本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种富含多糖多酚植物的dna提取方法。
背景技术：
：dna是基本遗传物质，是遗传信息的载体。一定数量及高质量的dna样品是进行限制性酶切、基因克隆、分子杂交、遗传多态性分析以及基因组学等分子生物学研究的基础。随着高通量测序技术的快速发展和测序成本大幅度的降低，基因组测序等分子生物学研究已成为一个重要的热点内容。提取高质量的基因组dna，是获得准确试验结果的基础，是后续分子分析的基础步骤，亦是关键步骤。不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异，在提取植物基因组dna时需要选择不同的方法或者作特殊处理。目前，基因组dna的提取一般采用sds法(十二烷基苯磺酸钠)、ctab法(十六烷基三甲基溴化铵)、基于硅胶基质的吸附离心柱、高盐低ph法(ph为酸碱度符号)、苯酚法、提取试剂盒的使用等方法，提取植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中的dna，用于后续高通量测序构建基因组文库或其他分子生物学分析。使用试剂盒提取方法，价格昂贵，只适合少量dna的提取；而其余提取方法单一使用主要适用新鲜的叶片或者干燥的叶片，对于大多数叶厚汁多、含有大量多糖多酚、单宁等其他次生代谢产物的植物来说，分离出来的dna由于多酚被氧化成棕褐色，多糖、单宁等物质与dna结合成粘稠的胶状物，获得的基因组dna产量低、质量差、易降解，影响dna的质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行pcr扩增，很难满足后续分子生物学试验的要求。专利文献cn102533728a公开了一种富含多糖多酚植物高质量细胞核dna的提取方法，包括下列步骤：①液氮研磨植物材料；②hb抽提缓冲液重悬，涡旋混匀后过滤；③离心，沉淀使用抽提缓冲液i洗三次，重悬；④使用抽提缓冲液ii，rnaseh，65摄氏度水浴30分钟；⑤氯仿-异戊醇抽提一次，异丙醇沉淀；⑥冰预冷75％乙醇洗沉淀1-2次，te缓冲液溶解。该提取方法中的预处理步骤能有效去除线粒体、叶绿体等细胞器dna；避免植物材料中大量存在的多糖、多酚等次生代谢产物对核酸提取步骤产生干扰；适用于广泛植物种的健康组织，或细胞结构较完整的冻存组织。专利文献cn105368815a公开了一种多糖多酚植物基因组的提取方法，步骤为：取植物材料研磨后加入核酸分离缓冲液和β-巯基乙醇，混匀后置水浴中；离心机中离心后弃上清；加入1×pbs溶液，研磨仪上震荡混匀，离心后弃上清；向沉淀中加入预热的3×ctab裂解液并混匀，水浴裂解；加等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；取上清，加入等体积氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；取上清，加入nacl和冰异丙醇，混匀，沉淀1～3小时；取出离心后，将沉淀用乙醇洗涤，风干后加te溶解，即得。该提取方法能有效去除多糖多酚，减少糖和酚类物质对核酸提取的影响，提高dna的质量和浓度。然而，目前的植物dna提取方法多集中于多糖、多酚物质的清除，但是，提取得到基因组dna损失较大，结构不完整以及序列长度的降低，纯度较低，不能满足后续分子分析的要求。技术实现要素：为了克服现有技术中提取多糖多酚植物基因组dna存在的缺陷。本发明的目的在于提供一种富含多糖多酚植物的dna提取方法，以解决上述缺陷。本发明提供了一种富含多糖多酚植物的dna提取方法，包括以下步骤：s1取待提取植物叶片放置液氮下充分研磨成细粉，得样品细粉，将样品细粉转移至预冷的1.5ml离心管中，加入预热温度为65℃的3×ctab裂解液，上下颠倒混匀，加入rna酶，在65℃的温度下水浴20min后，在转速为11000～13000rpm下离心8～12min；s2往步骤s1中的离心管中加入等体积的tris酚-氯仿混合液，颠倒混匀，在转速为11000～13000rpm下离心5min，取上清液，所述tris酚-氯仿混合液由tris酚和氯仿按体积比25:24混合组成，ph值为8.0；s3往步骤s2得到的上清液中加入等体积的氯仿，充分混匀，在转速为11000～13000rpm下离心5min，取上层水相；s4往步骤s3取得的上层水相中加入等体积结合液，得混合液i，接着再加入上述混合液i总体积一半量的无水乙醇，充分混匀，得混合液ii；s5将步骤s4得到的混合液ii转入dna吸附柱中，在转速为11000～13000rpm下离心30s，弃废液，接着加入650μl体积浓度为80％的乙醇，在转速为11000～13000rpm下离心30s；s6重复步骤s5一次；倒弃滤液把柱子放回收集管中，在转速为11000～13000rpm下离心1min，甩干柱子的基质；s7将柱子转移至1.5ml离心管中，打开盖子5min，加入30～100μl无酶无菌水(rnasefreewater)至柱子的膜中央，静置2min，10000×g，离心1min；丢弃柱子，把dna保存于-20℃中，即得。进一步地，所述步骤s1中的3×ctab裂解液与样品细粉的固液比为100mg:1ml。进一步地，所述步骤s1中的rna酶与样品细粉的固液比为10mg:1μl，所述rna酶的浓度为100mg/ml。进一步地，所述步骤s1中3×ctab裂解液的制备方法为：将1.5g，ph值为8.0的ctab，4.091g的氯化钠，5ml的tris-hcl溶液，20ml，ph值为8.0的乙二胺四乙酸溶液，2gn-羧甲基壳聚糖，1g葛根素加入容量瓶，混匀，接着加入depc处理水定容到50ml，即得。进一步地，所述步骤s4中的结合液为浓度为7mol/l的高氯酸钠溶液。进一步地，所述步骤s5中吸附柱的膜为二氧化硅纳米材料膜。进一步地，所述二氧化硅纳米材料膜的制备方法为：a将笼型介孔二氧化硅纳米材料加入去离子水中搅拌均匀，接着加入n-羧甲基壳聚糖搅拌均匀后，在65～75℃温度下搅拌3～4h，过滤，并用去离子水洗2～3遍，冻干后收集粉末，得修饰后的氧化硅纳米材料；b将n-羧甲基壳聚糖溶于去离子中搅拌均匀，得成膜液；c将步骤a的到的修饰后的氧化硅纳米材料加入步骤b得到的成膜液，烘干，成膜，即得。进一步地，所述步骤a中氧化硅纳米材料与n-羧甲基壳聚糖的重量比为3:2。进一步地，所述步骤b中的成膜液为质量浓度为4～6％的n-羧甲基壳聚糖溶液。进一步地，所述步骤c中修饰后的氧化硅纳米材料与成膜液的固液比为1g:5ml。本发明采用的笼型介孔二氧化硅纳米材料购于西安格润纳米科技有限公司，笼型介孔sio2材料(kit-5)。本发明所述的待提取植物叶片是新鲜采集的叶片或者新鲜采集的且经硅胶快速干燥后密封保存的叶片。目前针对富含多糖多酚植物的dna的提取，现有技术改进的思路一般在于两方面，一方面在于尽量去除杂质、蛋白和脂类，另一方面在于加强dna的沉淀效果。ctab在高离子强度的溶液中可以与蛋白质、多糖等物质结合，而不与dna结合，有机溶剂例如：氯仿-异戊醇可以进一步使蛋白质变性分层并去除脂类，但是目前提取的多糖多酚植物的dna提取率较低，纯度较低。经发明人深入研究发现，植物细胞在其生命活动过程中，由于叶绿体、线粒体和质膜上每时每刻都发生着电子传递过程中电子的泄露，产生大量的活性氧，或者是进入植物体内的一些分子氧(o2)，可经单电子还原转变为超氧阴离子自由基，超氧阴离子即可直接作用于蛋白质和核酸等生物分子，也可衍生为羟自由基、单线态氧、过氧化氢及脂质过氧化物自由基等活性氧，引起对细胞结构和功能的破坏，尤其是在富含多糖多酚植物在进行dna提取的时候，会严重破坏dna的结构，降低序列长度，从而降低dna提取的纯度和产量。而目前在核酸分离中添加β-巯基乙醇等还原剂来降低酶类的活性，抑制氧化反应，防止褐化，但是对于已转化的超氧阴离子自由基或活性氧不能起作用，导致整体提取效果还不理想。本发明提供的富含多糖多酚植物的dna提取方法是：采用特定的裂解液对细胞进行裂解，并通过tris酚-氯仿混合液，氯仿以及高氯酸钠结合液进行dna抽提，再采用自制的吸附柱膜对抽提的dna进行纯化，从而获得高质量的基因组dna，是一种较为理想的多糖多酚植物的dna提取方法。本发明采用的裂解液含有n-羧甲基壳聚糖和葛根素，n-羧甲基壳聚糖与葛根素相互作用在ctab裂解细胞后可以高效的去除多酚及其代谢物、多糖，降低酶类的活性，抑制氧化反应，防止褐化，同时还可以有效清除超氧阴离子自由基或活性氧，防止超氧阴离子自由基或活性氧对dna结构的破坏，提高多糖多酚植物dna的纯度和浓度。另外，本发明采用n-羧甲基壳聚糖作为吸附膜的主要成分，其是两性聚电解质，生物相容性好，可以高效的吸附dna，同时还具有抗超氧阴离子自由基或活性氧的作用，可以进一步地保护dna的结构不受损坏，保证提取的基因组dna的完整性。而且，经n-羧甲基壳聚糖修饰后的具有介孔结构的二氧化硅纳米材料，大大降低了二氧化硅纳米材料表面的负电荷性，从而改善二氧化硅纳米材料的相容性，提高二氧化硅纳米材料对dna的吸附作用，将修饰后的氧化硅纳米材料按一定的比例嵌入n-羧甲基壳聚糖膜内，可以极大提高吸附膜对dna的吸附作用，大大提高了dna的纯度和产量。同时，修饰后的氧化硅纳米材料与n-羧甲基壳聚糖成膜液的固液比为低于或高于1g:5ml均会影响对dna的吸附效果。经试验发现，采用本发明提供的富含多糖多酚植物的dna提取方法提取得到的dna纯度高，杂质低，其od260/280介于1.8～2.0之间，od260/230大于2.0，在100mg的样品起始量下，提取得到的基因组dna提取得到的基因组dna不少于3μg，提取得到的基因组dna的浓度不低于30ng/μl，是一种高质量的多糖多酚植物dna的提取方法。与现有技术相比，本发明提供的富含多糖多酚植物的dna提取方法具有以下优势：(1)本发明提供的富含多糖多酚植物的dna提取方法提取dna的纯度高，杂质低，而且提取工艺简单，适合大规模的推广和应用。(2)本发明提供的富含多糖多酚植物的dna提取方法在提取dna的过程中可以防止超氧阴离子自由基或活性氧对dna结构的破坏，保证提取的基因组dna的完整性，利于后续基因文库构建、pcr分析及southern杂交等科学研究。附图说明：图1为试验例一的枇杷的dna琼脂糖凝胶电泳结果图。具体实施方式：以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例1、二氧化硅纳米材料膜的制备：a将笼型介孔二氧化硅纳米材料加入去离子水中搅拌均匀，接着加入n-羧甲基壳聚糖搅拌均匀后，在70℃温度下搅拌4h，所述氧化硅纳米材料与n-羧甲基壳聚糖的重量比为3:2，过滤，并用去离子水洗2遍，冻干后收集粉末，得修饰后的氧化硅纳米材料；b将n-羧甲基壳聚糖溶于去离子中搅拌均匀，制得质量浓度为5％的n-羧甲基壳聚糖成膜液；c将步骤a的到的修饰后的氧化硅纳米材料加入步骤b得到的成膜液，所述修饰后的氧化硅纳米材料与成膜液的固液比为1g:5ml，烘干，成膜，即得。实施例2、一种富含多糖多酚植物的dna提取方法s1取待提取植物叶片放置液氮下充分研磨成细粉，得样品细粉，将100mg样品细粉转移至预冷的1.5ml离心管中，加入1ml预热温度为65℃的3×ctab裂解液，上下颠倒混匀，加入5μl浓度为100mg/ml的rna酶，在65℃的温度下水浴20min后，在转速为12000rpm下离心10min；所述3×ctab裂解液的制备方法为：将1.5g，ph值为8.0的ctab，4.091g的氯化钠，5ml的tris-hcl溶液，20ml，ph值为8.0的乙二胺四乙酸溶液，2gn-羧甲基壳聚糖，1g葛根素加入容量瓶，混匀，接着加入depc处理水定容到50ml制得；s2往步骤s1中的离心管中加入等体积的tris酚-氯仿混合液，颠倒混匀，在转速为12000rpm下离心5min，取上清液，所述tris酚-氯仿混合液由tris酚和氯仿按体积比25:24混合组成，ph值为8.0；s3往步骤s2得到的上清液中加入等体积的氯仿，充分混匀，在转速为12000rpm下离心5min，取上层水相；s4往步骤s3取得的上层水相中加入等体积7mol/l的高氯酸钠溶液，得混合液i，接着再加入上述混合液i总体积一半量的无水乙醇，充分混匀，得混合液ii；s5将步骤s4得到的混合液ii转入dna吸附柱中，所述吸附柱的膜为实施例1制备得到的二氧化硅纳米材料膜，在转速为12000rpm下离心30s，弃废液，接着加入650μl体积浓度为80％的乙醇，在转速为12000rpm下离心30s；s6重复步骤s5一次；倒弃滤液把柱子放回收集管中，在转速为12000rpm下离心1min，甩干柱子的基质；s7将柱子转移至1.5ml离心管中，打开盖子5min，加入60μl无酶无菌水至柱子的膜中央，静置2min，10000×g，离心1min；丢弃柱子，把dna保存于-20℃中，即得。对比例1、一种富含多糖多酚植物的dna提取方法制备方法的区别在于：所述步骤s1中的3×ctab裂解液的制备方法为：将1.5g，ph值为8.0的ctab，4.091g的氯化钠，5ml的tris-hcl溶液，20ml，ph值为8.0的乙二胺四乙酸溶液，2g聚乙烯吡咯烷酮，1g葛根素加入容量瓶，混匀，接着加入depc处理水定容到50ml制得；其余步骤如实施例2。对比例2、一种富含多糖多酚植物的dna提取方法制备方法的区别在于：所述步骤s1中的3×ctab裂解液的制备方法为：将1.5g，ph值为8.0的的ctab，4.091g的氯化钠，5ml的tris-hcl溶液，20ml，ph值为8.0的乙二胺四乙酸溶液，2gn-羧甲基壳聚糖，1gβ-巯基乙醇加入容量瓶，混匀，接着加入depc处理水定容到50ml制得；其余步骤如实施例2。对比例3、一种富含多糖多酚植物的dna提取方法制备方法的区别在于：所述步骤s1中的3×ctab裂解液的制备方法为：将1.5g，ph值为8.0的的ctab，4.091g的氯化钠，5ml的tris-hcl溶液，20ml，ph值为8.0的乙二胺四乙酸溶液，3gn-羧甲基壳聚糖加入容量瓶，混匀，接着加入depc处理水定容到50ml制得；其余步骤如实施例2。对比例4、一种富含多糖多酚植物的dna提取方法制备方法的区别在于：所述步骤s5中的吸附柱的膜为笼型介孔sio2材料；其余步骤如实施例2。对比例5、一种富含多糖多酚植物的dna提取方法制备方法的区别在于：所述步骤s5中的吸附柱的膜采用专利号为201610004927.1制备得到的二氧化硅纳米纤维膜；其余步骤如实施例2。试验例一、枇杷的dna提取试验1、试验材料：枇杷叶子。2、试验方法：采用实施例2提供的富含多糖多酚植物的dna提取方法对枇杷进行dna提取，将提取到的枇杷的dna进行琼脂糖凝胶电泳结果。3、试验结果：枇杷的dna琼脂糖凝胶电泳结果图，如图1所示。采用本发明提供的富含多糖多酚植物的dna提取方法提取得到的dna得率相对比较高，纯度也高。试验例二、富含多糖多酚植物的dna提取试验1、试验材料：绿萝、棉花、海带和杉木。2、试验方法：采用实施例2提供的富含多糖多酚植物的dna提取方法对绿萝、棉花、海带和杉木进行dna提取，采用对比例1～5提供的富含多糖多酚植物的dna提取方法对绿萝进行dna提取，dna纯度采用nanodrop2000超微量分光光度计进行测定。3、试验结果：试验结果如表1所示。表1富含多糖多酚植物的dna提取试验提取方法种类260/280260/230浓度(ng/μl)实施例2绿萝1.982.45120.0实施例2棉花1.892.0850.4实施例2海带1.842.32117.5实施例2杉木1.862.1736.3对比例1绿萝1.521.98105.5对比例2绿萝1.562.01110.4对比例3绿萝1.451.6796.8对比例4绿萝1.261.48114.2对比例5绿萝1.371.55116.9由表1的试验数据可知：(1)绿萝、棉花、海带和杉木等植物采用本发明提供的富含多糖多酚植物的dna提取方法提取得到的dna纯度高，杂质低，其od260/280介于1.8～2.0之间，od260/230大于2.0，在100mg的样品起始量下，提取得到的基因组dna提取得到的基因组dna不少于3μg，提取得到的基因组dna的浓度不低于30ng/μl，是一种高质量的多糖多酚植物dna的提取方法。(2)对比例1～3组对裂解液的成分进行改变，其dna的浓度大大下降，其od260/280值和od260/230值也稍有下降，说明本发明提供的裂解液可以完全裂解细胞，使核苷酸充分的暴露出来，同时，还可以防止多糖，多酚及其代谢物质对提取dna的影响。(3)对比例4～5组吸附柱的吸附膜材料不同，其od260/280值和od260/230值大大下降，其dna的浓度也稍有下降，说明采用本发明提供的自制吸附柱的吸附膜可以有效的提高dna的吸附效果。当前第1页12