一种甘薯蔓割病菌LAMP检测引物及其应用的制作方法

本发明涉及一种甘薯蔓割病菌lamp检测引物及其应用，专用于甘薯蔓割病菌的快速分子检测，同时可实现田间甘薯蔓割病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定、防治及生物技术领域。

背景技术：

甘薯又名红薯、山芋、地瓜等，已有四百多年的栽培历史。甘薯产量高、用途广、适应性强，是重要的粮食、饲料和工业原料作物，茎尖叶片还可充作蔬菜，被认为可能是摆脱将来粮食和能源危机的“最后一张王牌”。我国是世界上最大的甘薯生产国家，在我国粮食作物生产中，甘薯仅次于水稻、小麦和玉米，居第四位。甘薯具有耐寒、耐瘠、产量高、适应性广等特点，仍是我国旱地栽培的首选作物。我国居民保持着鲜食甘薯的传统习惯，随着人们对甘薯营养价值的重新认识，及对食用粗粮有益健康的观念的理解和接受，甘薯市场需求市场也必将日益扩大。

甘薯蔓割病又称枯萎病、蔓枯病、茎腐病等，在很多国家和地区均有发生。甘薯蔓割病在我国主要分布在福建、浙江、四川、广东、台湾、山东、辽宁、河南、江苏等省。甘薯蔓割病是典型的土传病害，由镰刀菌（fusariumoxysporumf.spbatatas）侵染引起，造成植株发生全株性枯萎、死亡，是我国南方薯区最重要的病害之一，为害极大。在我国各优质高产薯区发生尤为严重，尤其是丘陵坡地和盆地多以春花生或大豆-晚薯、马铃薯-早薯、早稻-晚薯等轮作模式生产，导致土壤中蔓割病菌基数大，导致甘薯蔓割病发生为害严重，一般减产10%-20%，严重地块减产达50%以上。

土壤带菌及带菌种薯、种苗是引起苗田和大田发生甘薯蔓割病的侵染源，病菌有土壤通过秧苗基部或根部的伤口，或由带菌种薯通过导管侵入秧苗，在导管组织内繁殖，致使患病的甘薯植株发生全株性枯萎和死亡，田间表现为地上部分叶片自下而上变黄脱落，茎维管束变褐色，最后茎部开裂，全株死亡。甘薯蔓割病菌（fusariumoxysporumf.spbatatas）是一种弱寄生性土壤习居菌，厚垣孢子可在土壤中长期存活。因此，建立一套甘薯蔓割病菌方便快捷、结果可靠、灵敏度高的快速诊断技术，实现甘薯蔓割病预警预测、有效控制病原菌的传播和病害流行，实现“避病”的防治措施，有效控制甘薯蔓割病的发生，支撑甘薯产业健康发展，同时将有效减低杀菌剂使用，具有显著的经济和生态效益。

随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，pcr（polymerasechainreaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断，但其需要昂贵的仪器设备，难以在基层部门实现快速、准确的检测。环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification,lamp）技术是由日本科学家notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30min-60min内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比不同的pcr技术，lamp技术全程恒温反应，无需pcr仪，且扩增量大灵敏度高。目前lamp检测已成功应用于人畜病原物、食品安全、环境安全及多种植物病原物检测的报道，但目前有关甘薯蔓割病菌lamp检测的研究尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术中对甘薯蔓割病菌的检测和鉴定程序繁琐、耗时长、对鉴定经验要求高、准确度低，pcr检测需要依靠扩增仪等设备的问题，提供了一种甘薯蔓割病菌lamp检测引物及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

1.甘薯蔓割病菌lamp检测引物的设计

根据甘薯蔓割病菌elongationfactor1-alpha序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对甘薯蔓割病菌具有特异扩增作用的lamp检测引物，包括2条外引物（f3和b3）和2条内引物（fip和bip），其核苷酸序列分别为：

f3：5’-gcgtttgccctctttaccat-3’；

b3：5’-gcatgagcgacaacatacca-3’；

fip:5’-cgagctcagcggcttcctattgacaacctcaatgagcgcatc-3’；

bip:5’-ttcttgacaagctcaaggccgaaggagtctcgaacttccaga-3’。

2.建立甘薯蔓割病菌lamp检测方法，包括以下步骤：

(1)从待检测样品中提取dna；

用于检测病原菌纯培养物时，采用ctab法提取供试菌株基因组dna；用于检测甘薯植株组织是否存在甘薯蔓割病菌时，采用naoh快速裂解法提取甘薯植株组织基因组dna。

(2)以提取待测样品dna为模板进行lamp扩增检测：lamp反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/l的f3和b3，1.6mmol/l的fip和bip，bstdna聚合酶为8u，dna模板50～100ng，12.5ul的lamp反应混合液（40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2%trionx-100），用无菌的超纯水补足25ul。lamp反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。

(3)lamp反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0ul，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色或橘黄色判断为阴性。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0ullamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现梯形条带则判断为阴性。

本发明的有益效果在于：

（1）特异性强、准确性高：本发明是根据真菌elongationfactor1-alpha序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点，选取了6个特定区域设计了对甘薯蔓割病菌具有特异扩增作用的4条lamp引物。已经对不同地理来源的甘薯蔓割病菌、甘薯炭疽病菌、甘薯弯孢霉叶斑病菌、携带甘薯蔓割病菌的植物组织和健康的甘薯组织进行了检测验证，只有甘薯蔓割病菌和携带该病菌的组织呈现阳性，说明本发明所设计的引物及检测方法用于检测甘薯蔓割病菌准确可靠，能有效区分发生在甘薯上症状特征相似的病害；

（2）灵敏度高：lamp对甘薯蔓割病菌的检测灵敏度在dna水平上可达10fg，具有很高的灵敏度；

（3）适用性广、实用性好：本发明的甘薯蔓割病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的甘薯组织进行检测，可实现甘薯蔓割病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，防止病害的爆发流行。

（4）操作简便快速：lamp是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，结果可视化，一般整个检测过程可在1.5小时内完成，操作简便快捷。

附图说明

图1为本发明lamp检测方法对甘薯蔓割病菌的特异性检测结果：上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果，其中泳道m为2000bpdnamarker，泳道2为阳性对照、泳道3-5为甘薯蔓割病菌，泳道6-11分别为：甘薯黑斑病菌、油菜菌核病菌、大豆炭疽病菌、西瓜蔓枯病菌、番茄早疫病菌、阴性对照；其中可视化显色结果中2-5显示绿色荧光，其他不显示。

图2为本发明lamp检测方法对甘薯蔓割病菌的灵敏性检测结果：上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图可视化显色结果，其中泳道m为2000bpdnamarker，泳道2-11的模板dna浓度分别为：10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、阴性对照、阳性对照；其中可视化显色结果中2-9、12显示绿色荧光，其他不显示。

图3为本发明lamp检测方法对甘薯发病组织实用性检测结果，上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果，其中泳道m为2000bpdnamarker，泳道2-7分别为甘薯蔓割病菌、甘薯蔓割病自然发病的甘薯组织、人工接种甘薯蔓割病菌发病的甘薯组织、健康甘薯组织、阳性对照、阴性对照；其中可视化显色结果中2-4、6显示绿色荧光，其他不显示。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1甘薯蔓割病菌lamp引物设计

根据甘薯蔓割病菌elongationfactor1-alpha序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对甘薯蔓割病菌具有特异扩增作用的lamp检测引物，包括2条外引物（f3和b3）和2条内引物（fip和bip），其核苷酸序列分别为：

f3：5’-gcgtttgccctctttaccat-3’；

b3：5’-gcatgagcgacaacatacca-3’；

fip:5’-cgagctcagcggcttcctattgacaacctcaatgagcgcatc-3’；

bip:5’-ttcttgacaagctcaaggccgaaggagtctcgaacttccaga-3’。

实施例2甘薯蔓割病菌lamp检测方法的建立

1.待测样品dna的提取：

①用于检测病原菌纯培养物时，采用ctab法提取供试菌株基因组dna，具体步骤如下：

(1)取0.1g菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl2wt.%ctab提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60min，室温条件下，12000r/min离心15min；

(2)取上清液700μl，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各体积比为25:24:1），温和摇动，室温条件下，8000r/min离心10min；

(3)取上清液500μl，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000r/min离心10min；

(4)取上清液350μl，加入1/10体积3mol/lnaac和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60min，4℃条件下，8000r/min离心5min；

(5)弃去上清液，加入700μl体积浓度为70%冰乙醇，轻摇10sec，4℃条件下，8000r/min离心10sec，晾干，加入50μlte缓冲液，-20℃保存备用。

②用于检测甘薯植株组织是否存在甘薯蔓割病菌时，采用naoh快速裂解法提取甘薯植株组织基因组dna，具体步骤如下：

a.称取待检测的植物组织0.1g，加入0.5mol/lnaoh30μl，将组织充分磨碎成糊；

b.将糊状组织转入1.5ml离心管中，12000r/min离心6min，取上清液5μl；

c.上清液中加入495μl0.1mol/ltris-hcl（ph=8.0），混合均匀，取1.0μl作为pcr模板进行扩增；

2.以提取待测样品dna为模板进行lamp扩增：lamp反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/l的f3和b3，1.6mmol/l的fip和bip，bstdna聚合酶为8u，dna模板50～100ng，12.5ul的lamp反应混合液（40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2%trionx-100），用无菌的超纯水补足25ul。lamp反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。

3.lamp反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0ul，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在甘薯蔓割病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在甘薯蔓割病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0ullamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在甘薯蔓割病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在甘薯蔓割病菌。

实施例3甘薯蔓割病菌lamp检测特异性测定

1.采用ctab法提取3株甘薯蔓割病菌、甘薯黑斑病菌、油菜菌核病菌、大豆炭疽病菌、西瓜蔓枯病菌、番茄早疫病菌的基因组dna。

2.以提取供试菌的dna为模板进行lamp扩增：lamp反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/l的f3和b3，1.6mmol/l的fip和bip，bstdna聚合酶为8u，dna模板50～100ng，12.5ul的lamp反应混合液（40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2%trionx-100），用无菌的超纯水补足25ul。lamp反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。

3.lamp反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0ul，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在甘薯蔓割病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在甘薯蔓割病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0ullamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在甘薯蔓割病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在甘薯蔓割病菌。

4.特异性验证结果

如图1所示，3株甘薯蔓割病菌显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征性梯形条带，而供试其它作物病原菌和阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现lamp特征性梯形条带，表明本发明的lamp引物可以将甘薯蔓割病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于甘薯蔓割病菌的特异性检测和鉴定。

实施例4甘薯蔓割病菌lamp检测灵敏性测定

1.采用ctab法提取甘薯蔓割病菌的基因组dna；

2.将提取的甘薯蔓割病菌的基因组dna，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；

3.以配制的成系列浓度dna为模板进行常规lamp扩增：lamp反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/l的f3和b3，1.6mmol/l的fip和bip，bstdna聚合酶为8u，dna模板50～100ng，12.5ul的lamp反应混合液（40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2%trionx-100），用无菌的超纯水补足25ul。lamp反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。

4.lamp反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0ul，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在甘薯蔓割病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在甘薯蔓割病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0ullamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在甘薯蔓割病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在甘薯蔓割病菌。

5.检测结果

如图2所示，显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征性的梯形带，检测灵敏度可达10fg。

实施例5发病甘薯植株中甘薯蔓割病菌的lamp检测

1..采用ctab法提取甘薯蔓割病菌基因组dna；采用naoh快速裂解法提取甘薯植株组织基因组dna。

2.以提取供试样品的dna为模板进行lamp扩增：lamp反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/l的f3和b3，1.6mmol/l的fip和bip，bstdna聚合酶为8u，dna模板50～100ng，12.5ul的lamp反应混合液（40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2%trionx-100），用无菌的超纯水补足25ul。lamp反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。

3.lamp反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0ul，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在甘薯蔓割病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在甘薯蔓割病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0ullamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在甘薯蔓割病菌；没有出现梯形条带则判断为阴性，不存在甘薯蔓割病菌。

4.检测结果

如图3所示，甘薯蔓割病菌、甘薯蔓割病自然发病的甘薯组织、人工接种甘薯蔓割病菌发病的甘薯组织、阳性对照显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征性的梯形带，而健康甘薯组织、阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现lamp特征性的梯形带，表明本发明lamp引物和检测方法还可用于田间甘薯蔓割病发病植株的检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>一种甘薯蔓割病菌lamp检测引物及其应用

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