一株降解桔霉素的酵母菌及应用的制作方法

本发明属于生物降解毒素的方法，尤其涉及cryptococcuspodzolicusy3酵母在饲料和食品安全等领域的应用。

背景技术：

桔霉素(cit)是一种具有肾毒性的真菌次级代谢产物，其纯品是一种酸性柠檬黄针状晶体，分子式为c13h14o5，结构式为5-甲基-6-氧代3-2-苯并唑-7-羧基，熔点为172℃，极性低，但脂溶性很高，易溶于甲醇，乙腈等大多有机溶剂中。其特殊结构决定了cit具有毒性，主要由青霉，曲霉和红曲霉属产生。pk15细胞(猪肾细胞)测试cit的毒性实验表明，cit浓度大于50mol/l时，细胞钙平衡会发生紊乱，造成pk15死亡现象。还有文献报道cit会造成肾脏，肝和骨髓等细胞内线粒体膜渗透功能出现障碍和氧化还原系统的紊乱。欧洲食品安全局(efsa)指出当前cit的风险评估尚不准确，需进行更多研究。

cit不仅毒性高，而且污染范围十分庞大。青霉菌污染的有根蕨类蔬菜，水果，谷物，果仁等；红曲霉污染的有大米，燕麦等谷物类以及红曲产品等。其中红曲产品污染最为严重，检测到的cit含量为0.23-20.65μg/g，超过了日本的限量标准(0.2μg/g)以及欧盟的限量标准(2μg/g)。同时cit稳定性很高，一般的食品加工条件不会完全消除其在食物中的残留，增加了人类接触的风险性，例如，mol等在法国谷类早餐中检测到cit，含量为0.0015-0.042μg/g。bertuzzi等研究发现cit浓度超过0.003μg/g的栗子占总样品(烘干)的8％。此外，研究还发现桔霉素可以与赭曲霉素a(ota)，展青霉素(pat)发生协同增强作用，提高彼此的毒性。有研究发现cit与ota协同作用的机制之一是cit更易与ota浓度调节蛋白hoat4结合(人类有机阴离子转运蛋白)，使游离ota累积，从而两种毒素混合后，在两种毒素浓度都低的情况下就可引起更强的肾毒性，但更多的协同作用机制还不明确，仍需进一步研究。

控制cit的传统方法包括改变物理环境和添加外源化合物。改变物理环境是通过控制物理因素包括水分，温度、光照和ph等来达到降低cit含量的方法。添加外源化合物即指通过人为添加外源化合物，控制cit产生菌的生长，间接减少cit的产生。然而有诸多缺陷影响实际生产应用：(1)影响食品的感官物性。例如，改变ph以及添加某些外源杀菌物质，会造成原有色香味的改变，影响食品的销售。(2)造成污染。化学方法中的各种农药等杀菌剂的使用会造成很多严重的后果，如药物残留、产生抗性、污染环境等。(3)设备费用高昂。例如辐照与冷藏的方法，效果虽然很好，但是设备费用高昂，推广全面使用困难。(4)应用具有一定的局限性。例如一些冷加工类产品，如果蔬保藏等不适合高温处理。(5)效率低。某些食品加工之前，很多原材料已被cit污染，而这些加工方法对已经存在的cit并不能起到全部去除的作用，这也是其最大的缺陷。因此需要寻找更为有效的方法来控制食品中cit的污染。

随着生物脱毒技术的发展，采用微生物控制食品及饲料产品中桔霉素的污染展现出良好的应用前景，但相关研究在国际范围内目前尚处于起步阶段，影响了生物防治技术在桔霉素控制方面的应用。本发明的目的是提供一株分离自生态果园的的土壤中，能够高效降解桔霉素的酵母菌株，因其具有的高安全性，利用该菌株可实现对食品、饲料及其制品中的桔霉素的控制，保障了人类食品的食用安全性。试验菌经鉴定为一种隐球酵母(cryptococcuspodzolicus)，命名为c.podzolicusy3。研究证明，该菌能够显著地降解桔霉素。

技术实现要素：

本发明所提供的菌株系从镇江市葡萄园土壤中筛选分离得到的一株隐球酵母(c.podzolicusy3)，对桔霉素具有显著降解作用。

本发明使用的隐球酵母(c.podzolicusy3)，经icr小鼠急性毒性试验，确定其具有高度安全性，对人体无害。

本发明采用的技术方案

本发明所提供的降解桔霉素的隐球酵母(c.podzolicusy3)系从镇江市葡萄园土壤中筛选分离得到，在nydb培养基中28℃培养，进行形态学观察；对该菌株的5.8srdna-its区序列分析，进行分子生物学鉴定。

其中所述的菌株y3为隐球酵母(cryptococcuspodzolicus)，系本实验室筛选得到，现保存于位于中国武汉的武汉大学(武昌区八一路珞珈山)的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏菌株编号为cctccno:m2017505，保藏日期为2017年9月14日，建议的分类名称为cryptococcuspodzolicusy3。

本发明所提供的隐球酵母y3的培养方法，按照下述步骤进行：固体培养基采用nyda，培养温度26℃-28℃，时间48h，所述的培养基组成为牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml；液体发酵培养，采用发酵培养基nydb，所述nydb液体培养基组成除不含琼脂外，其他成分同nyda培养基；

利用隐球酵母y3对桔霉素进行降解的方法，按照下述步骤进行：酵母初始浓度为10⁸cells/ml，ph为6，摇床培养温度为28℃，转速为180rpm。当桔霉素初始浓度为5μg/ml时，42h后酵母对其降解率为77％；当桔霉素初始浓度为10μg/ml时，42h后酵母对其降解率为96％；当桔霉素初始浓度为20μg/ml时，42h后酵母对其降解率为98％；在21h-28h内，降解效率最高。

本发明的优点：

(1)本发明所使用的隐球酵母y3，系从生态果园的土壤中筛选得到，可高效降解桔霉素，降解率可达98％；且当桔霉素初始浓度为20μg/ml时，21-35h内酵母对其降解速率最快。

(2)本发明使用的隐球酵母y3，经icr小鼠急性毒性试验，确定其具有高度安全性，对人体无害，因此可应用于控制食品，饲料及其制品等中的桔霉素污染，保障食品，饲料及其制品等的食用安全性。

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。

附图说明

图1：本发明隐球酵母y3its区序列进化关系图；

图2：隐球酵母y3对桔霉素的降解效果；

图3：不同浓度的隐球酵母y3对桔霉素的降解能力；注：10^9：1×10⁹cells/ml隐球酵母菌悬液；10^8：1×10⁸cells/ml隐球酵母菌悬液；10^7：1×10⁷cells/ml隐球酵母菌悬液；10^6：1×10⁶cells/ml隐球酵母菌悬液；

图4：不同培养温度下隐球酵母y3对桔霉素的降解能力；

图5：不同ph下隐球酵母y3对桔霉素的降解能力；

图6：隐球酵母y3对不同初始浓度的桔霉素的降解作用；

具体实施方式

实施例1：降解桔霉素酵母菌的筛选，具体实施步骤如下：

1、从环境中分离酵母单菌落

取葡萄园土壤1g，加入装有10ml无菌水的离心管中，充分震荡混匀，取混匀液，做梯度稀释(10^-4，10^-5，10^-6，10^-7)，涂布在nyda培养基平板上，28℃培养20-36h。挑取优势酵母单菌落，在nyda平板上纯化培养。将分离并纯化后的菌株接种至nyda斜面，28℃培养48h，置于4℃冰箱短期保藏备用。

2、桔霉素测定方法

采用高效液相-荧光检测器的方法(hplc-fld)检测桔霉素，条件如下，色谱柱：安捷伦c18柱(5.0μm,150.0mm×4.6mm)；流动相：乙腈:水(0.03％磷酸)＝50:50；流速：1.0ml/min；柱温：28℃；进样量：20.0μl；检测波长：激发波长为331nm，发射波长为500nm。

3、降解桔霉素酵母的筛选

(1)酵母菌悬液制备：将从果园土壤中分离出的酵母单菌落于nyda培养基中培养48h；然后在含有50mlnydb培养基的250ml的锥形瓶中，分别用无菌接种环接入两环活化好的酵母菌，在180rpm，28℃条件下摇床培养20h；培养完成后在7000×g，4℃条件下，离心10min，并用无菌生理盐水洗涤两次，以去除培养介质；最后用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球计数板将细胞浓度调节至实验所需浓度。

(2)降解桔霉素酵母菌株的筛选：分别向装有5mlnydb液体培养基的锥形瓶中加入适量桔霉素储备溶液，调节桔霉素的初始浓度约为10μg/ml；然后分别加入200μl浓度为1×10⁸cells/ml的酵母菌悬液(hanseniasporauvarum，saccharomycescerevisiae，c.podzolicusy3)，在温度为28℃，摇床转速为180rpm的条件下培养酵母菌；同时，以未加酵母菌悬液仅加入桔霉素的nydb液体培养基作为阴性对照。分别在0h，14h，21h，28h，35h，42h取样，测定桔霉素浓度。每个处理重复3次，整个实验重复2次。

(3)桔霉素降解率的计算

桔霉素降解率(％)＝(初始桔霉素浓度–取样时样品中桔霉素浓度)/初始桔霉素浓度×100％

(4)降解桔霉素酵母菌株的筛选结果

图2所示，在28℃摇床条件下培养一周后，所有未添加酵母菌株的nydb培养基中，桔霉素的浓度基本无变化，降解率几乎均为零，这说明在自然条件下桔霉素的稳定性很强，很难被降解。本发明筛选的酵母降解效果最好，培养2d后在实验室条件下就已经降解98％的桔霉素。

实施例2：隐球酵母y3的微生物学特性

上述菌株y3，经过形态学培养、生理生化特征试验和小亚基5.8srdna和内转录间隔区its1和its2区碱基序列分析，鉴定为隐球酵母(cryptococcuspodzolicus)。

本发明的菌株c.podzolicusy3菌株(菌株编号：cctccno:m2017505)具有以下微生物学特性：

1、形态学特征

(1)在nyda固体培养基平板(牛肉膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml；分装三角瓶后，121℃灭菌20min。)上28℃培养48h，菌落呈卵圆形、边缘整齐、乳白色、表面光滑、质地均匀、易挑起。

(2)在nydb液体培养基中培养24h后，不形成醭，菌液浑浊，有沉淀，镜检酵母细胞呈椭圆形，芽殖，双边出芽，呈现链珠状。

3、分子遗传学鉴定

对筛选菌株c.podzolicusy3小亚基5.8srdna-its区序列分析，在genbank上检索，确定y3为隐球酵母(cryptococcuspodzolicus)。根据检索到的同源菌株，应用dnastar软件的mege5.1程序，构建生物进化关系树如图1。

菌株y3为隐球酵母(cryptococcuspodzolicus)，系本实验室筛选得到，现保存于位于中国武汉的武汉大学(武昌区八一路珞珈山)的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏菌株编号为cctccno:m2017505，保藏日期为2017年9月14日，建议的分类名称为cryptococcuspodzolicusy3。

实施例3：隐球酵母y3对桔霉素降解条件的优化

通过研究菌液浓度、培养温度、培养基ph和不同桔霉素初始浓度等条件下，隐球酵母y3对桔霉素降解效果，确定了其对桔霉素降解的最佳条件为酵母初始浓度为10⁸cells/ml，ph为4，摇床培养温度为28℃，转速为180rpm，且随着桔霉素初始浓度的增加，降解效率加快。当桔霉素初始浓度为5μg/ml时，42h后酵母对其降解率为77％；当桔霉素初始浓度为10μg/ml时，42h后酵母对其降解率为96％；当桔霉素初始浓度为20μg/ml时，42h后酵母对其降解率为98％；在21h-28h内，降解效率最高。

该结果显示本发明隐球酵母y3可对桔霉素标准品进行持续降解，桔霉素标准品降解率可达98％，降解效果明显好于先前相关的研究，如chen等筛选出了一株能够降解cit的肺炎杆菌(npust-b11)，研究结果发现，使用此菌株处理10ppm的cit5h后，可将cit降解到8.67％，10h后可完全降解cit。但肺炎杆菌作为一种人体致病菌，若在食品中添加肺炎杆菌，会造成食品安全问题，不能用于实际生产中；azizi等将酿酒酵母加入小麦面粉中，48h后，样品面粉中cit含量为从1.1-35.5ppb降为0.8-30ppb；此外kanpiengjai还发现了一株对人体无害的土壤根瘤菌(rhizobiumborbori)可以降解cit，96h可将5ppmcit降解，降解率为60％-65％。

1、菌液浓度对降解桔霉素能力的影响

附图3所示，c.podzolicusy3酵母的浓度对cit的降解速率具有影响。当初始浓度为1×10⁴cells/ml和1×10⁵cells/ml时，cit的降解速率比较缓慢。c.podzolicusy3为1×10⁶cells/ml，1×10⁷cells/ml，1×10⁸cells/ml时，cit从21h开始快速被降解，且降解速率的大小依次为1×10⁸cells/ml>1×10⁷cells/ml>1×10⁶cells/ml。在培养42h时，1×10⁸cells/ml处理组的cit降解率达到94％，这可能是由于酵母菌繁殖速度快，营养与空间的竞争影响了酵母菌的生长及代谢，使得桔霉素的降解速率受到影响。

2、培养温度对降解桔霉素能力的影响

附图4所示，当培养温度为15℃时，在培养35h后，cit才开始快速降解。当培养温度为35℃时，cit的浓度几乎不变，表明此温度下c.podzolicusy3酵母不能降解cit。当培养温度为28℃时，降解效果最好，在培养14h后cit开始被降解，且在培养到28h之后，培养基中cit浓度开始稳定。由此图可以推出，培养温度不同，c.podzolicusy3酵母对cit的降解速率也不同。

3、培养基ph对降解桔霉素的影响

附图5所示，当ph＝8时，cit的浓度基本保持不变，表明ph＝8的碱性条件下c.podzolicusy3对cit没有降解作用。当ph＝4和6时，在培养14h后cit均被降解，在42h后降解率均达到94％以上，但是，ph＝4时c.podzolicusy3酵母对cit的降解速率比ph＝6时的略大。由此可以看出，在此实验中适当的酸性条件有助于c.podzolicusy3酵母对cit的降解。

4、不同桔霉素初始浓度下的降解能力

附图6所示，cit初始浓度为5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml时，cit均可以被c.podzolicusy3降解，降解率分别为77％，96％，98％。三组处理都是从21h后开始快速降解cit，到35h时，cit浓度基本趋于稳定。由此可知cit浓度越高，降解率越高。

实施例4：c.podzolicusy3酵母安全性研究

供试动物为icr小鼠，由江苏大学实验动物中心提供，清洁级。将小白鼠分成1020，1534，2831和5130mg/kg四个剂量组进行试验，每个剂量组10只小白鼠，雌雄各半。采用灌胃方式，按0.1ml/l0g体重(10000mg/kg剂量组按0.2ml/10g体重给受试物)进行实验。整个实验过程中，观察小白鼠的日常状况是否有中毒或死亡现象，若第4d继续出现死亡现象，需观察14d，必要时可延长到28d。记录死亡数，查表求出ld50，并记录死亡时间和中毒现象等，确定急性毒性的级别。

试验所用每克酵母冻干粉活菌数为10¹⁵cells/ml，最小剂量活菌数为10¹²cells/ml，远大于实际应用中浓度。表1所示，灌入c.podzolicusy3的小白鼠7d内未出现死亡，且整个实验过程中小白鼠未出现中毒现象，根据急性毒性试验国标可以判定，c.podzolicusy3安全无毒。

该试验结果显示本发明隐球酵母c.podzolicusy3安全无毒，对人体无任何伤害。

表1隐球酵母c.podzolicusy3对小鼠急性经口毒性试验

实施例5：c.podzolicusy3的保藏

本发明的隐球酵母c.podzolicusy3，采用常规的菌种斜面保藏方法，采用培养基首选为nyda培养基(牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml)，也可以使用马铃薯琼脂培养基，26℃-28℃，培养48h。在发酵培养时，可将斜面菌种直接接种至发酵培养基nydb或者麦芽汁培养基中，温度26℃-28℃，摇床转速180rpm的培养条件下，培养24-30h，一般在24h左右可以达到最大生物量。