh4cl0.38g/l，mgso4·7h2o0.15g/l，cacl2·2h2o0.05g/l，k2hpo40.11g/l，kh2po40.055g/l，tris2.45g/l，冰醋酸1.1ml/l，微量元素1.2ml/l，以灭菌海水定容至1l，ph6.5，培养液中加入21g/l琼脂为固体培养基；培养液能够为小球藻提供充足的氮源、碳源，可以使小球藻迅速的恢复至生机巅峰的状态。
微量元素为：乙二胺四乙酸二钠盐48g/l，znso4·7h2o20g/l，h3b0311.4g/l，mncl2·4h205.08g/l，cocl2·6h201.64g/l，cuso4·5h201.58g/l，(nh4)6mo7o24·4h2o1.15g/l，feso4·7h204.19-4.20g/l；微量元素为小球藻提供充足的锌、硼、锰、钴、铜钼等微量元素，满足小球藻生长繁殖所需。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。