本发明涉及生物技术以及医药领域，涉及一种体外细胞衰老模型的建立方法，特别针对小鼠骨髓造血干/祖细胞的体外衰老细胞模型的制备方法。
背景技术：
最新研究表明，造血干/祖细胞衰老与机体的衰老有着密切的联系，它可以引起机体造血功能和免疫功能的衰退、肿瘤发生率增加，并将导致全身组织器官结构与功能的衰退。因此，深入研究造血干细胞衰老的机理对预防和治疗老年性疾病有着重要理论意义与临床应用价值。
而造血干/祖细胞衰老模型的建立是研究造血干细胞衰老机理与延缓其衰老的重要途径。由于造血干细胞的数量仅占骨髓有核细胞的0.5％左右，因此体外分离高纯度的足量的hsc是国内外学者遇到的一个共同的技术难题。而造血干细胞体外衰老模型的建立就更加不易。
目前造血干细胞体外衰老模型主要有老年鼠造血干细胞模型(emmanuellepassegué,universityofcaliforniasanfrancisco,etal)，白消安体外诱导造血干细胞衰老模型(daohongzhou,medicaluniversityofsouthcarolina,etal)，辐射致造血干细胞衰老模型(daohongzhou,medicaluniversityofsouthcarolina,etal),t-bhp体外诱导造血干细胞衰老模型(wangyp,chongqingmedicaluniversity)。这些方法都不同程度地存在着实验周期耗时长，操作步骤繁琐，不易普及等局限。
因此需要对现有技术加以改进，用较为年轻的小鼠为来源，提供一种快速简便的方法获得小鼠骨髓造血组/干细胞(hsc)体外衰老细胞模型。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种体外细胞衰老模型的建立方法，特别针对小鼠骨髓造血干/祖细胞的体外衰老细胞模型的制备方法。
小鼠骨髓造血干/祖细胞体外衰老细胞模型的建立方法，步骤包括:分离获取小鼠的骨髓造血干/祖细胞；用加入il3、il6和scf的干细胞培养基培养5～14天。
所述的干细胞培养基中，il3的含量为8～20ng/ml，il6的含量为8～20ng/ml，scf的含量为25～60ng/ml。优选的，所述的干细胞培养基中，il3的含量为9～12ng/ml，il6的含量为9～12ng/ml，scf的含量为27～35ng/ml。
优选的，所述的培养时间为5～10天，更优选为8天。培养条件为3％～6％co2、36～37.5℃；优选为5％co2、37℃±0.2℃。
在培养过程中，每2～3天更换干细胞培养基。
优选的，所述的干细胞培养基为无血清培养基，例如stemspansfem。
所述的干细胞培养基中还含有链霉素和青霉素。
小鼠骨髓干/祖细胞通过以下方法获得：从小鼠骨髓中获取分离小鼠骨髓细胞，并经过lineage阴性富集和cd117阳性筛选；所述的lineage阴性富集为cd5、cd45r/b220、cd11b、anti-gr-1、7-4和ter-119阴性富集。
在本发明的一个优秀方案中，从小鼠骨髓中分离获取骨髓造血干/祖细胞，用含有10ng/mlil3、10ng/mlil6、30ng/mlscf以及100ui/ml青霉素、100ui/ml链霉素双抗的干细胞培养基(例如stemspansfem)，于5％co2培养箱37℃培养8天。并且培养期间每2～3天更换培养基。
通过上述方法所处理的小鼠骨髓造血干/祖细胞，结合衰老的特异性指标衰老相关β-半乳糖苷酶染色、结合细胞周期、细胞形态等指标，确定所获得的细胞已经老化，获得了衰老的造血干/祖细胞模型；这种模型的细胞发生了老化，但并没有发生凋亡。
通过本发明方法建立小鼠骨髓干/祖细胞体外衰老细胞模型，可以缩短造模时间，操作简单，易普及且致衰老效果明显。而且，所获得的衰老细胞模型不易凋亡，在模型建立后仍可存活较长时间，超过3天，可以用来筛选抗衰老的药物。
所述的培养基为造血干细胞的专用培养基，优选为造血干细胞专用无血清培养基，例如stemspansfem(stemcell#09600)培养基。
在其中添加il3、il6和scf及双抗，可以在短时间内获取大量衰老的造血干/祖细胞，以获得的小鼠骨髓造血干/祖细胞体外衰老细胞模型。
本发明以幼龄或成年小鼠为来源，对现有的干细胞培养基中进行简单的添加，培养较短时间，就可以获得小鼠骨髓造血干/祖细胞体外衰老细胞模型。不仅节约了时间和经济成本，能在短时间内获取大量衰老造血干/祖细胞；而且所获得的衰老细胞模型不易凋亡，在模型建立后仍可存活较长时间，可以用来筛选抗衰老的药物，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为小鼠骨髓造血干/祖细胞培养24小时的40倍显微镜图像
图2为新分离纯化的年轻组小鼠骨髓造血干/祖细胞(图2a)以及培养8天后的衰老组小鼠骨髓造血干/祖细胞(图2b)，用流式细胞仪检测cd117+细胞百分比
图3为新分离纯化的年轻组小鼠骨髓造血干/祖细胞(即第0天)(图3a)及培养8天后衰老组小鼠骨髓造血干/祖细胞(图3b)的β-半乳糖苷酶染色结果
图4为新分离纯化的年轻组小鼠骨髓造血干/祖细胞(即第0天hsc)的细胞周期分布图
图5为衰老组小鼠骨髓造血干/祖细胞(培养8天的hsc)的细胞周期分布图
具体实施方式
实施例1小鼠骨髓造血干/祖细胞的原代分离及体外培养
按照如下步骤进行小鼠骨髓造血干/祖细胞原代分离及体外培养：
1)小鼠(4周龄)脱臼处死，用75％的酒精消毒小鼠，无菌操作取出后肢股骨，置于buffer(含0.5％fbs，ph7.2,2mmedtapbs，也即之后的buffer)中，将肌肉去除干净；
2)用1ml注射器吸取buffer冲洗骨髓。用无刻度的软吸管吹打细胞；
3)30μm过滤网过滤，300g离心10min，弃上清；
4)沉淀中加入1mlpbs，加入红细胞裂解液3ml，充分混匀，室温放置5min。期间颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，弃上清；
5)洗细胞一次(加10mlpbs重悬沉淀，1500rpm离心5min，弃上清。之后的洗细胞都是1500rpm，5min)；
6)沉淀加入3ml的buffer重悬细胞，(如有絮状沉淀，过滤)稀释10倍，细胞计数，取合适的细胞进行分选。
7)将所得细胞用免疫磁珠分选法进行lineage阴性富集，包括cd5、cd45r(b220)、cd11b、anti-gr-1(ly-6g/c)、7-4,ter-119；再将所得细胞用免疫磁珠分选法进行cd117(c-kit)阳性筛选。具体步骤参考miltenyi的anti-c-kit(cd117)microbeadkit，lineagecelldepletionkit说明书；此磁珠分选方法可以选择其它方法其它试剂盒进行；
8)将所得细胞用stemspansfem(stemcell#09600)培养基+10ng/mlil3+10ng/mlil6+30ng/mlscf+100ui/ml青霉素、100ui/ml链霉素双抗，于5％co2培养箱37℃培养8天；
培养期间，每2-3天换液一次，换液时可将细胞用1ml枪头吹5-8次，然后1:3传代。所得细胞即为小鼠骨髓造血干/祖细胞体外衰老细胞模型。倒置显微镜下可见，如图1所示，原代培养第1天的小鼠造血干/祖细胞均匀悬浮于培养基中，细胞形态为圆形，符合造血干/祖细胞的基本形态特征。
经过了8天培养后所获得的小鼠骨髓造血干/祖细胞衰老模型，细胞衰老效果好，而且能够继续成活较长时间，一般至少3～5天。因此，这种体外衰老细胞模型能够用于筛选抗衰老药物。
实施例2流式细胞术检测lineage-c-kit+细胞比例
检测分选后细胞的纯度：
(1)收集新鲜的分选后lin-c-kit+细胞及实施例1培养了8天后的lin-c-kit+细胞各1×106个，1500rpm离心，5min；
(2)洗细胞一次，加入cd117-pe10ul，4度避光孵育15分钟；
(3)洗细胞一次，溶解细胞沉淀至200-500ulbuffer，重悬细胞。流式细胞仪(bectondickinsoaccuritmc6)检测。macs分选lin-cd117+后检测cd117+细胞百分比为(92.2％±4.5％，n＝10，图2a)。
将该细胞用stemspansfem(stemcell#09600)培养基+10ng/mlil3+10ng/mlil6+30ng/mlscf+100ui/ml青霉素、100ui/ml链霉素双抗，于5％co2培养箱37℃培养8天后再一次检测cd117+细胞百分比为(86％±3.9％，n＝10,图2b)，故可以认为分选的lin-c-kit+细胞即造血干/祖细胞具有较高的纯度，可以满足后续实验的要求。
实施例3衰老相关β-半乳糖苷酶染色
按照如下步骤操作：收集各组1×106个hsc，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。pbs洗涤，加入β-半乳糖苷酶染色工作液(碧云天c0602)混匀，37℃、无co2条件下孵育过夜(16h)，镜检，以随机计数的400个细胞中阳性细胞的个数计算阳性细胞率。sa-β-gal(衰老相关β-半乳糖苷酶)是衰老的标志性指标。sa-β-gal染色阳性细胞体积增大，胞质呈蓝色，阴性细胞未着色。我们的实验结果显示衰老组(图3b)hscsa-β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比明显高于年轻组(图3a)hsc，衰老组的被染色的细胞几乎满视野，年轻组细胞基本上未着色。
实施例4细胞周期
(1)收集各组1×106个hsc，预冷的pbs洗涤，预冷4％多聚甲醛固定1h。
(2)1000g左右离心5分钟，沉淀细胞。
(3)洗涤细胞一次，70％冰乙醇固定过夜。1000g左右离心5分钟，沉淀细胞。
(4)洗涤细胞一次，加入碘化丙啶染色液(碧云天c1052)，37℃避光温浴30min，流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测dna结合碘化丙啶荧光，适当软件分析各组细胞的周期分布。
结果显示，衰老hsc细胞周期进展阻滞于g0/g1期。图4和图5分别为新分离纯化的年轻组及培养8天的衰老组细胞周期分布结果。
图4为小鼠hsc(年轻组)的细胞周期分布图，其中g0/g1期细胞比例(即最大峰)为63.59％；s期细胞比例为19.98％；g2/m期细胞比例为16.56％。图5为小鼠hsc(衰老组)的细胞周期分布图，其中g0/g1期细胞比例(即左侧的最大峰)为80.17％；s期细胞比例为16.32％；g2/m期细胞比例(右侧的峰)为3.51％。图4、5均未见凝聚细胞或者碎片，表明两组细胞都没有发生凋亡。
结果显示，图5的衰老hsc中g0/g1期细胞的比例(80.17％，左侧的峰)高于图4的年轻hsc(63.59％)，s期比例减少(从19.98％减少至16.32％)，g2/m增值指数pi(s+g2/m)明显降低。结果提示，相比于年轻组hsc,衰老hsc组细胞周期进展阻滞，但并没有发生凋亡。