可用于检测与直肠癌相关的PRMT6基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种辅助诊断直肠癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与直肠癌相关的PRMT6基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。

背景技术：

结直肠癌是世界上第三大恶性肿瘤，近年来中国结肠癌发病率由7％激增到13％。结直肠癌发病与生活方式、遗传、大肠腺瘤等关系密切，且发病年龄趋老年化。癌胚抗原 (CEA)作为最广泛使用的肿瘤标志物之一，已经有研究指出其敏感性和特异性不足以用于结直肠癌的诊断，特别是早期诊断。粪便隐血试验(FOBT)是广泛用于结直肠癌检测的无创方法，通常包括gFOBT和iFOBT两种。前者检测易受食品、药品等因素的影响；后者如果从采样到实验室处理的时间超过5天，检测率就会下降。尽管结肠镜检查具有较高的灵敏度和特异性，但肠道出血，肠穿孔，感染等并发症仍然存在，同时患者对其依从性较差。此外，结直肠癌是一种复杂的疾病，主要受遗传因素(例如：原癌基因和DNA修复基因突变，肿瘤抑制基因功能丧失)和环境因素影响。作为遗传学和环境的桥梁因子，表观遗传修饰通过DNA甲基化，基因组印迹，组蛋白修饰等调控基因表达。此外，DNA甲基化作为一种重要的表观遗传学修饰方法，被大量应用与癌症筛检、诊断以及治疗中。大量研究表明 DNA甲基化的异常变化可引起基因组染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，引发癌症。因此，表观遗传学改变在肿瘤形成和发展过程中发挥着重要作用。有研究指出在结直肠癌的早期和晚期都记录了异常基因甲基化，其有可能可以用作结直肠癌理想的筛选生物标志物。

荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，能实时监控反应过程，并结合相应的软件进行产物分析的PCR技术。该方法较其他传统甲基化检测方法在时间上大幅缩减，同时，可以对极微量的DNA基因水平上的改变进行检测和定量。因此，定量检测肿瘤患者中组织中DNA的表观遗传变化对肿瘤的早期诊断、疗效评估、发生机制等研究具有重要意义，更加适合医院或科研院所操作。

编码精氨酸N-甲基转移酶家族蛋白的精氨酸N-甲基转移酶6(PRMT6)基因位于染色体1p13.3上。PRMT的主要功能是在精氨酸残基上甲基化蛋白质的酶，大量实验研究发现其可以甲基化组蛋白，这被认为可以影响癌症的发生和进展。此外，有报道称；与染色质结合的精氨酸N-甲基转移酶家族的成员充当转录共激活剂或共阻遏物，并且已经在不同的癌症类型(例如前列腺癌，乳腺癌和肺癌)中被发现。目前，国内外还没有公开任何关于在结直肠癌中用实时荧光定量PCR检测PRMT6基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的的可用于检测与直肠癌相关的PRMT6基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因 PRMT6基化水平与直肠癌的患病率呈负相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断直肠癌。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：可用于检测与直肠癌相关的PRMT6 基因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括一对PRMT6基因启动子区荧光定量甲基化特异性扩增引物，具体核苷酸序列如下：上游引物：5'-AGCGATTAGATGTTGGAATG-3'；

下游引物：5'-CCACACCATAATACTACTTCAC-3'。

上述可用于检测与直肠癌相关的PRMT6基因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括荧光定量甲基化特异性PCR反应体系，其组成为：5μL SYBR Green I Master，0.25μL浓度为62.3μg/mL的上游引物，0.25μl浓度为66.0μg/mL的下游引物，0.5μL DNA模板和4μL ddH₂O；荧光定量甲基化特异性PCR反应条件如下：1)95℃10分钟，然后 95℃20秒，59℃30秒，72℃30秒45个循环的1个循环；2)在95℃15秒，58℃1分钟和 0.11℃每秒至95℃的熔解曲线分析的1个循环中连续进行；3)在40℃进行10分钟的最终冷却阶段。每例标本设三个复孔，Human Methylated和Non-methylated DNA作为阳性、阴性对照，水为空白对照。

上述可用于检测与直肠癌相关的PRMT6基因启动子区甲基化程度的试剂盒在制备检测直肠癌试剂或者辅助诊断直肠癌试剂中的应用，所述的试剂盒包括一对PRMT6基因启动子区荧光定量甲基化特异性扩增引物，具体核苷酸序列如下：上游引物：5'- AGCGATTAGATGTTGGAATG-3'；下游引物：5'-CCACACCATAATACTACTTCAC-3'。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与直肠癌相关的PRMT6基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其在制备检测直肠癌试剂或者辅助诊断直肠癌试剂中的应用，所述的甲基化定量检测试剂盒包含用于检测PRMT6基因启动子区CpG岛甲基化的一对特异性扩增引物，其通过SYBR Green荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP) 检测受试者组织中PMRT6基因启动子区甲基化修饰变化，通过计算PRMT6基因的甲基化百分比参数以辅助诊断结直肠癌。相对传统结直肠癌检测技术具有发现早，灵敏度高，周期短、简单方便，检测效率高，针对性强，检测结果准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于结直肠癌的早期发现和及时治疗。

附图说明

图1为根据TCGA数据库PRMT6基因甲基化和对应mRNA数据的相关性分析；

图2为根据UCSC数据下载的PRMT6甲基化测定的扩增序列。A是UCSC数据库 (GRCh37)扩增片段的基因组位置和功能注释。其中qMSP引物加下划线，一个CpG位点呈灰色。F代表正向引物；R代表反向引物。B是PRMT6qMSP产物的测序结果。序列的第一行为原始序列；序列的第二行为转换后的序列。C是毛细管电泳的结果。第一列代表标记带；第二列代表空白；第三列代表PRMT6基因带。电泳结果证实片段长度为64bp，与预期一致；

图3为SYBR Green I荧光定量PCR扩增曲线；

图4为SYBR Green I荧光定量PCR溶解曲线的代表图；

图5为PRMT6基因启动子甲基化水平在癌组织、癌旁组织以及正常人肠组织间的比较其中tumor代表癌组织，中位数PMR为0.3693；para-tumor代表癌旁组织，中位数PMR为 0.6312；normal代表正常人肠组织，中位数PMR为5.0655。PMR：甲基化百分比参数；

图6为PRMT6基因甲基化在诊断结直肠癌时的ROC曲线其中(A)结直肠癌肿瘤组织和癌旁组织之间，(B)结直肠癌和正常肠组织之间，(C)肿瘤旁组织和正常肠组织之间 PRMT6低甲基化的诊断价值的ROC曲线。tumor代表癌组织；para-tumor代表癌旁组织； normal代表正常人肠组织；ROC：受试者工作曲线。AUC：曲线下的面积。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

1、研究对象和样本的收集

收集绍兴市第一人民医院，浙江省肿瘤医院，南京中医药大学第三附属医院2011年8月至 2015年1月普外科手术切除的结直肠癌组织以及相应配对的癌旁正常组织各121例。患者年龄61.62±11.55岁，其中男性78例，女性41例；肿瘤大小：≤5cm 80例，>5cm 40例。组织分化程度：高分化或中分化101例，低分化或无分化17例；无淋巴结转移63例，有淋巴结转移56例。其中癌组织取自肿瘤组织的中心位置，癌旁组织距离癌组织5cm以上且为非癌组织，所有病例手术前均未行放疗和化疗并经病理组织学检查证实。另外，从浙江省肿瘤医院收集了22名健康体检人群的结直肠组织作为对照。所有参与实验者均经结肠镜检查及病理检查确诊。显微镜检查显示每个冷冻肿瘤组织样品中存在至少80％的癌细胞，并且在配对的相邻正常组织样品中不存在肿瘤细胞。癌旁组织与肿瘤组织样品在相同的块和层中采集。所取标本离体后立即于液氮罐转运，然后存在于-80℃冰箱。

纳入标准：①初治的结直肠患者；②肠部病变均经病理证实；③肠部病灶要求为原发病灶，而非转移病灶；④术前未行放化疗；⑤无其他恶性肿瘤病史。

排除标准：①无法得到病理证实的结直肠部病变；②有严重的未控制的内科疾病或急性感染者；③妊娠或哺乳期妇女。

所有入组对象均告知并签署知情同意书。

2、全基因组DNA的提取

采用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Hilden，德国)DNA提取试剂盒提取组织全基因组 DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific,美国)检测所得 DNA的浓度，以供PRMT6基因甲基化水平的检测。

3、甲基化修饰

采用EZ DNA Methylation Gold^TM Kit甲基化转化试剂盒(Zymo research,美国)，严格按照试剂盒说明步骤进行操作。经此步后，DNA序列中未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)。

4、TCGA数据库PRMT6甲基化和对应mRNA数据的相关性分析

为了评估PRMT6甲基化与mRNA表达之间的关联，下载TCGA结直肠腺癌队列中的372 个样品的有效数据(http://www.cbioportal.org/)。可知PRMT6基因甲基化数据和表达数据呈现明显的负相关，如图1所示。

5、甲基化引物和探针设计

从UCSC网站(http://genome.ucsc.edu/)下载PRMT6、ACTB基因序列(如图2所示)。荧光定量PCR引物和探针由Primer Premier 5.0软件设计。设计标准：引物扩增片段在80-150 bp，引物长度17-25bp，GC含量在40％-70％，两条引物的Tm值尽量接近。避免引物内部或之间形成3bp以上的互补序列。探针长度20-30bp，探针的Tm值比引物高5℃-10℃，探针内标或探针与引物之间避免形成3bp以上的互补序列。

6、SYBR Green荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)

选择β-肌动蛋白(ACTB)作为内部参考，以校正样品之间质量和数量的差异。通过过量的 SssI甲基转移酶将人精子DNA完全甲基化为阳性对照。对于阴性对照，我们向每个孔加入了无核酸酶的水。所有亚硫酸氢盐修饰的DNA用作qMSP测定中的模板，反应在 LightCycler480的384孔板中进行。10μl最终的反应体系组成为5μL SYBR Green I Master(Roche，瑞士巴塞尔)，0.25μL浓度为62.3μg/mL的上游引物，0.25μl浓度为 66.0μg/mL的下游引物，0.5μL DNA模板和4μL ddH₂O。并在以下条件下进行PCR： 1)95℃10分钟，然后95℃20秒，59℃30秒，72℃30秒45个循环的1个循环；2)在95℃ 15秒，58℃1分钟和0.11℃每秒至95℃的熔解曲线分析的1个循环中连续进行；3)在40℃进行10分钟的最终冷却阶段。

qMSP引物序列如下：

其中目标基因PRMT6启动子区的荧光定量甲基化特异性引物所示的核苷酸序列如下：

上游引物：5'-AGCGATTAGATGTTGGAATG-3'；

下游引物：5'-CCACACCATAATACTACTTCAC-3'；

其中参照基因ACTB的荧光定量甲基化特异性引物所示的核苷酸序列如下：

上游引物：5'-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3'；

下游引物：5'-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3'。

7、甲基化数据计算

根据荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线(图3)以及溶解曲线(图 4)，计算出PRMT6基因相应的甲基化百分比参数(PMR)以辅助诊断结直肠癌。计算方法：甲基化百分比参数＝2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝sample DNA(Ct_PRMT6-Ct_{ACTB control})–完全甲基化DNA(Ct_PRMT6-Ct_{ACTB control})。

其中，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值越小，表明目标序列的浓度越高，而代表甲基化水平的PMR值可直接在 LightCycler480软件中得出。Ct_PRMT6代表目标基因的循环数；Ct_{ACTB control}代表阳性参照 ACT B基因的循环数。

8、结果分析

本次实验采用SPSS 18.0对数据进行整理分析。发明人对PRMT6CpG岛甲基化水平进行配对秩和检验以及独立样本秩和检验，发现：癌组织中PRMT6基因甲基化水平低于癌旁组织，癌组织中PRMT6基因甲基化水平低于正常人肠组织，癌旁组织中PRMT6基因甲基化水平低于正常人肠组织，且差异均具有统计学意义(P值均小于0.01，见图5)。为了定量地反映PRMT6基因甲基化诊断结直肠癌风险的准确性大小，发明人进一步分析了其受试者工作特征曲线(ROC曲线)。由图6显示，在肿瘤组织和癌旁组织之间，qMSP检测PRMT6 基因甲基化诊断结直肠癌风险的ROC曲线下面积(AUC)为0.644(95％CI＝0.596- 0.733)，特异性为53.7％，灵敏度为74.4％(图6A)。在肿瘤组织和正常对照之间，PRMT6低甲基化AUC为0.958(95％CI＝0.919-0.999)，特异性为95.5％，灵敏度为 78.5％(图6B)。此外，在癌旁组织和正常对照之间，PRMT6低甲基化产生显着的AUC 为0.899(95％CI＝0.825-0.972)，特异性为95.5％，灵敏度为78.5％(图6C)，差异有统计学意义(P<0.01)，提示用qMSP检测该基因甲基化用于结直肠癌诊断的价值较高。

本发明试剂盒利用SYBR Green荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)法检测结直肠癌患者组织样本和正常人肠组织中PRMT6基因甲基化程度，具有以下显著特点：(1)操作简便，周期短。该试剂盒可同时测定96个样本，大大缩短检测时间，适合医院或研究所大规模推广应用。(2)稳定性。该试剂盒在-20℃温度下可保存12个月，其灵敏度和特异度都没有下降。本项目开发计划采用分析结直肠癌患者术后癌组织与癌旁组织以及正常人肠组织DNA中的PRMT6基因甲基化程度，结合现代的生物信息技术和统计学原理，提供操作简便、灵敏度高、周期短、检测结果稳定可靠的甲基化定量检测方法，同时为患者的治疗随访和预后评估提供科学依据。

在本发明中，所述DNA样本可以来源于任何生物样品；更优选地，所述待测DNA 选自组织(包括石蜡包埋组织)、细胞、血液、血清、血浆、唾液、精液、尿液，粪便及其他分泌物。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

序 列 表

<110> 宁波大学

<120> 可用于检测与直肠癌相关的PRMT6基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PRMT6基因启动子区荧光定量甲基化特异性扩增上游引物

<400> 1

5'- AGCGATTAGATGTTGGAATG-3' 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PRMT6基因启动子区荧光定量甲基化特异性扩增下游引物

<400> 2

5'- CCACACCATAATACTACTTCAC-3' 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACTB基因荧光定量甲基化特异性扩增上游引物

<400> 4

5'- TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3' 25

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACTB基因荧光定量甲基化特异性扩增下游引物

<400> 5

5'- AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3' 27