一种参与紫草素生物合成的CYP76B74蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于药用植物基因工程领域，具体涉及一种参与紫草素生物合成的cyp76b74蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

药用植物活性成分通常是植物生长发育和适应环境过程中次生代谢产生的一类小分子有机化合物。活性成分生物合成途径的解析是药用植物次生代谢产物研究的核心内容。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为诠释药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。

新疆紫草arnebiaeuchroma(royle)johns是传统中药材紫草arnebiaeradix的重要来源，已被列为野生药材动植物资源三类保护品种。新疆紫草的有效化学成分主要分为两大类，一类是脂溶性的萘醌类化合物和紫草素类化合物；另一类是水溶性成分，主要是多糖类和酚酸类。现代药理学研究发现紫草素类化合物具有抗肿瘤、抗hiv活性、调节免疫、抗生育、抗血栓、镇静、促进伤口愈合等多种临床作用，在医药行业应用广泛。此外，紫草素更是重要的天然染料被国际上称为“天然红色素之王”，具有很高的经济价值。

紫草素为萘醌类化合物。现有研究表明，硬紫草(l.erythrorhizon)细胞的微粒体蛋白中存在对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶(2-geranylhydroquinone-3”-hydroxylase，ghq3”h)，其可以将对苯二酚2-香叶醌(2-geranylhydroquinone，ghq)催化成为3”羟基-对苯二酚2-香叶醌(3”-hydroxy-2-geranylhydroquinone，3”hghq)。对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶是紫草素生物合成过程中的一个关键酶，它是单萜苯醌环化成萘醌前的一步关键的修饰。但是至今未获得对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶的氨基酸序列。因此，编码对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶的基因的克隆和功能研究是解析紫草素生物合成途径的关键。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种参与紫草素生物合成的cyp76b74蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供了一种蛋白质，获自新疆紫草，命名为cyp76b74蛋白，可为如下f1)或f2)或f3)或f4)：

f1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

f2)在序列表中序列1所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；

f3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与紫草素合成相关的蛋白质；

f4)与序列表中序列1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于新疆紫草且与紫草素合成相关的蛋白质。

为了使f1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

上述f3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明还保护编码cyp76b74蛋白的核酸分子(cyp76b74基因)。

所述编码cyp76b74蛋白的核酸分子可为如下a1)或a2)或a3)或a4)所示的dna分子：

a1)编码区是序列表中序列2所示的dna分子；

a2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的dna分子；

a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于新疆紫草且编码cyp76b74蛋白的dna分子；

a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码cyp76b74蛋白的dna分子。

上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明还保护含有cyp76b74基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

本发明还保护cyp76b74蛋白，或，cyp76b74基因，或，含有cyp76b74基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，的应用；具体可为如下c1)至c10)中至少一种：

c1)作为对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶；

c2)制备具有对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶的功能的产品；

c3)催化对苯二酚2-香叶醌；

c4)制备用于催化对苯二酚2-香叶醌的产品；

c5)将对苯二酚2-香叶醌催化成3”羟基-对苯二酚2-香叶醌；

c6)制备用于将对苯二酚2-香叶醌催化成3”羟基-对苯二酚2-香叶醌的产品；

c7)生产3”羟基-对苯二酚2-香叶醌；

c8)制备用于生产3”羟基-对苯二酚2-香叶醌的产品；

c9)生产紫草素类化合物；

c10)制备用于生产紫草素类化合物的产品。

上述应用中，所述c9)或c10)中，所述紫草素类化合物可为ivs、dms、ibs、aoivs、as和hivs中的至少一种。

上述应用中，所述c7)或c8)中，所述“生产3”羟基-对苯二酚2-香叶醌”可以对苯二酚2-香叶醌作为底物。

本发明还保护一种重组菌，是将cyp76b74基因导入宿主菌中得到的；所述宿主菌可为酵母。

上述任一所述酵母可为k1)或k2)：k1)酿酒酵母；k2)酿酒酵母by-t20。

所述cyp76b74基因可通过含有cyp76b74基因的重组表达载体导入宿主菌。

可用现有的表达载体构建含有cyp76b74基因的重组表达载体。使用cyp76b74基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；此外，使用cyp76b74基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

所述重组表达载体具体可为以质粒pesc-trp为出发载体，将序列表的序列2所示的dna分子插入到flag标签之前得到的重组表达载体。

本发明还保护一种对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶的制备方法，可包括如下步骤：培养所述重组菌，从培养产物中分离得到对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶。

所述培养重组菌包括如下步骤：

(a1)将重组菌接种至含20g/ld-葡萄糖的sd-his-trp液体培养基中培养，得到菌液；

(a2)将步骤(a1)培养后的菌液离心收集沉淀；

(a3)使用含20g/l半乳糖的sd-his-trp液体培养基重悬步骤(a2)得到的菌体，继续培养。

步骤(a1)中，所述培养具体可为30℃、250rpm培养。

步骤(a1)中，所述菌液od600nm可为0.6。

步骤(a2)中，所述离心具体可为4000g离心。

步骤(a3)中，所述培养具体可为30℃、250rpm培养。

步骤(a3)中，所述培养时间具体可为24h。

所述培养重组菌还包括完成步骤(a3)后，收集培养体系，离心收集菌体沉淀。

所述离心具体可为4000g离心。

所述从重组菌中得到对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶的方法具体可为从所述菌体沉淀中提取酵母微粒体蛋白，得到对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶。

所述提取酵母微粒体蛋白具体可采用玻璃珠法。

本发明还保护3”羟基-对苯二酚2-香叶醌的制备方法，可包括如下步骤：

e1)培养所述重组菌，从培养菌液中得到对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶；

e2)用对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶催化对苯二酚2-香叶醌，从催化产物中分离得到3”羟基-对苯二酚2-香叶醌。

所述培养具体可为将所述重组菌接种至含20g/l半乳糖的sd-his-trp液体培养基中培养。

所述培养的培养体系初始od600nm可为0.6。

所述培养具体可为30℃、250rpm培养。

所述培养时间可为24h-72h。

所述培养时间具体可为24h。

所述培养时间具体可为48h。

所述培养时间具体可为72h。

所述对苯二酚2-香叶醌的使用浓度可为50μm-200μm。

对苯二酚2-香叶醌的使用浓度具体可为50μm。

对苯二酚2-香叶醌的使用浓度具体可为200μm。

对苯二酚2-香叶醌的使用浓度具体可为100μm。

所述从催化产物中分离得到3”羟基-对苯二酚2-香叶醌具体可通过uplc分离纯化实现。

所述从催化产物中分离得到3”羟基-对苯二酚2-香叶醌具体包括如下步骤：

(b1)将催化产物采用乙酸乙酯超声提取，收集上清液(有机相)；

(b2)将步骤(b1)提取的上清液(有机相)用氮气吹干乙酸乙酯后用甲醇溶解，将溶解产物过滤后通过uplc分离纯化。

步骤(b1)中，所述催化产物与乙酸乙酯的体积配比可为1:1。

步骤(b2)中，所述过滤可为0.22μm微孔滤膜过滤。

所述uplc分离纯化的参数如下：色谱柱可为watersc181.8μm2.1×100mmt3hhs；洗脱液由溶液a和溶液b组成：溶液a可为乙腈，溶液b可为0.1％(体积分数)甲酸水溶液；流速：0.5ml/min；洗脱程序可为：0min，10％(v/v)溶液a；4min，35％(v/v)溶液a；4.3min，60％(v/v)溶液a；8min，72％(v/v)溶液a；8.5min，98％(v/v)溶液a；10.5min，98％(v/v)溶液a；11min，10％(v/v)溶液a；13min，10％(v/v)溶液a。收集保留时间可为23minmin出现的色谱峰对应的洗脱液；柱温40℃；pda检测器全波长扫描。

本发明还保护试剂盒甲，所述试剂盒甲可包括所述重组菌。

本发明还保护试剂盒乙，所述试剂盒乙可包括所述重组菌和对苯二酚2-香叶醌。

所述试剂盒甲或试剂盒乙的用途可为生产3”羟基-对苯二酚2-香叶醌或紫草素类化合物。

本发明专利由国家自然科学基金(no.81473307、81703648)共同资助。

本发明提供的cyp76b74蛋白与紫草素类化合物合成密切相关，其能将对苯二酚2-香叶醌催化成为3”羟基-对苯二酚2-香叶醌。本发明对于调节生产植物萘醌类化合物和通过生物技术提高新疆紫草中萘醌类活性成分紫草素类的含量具有重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为实施例2步骤二中5的uplc检测结果。

图2为实施例2步骤三中7核磁共振氢谱(¹hnmr)图。

图3为实施例2步骤三中7核磁共振碳谱(¹³cnmr)图。

图4为cyp76b74蛋白的酶促动力学反应米氏常数图。

图5为cyp76b74蛋白的催化对苯二酚2-香叶醌的转化率实验结果。

图6为体视显微镜的观察结果。

图7为实时荧光定量pcr的实验结果。

图8为uplc检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，涉及的符号缩写的英文全称和中文全称详见表2。

表2

酿酒酵母by-t20记载于如下文献中：dai，z.，etal.(2013)."metabolicengineeringofsaccharomycescerevisiaeforproductionofginsenosides."metabolicengineering20:146-156.，公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。酿酒酵母by-t20来源于酿酒酵母by4742，是一种能产生大量二萜类化合物的底盘菌。

微粒体蛋白浓度的测定均采用改良型bradford法蛋白质浓度测定试剂盒(上海生工生物科技有限公司的产品，产品编号为sk3041)进行。

ghq委托药明康德新药开发有限公司合成。nadph、fad、fmn、6-磷酸-葡萄糖和6-磷酸-葡萄糖脱氢酶均未索莱宝生物科技有限公司的产品。质粒pesc-trp为invitrogen公司的产品。入门载体pentr^tmsd/d-vector和rna干扰载体pk7gwiwg2d均为invitrogen公司的产品。

sd-his-trp液体培养基：将8ghistrpminusmedia溶于1l去离子水，121℃灭菌15min。histrpminusmedia为北京泛基诺生物有限公司的产品，产品目录号为ygm003a-17。

实施例1、cyp76b74蛋白及其编码基因的获得

通过对新疆紫草进行大量序列分析、表达量分析与功能验证，发现了一个dna编码序列，其编码的蛋白质如序列表的序列1所示。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为cyp76b74蛋白，由496个氨基酸残基组成。将编码cyp76b74蛋白的基因命名为cyp76b74基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例2、cyp76b74蛋白功能分析

一、重组菌株的构建

1、构建重组质粒pesc-trp-cyp76b74。根据测序结果，对重组质粒pesc-trp-cyp76b74进行结构描述如下：以质粒pesc-trp为出发载体，将序列表的序列2所示的dna分子插入到flag标签之前。

2、将步骤1制备的重组质粒pesc-trp-cyp76b74转化酿酒酵母by-t20，得到重组菌株by-t20-cyp76b74；将质粒pesc-trp转化酿酒酵母by-t20，得到重组菌株by-t20-trp(以下简称转空载体菌株)。

二、体外酶促实验

teg缓冲液：含20％(v/v)甘油的te缓冲液。

沉淀缓冲液：含0.225mnacl和0.15g/mlpeg4000的tesb缓冲液。

tesb缓冲液：含0.6m山梨醇和1mmedta的ph7.5、50mm的tris-hcl缓冲液。

tek缓冲液：含0.1mkcl和1mmedta的ph7.5、50mm的tris-hcl缓冲液。

待测菌株为：重组菌株by-t20-cyp76b74或转空载体菌株。

1、将待测菌株的单菌落接种于10ml含20g/ld-葡萄糖的sd-his-trp液体培养基中，30℃、250rpm培养24h，得到培养菌液1；取5ml培养菌液1接种至50ml含20g/ld-葡萄糖的sd-his-trp液体培养基中，30℃、250rpm培养12h，得到培养菌液2；取培养菌液2，4000g离心5min，收集菌体沉淀1；取菌体沉淀1，先加入25ml去离子水洗涤(目的为除去残留的d-葡萄糖)，再加入50ml含20g/l半乳糖的sd-his-trp液体培养基重悬菌体，30℃、250rpm培养24h，4000g离心5min，收集菌体沉淀2。

2、取步骤1收集的菌体沉淀2，采用玻璃珠法提取酵母微粒体蛋白。具体步骤依次如下：

(1)用5mltek缓冲液重悬步骤1收集的菌体沉淀2，室温放置5min，离心收集菌体；

(2)用500μl冰浴的tesb缓冲液重悬菌体，得到菌悬液；

(3)向菌悬液中小心加入玻璃珠，使其刚好接触菌悬液表面，4℃涡旋震荡30min破碎菌体，加入1ml的tesb缓冲液，回收上清。

(4)加入tesb缓冲液清洗3次，每次均回收上清；然后合并上清，4℃、12000rpm离心15min，收集上清。

(5)向上清中加入2倍体积的沉淀缓冲液，冰浴15min，4℃、12000rpm离心15min，收集沉淀。

(6)采用400μlteg缓冲液溶解沉淀，得到酵母微粒体蛋白溶液。

3、测定将步骤2得到的酵母微粒体蛋白溶液的浓度，蛋白浓度为20mg/ml。

4、取步骤3定量后的酵母微粒体蛋白溶液，配制反应体系进行体外酶促反应，得到反应产物。

反应体系为1ml，由微粒体蛋白溶液(蛋白含量为500μg)、tris-hcl(ph7.5)50mm、nadph1mm、fad5μm、fmn5μm、6-磷酸-葡萄糖50mm、6-磷酸-葡萄糖脱氢酶1u、ghq100μm和蒸馏水组成。

反应条件：28℃、150rpm反应4h。

5、向反应产物中加入等体积的乙酸乙酯，涡旋1min，离心收集上清有机相，保留下层菌液。

6、向步骤5的下层菌液中再次加入等体积乙酸乙酯，涡旋1min，离心收集上清有机相。

7、合并步骤5和步骤6得到的上清有机相，用氮气吹干乙酸乙酯，得到混合物。

8、取步骤7得到的混合物，加入等体积甲醇溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，用于uplc-ms/ms检测。

ghq作为标准品也进行uplc-ms/ms检测。

uplc检测采用watersacquity-uplc-pda系统。检测参数如下：

色谱柱：watersc181.8μm2.1×100mmt3hhs；

洗脱液由溶液a和溶液b组成：溶液a为乙腈，溶液b为0.1％(体积分数)甲酸水溶液。

流速：0.5ml/min；

采用梯度洗脱的方式：0min，10％(v/v)溶液a；4min，35％(v/v)溶液a；4.3min，60％(v/v)溶液a；8min，72％(v/v)溶液a；8.5min，98％(v/v)溶液a；10.5min，98％(v/v)溶液a；11min，10％(v/v)溶液a；13min，10％(v/v)溶液a。

柱温40℃；

pda检测器全波长扫描。

质谱条件：离子化模式为电喷雾(esi)负离子或正离子，毛细管电压为2500v，锥孔电压为40v，除溶剂气体为氮气，流速900l/h，除溶剂温度为450℃，离子源温度为100℃，扫描范围为50至1000da。低能量扫描时碰撞电压为6v，高能量扫描时碰撞电压为25-40v。准确质量数用leucineenkephalin作校正液。lc-ms操作软件为masslynax4.1。

实验结果见图1(pesc-trp-cyp76b74为重组菌株by-t20-cyp76b74，pesc-trp为转空载体菌株)：重组菌株by-t20-cyp76b74的微粒体蛋白的酶促反应产物除了ghq(rt＝6.53min)的吸收峰以外，在极性增大的地方(rt为5.49min)出现了一个吸收峰。通过uplc-ms/ms检测，该化合物的精确分子量([m+h]＝263.16417)为ghq精确分子量([m+h]＝247.16926)加上一个氧原子。

三、cyp76b74蛋白催化产物的富集及结构鉴定

1、发酵液的获得

采用气升式光照植物微生物发酵罐进行发酵培养，具体步骤如下：

(1)将重组菌株by-t20-cyp76b74的单菌落接种于10ml含20g/ld-葡萄糖的sd-his-trp液体培养基中，30℃、250rpm培养24h，得到菌液1；将菌液1接种于600ml含20g/ld-葡萄糖的sd-his-trp液体培养基中，30℃、250rpm培养24h，得到菌液2，即为种子液。

(2)取步骤(1)制备的种子液，4000g离心5min，收集沉淀；将沉淀用sd-his-trp液体培养基重悬，得到重悬液。

(3)打开气升式光照植物微生物发酵罐的电源，运行系统，校正ph值电极和溶氧电极，组装发酵罐，检查发酵罐气密性。

(4)完成步骤(3)后，向发酵罐中加入3lsd-his-trp液体培养基。配制发酵过程中需要补充的碳源(20％(m/v)半乳糖水溶液，过滤除菌)、ynb无氨基酵母氮源(索莱宝公司的产品，高压蒸汽灭菌)、ph调节物质(无菌氨水)。

(5)完成步骤(4)后，组装发酵罐，然后将整个发酵罐和氮源放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌15min。

(6)完成步骤(5)后，将发酵罐置于发酵台上，连接过滤空气、冷凝水和搅拌机，进行冷却(亦可待其自行冷却，只是所需时间较长)。待发酵罐中的培养基冷却至30℃，即可接种。接种时将发酵罐置于超净工作台内，从接种口向发酵罐中加入适量体积的碳源，然后将步骤(2)制备的重悬液接种至发酵罐，并连接好无菌的碳源和ph调节物质。

(7)完成步骤(6)后，连接发酵装置，通过调节通气量和转速使溶氧量最好在90％-110％之间，设定罐温30℃，设定ph值4.5，打开自动调节ph的功能，发酵罐能自动加入氨水使ph值维持在4.5左右。发酵24h后开始添加碳源和氮源，每次加入碳源和氮源的量为至原浓度的1/2，往后每12h补料一次(诱导蛋白表达一般发酵48h至od600nm约为5)，得到发酵液。

发酵过程中可以从取样口取样检测菌液浓度od600nm值、培养基中半乳糖含量等。

2、采用高压破碎&超速离心法提取酵母微粒体蛋白

破碎缓冲液：含1mmedta、5％(v/v)glycerol和1mmpmsf的ph7.4、50mm磷酸缓冲液。

(1)取发酵液，离心收集菌体，然后用ph7.2-7.4、0.01m的pbs缓冲液洗涤两次。

(2)完成步骤(1)后，用破碎缓冲液重悬菌体，然后用高压细胞破碎仪破碎酵母细胞8-10遍，得到破碎液。

(3)完成步骤(2)后，取破碎液，4℃、12000rpm离心15min，收集上清。

(4)完成步骤(4)后，取上清，超高速离心(4℃、160000g离心1h)沉淀微粒体蛋白，收集沉淀。

(5)完成步骤(4)后，取沉淀，用含1mmedta和20％(v/v)甘油的ph7.5、50mm的tris-hcl缓冲液溶解，得到酵母微粒体蛋白溶液。

3、取酵母微粒体蛋白溶液，配制反应体系并进行体外酶促反应，得到反应产物。

每个反应体系为2ml，由微粒体蛋白溶液(蛋白含量为1000μg)、tris-hcl(ph7.5)50mm、nadph1mm、fad5μm、fmn5μm、6-磷酸-葡萄糖50mm、6-磷酸-葡萄糖脱氢酶2u、ghq100μm和蒸馏水组成。

反应条件：28℃、150rpm反应24h。

4、向各个反应产物中加入等体积的乙酸乙酯，涡旋1min，离心收集上清有机相，保留下层菌液。

5、将步骤5的下层菌液用乙酸乙酯萃取4次。每次萃取的步骤为：向上一步骤得到的下层菌液中再次加入等体积乙酸乙酯，涡旋1min，离心收集上清有机相。

6、合并步骤4和步骤5得到的上清有机相，先加入无水硫酸钠脱水，再用旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯，最后丙酮溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，用氮气吹干。

7、完成步骤6后，加入甲醇溶解，得到的溶解液用于半制备液相分离纯化。

半制备液相分离纯化采用岛津lc-6ad系统。具体如下：色谱柱：ymc-packods-a250×10mml.d.s-5μm，12nm；进样量500μl；检测波长292nm、254nm，流速4ml/min，梯度洗脱：30min，40％乙腈-60％水，目标成分保留时间约为23min，手动收集馏分。

8、完成步骤7后，取收集的馏分，uplc检测目标成分的纯度后合并，蒸干，得到纯化合物(约2.5mg)。将纯化合物用真空冷冻干燥机干燥，称重，产物溶于氘代氯仿，通过核磁和质谱验证产物表征。

核磁共振氢谱(¹hnmr)图见图2。核磁共振碳谱(¹³cnmr)图见图3。

¹h-nmr和¹³c-nmr表征结果分析见表3。分析结果表明，cyp76b74蛋白能催化ghq的3”位碳原子进行羟基化反应，生成3”hghq。

表3

实施例3、cyp76b74蛋白的酶促动力学参数分析

1、配制反应体系。反应体系为1ml，由微粒体蛋白溶液(蛋白含量为500μg)、tris-hcl(ph7.5)50mm、nadph1mm、fad5μm、fmn5μm、6-磷酸-葡萄糖50mm、6-磷酸-葡萄糖脱氢酶1u、ghq和蒸馏水组成。ghq在反应体系中的浓度为0μm、5μm、10μm、15μm、30μm、40μm、60μm或100μm(每个浓度三个重复)。

2、取步骤1配制的反应体系，进行体外酶促反应，得到反应产物。

反应条件：30℃、150rpm反应30min。

3、向反应产物中加入等体积的乙酸乙酯，涡旋1min，离心收集上清有机相，保留下层菌液。

4、向步骤3的下层菌液中再次加入等体积乙酸乙酯，涡旋1min，离心收集上清有机相。

5、合并步骤3和步骤4得到的上清有机相，用氮气吹干乙酸乙酯，得到混合物。

6、取步骤5得到的混合物，加入等体积甲醇溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，用于uplc检测。

uplc检测的参数同实施例2步骤二中8。

7、完成步骤6后，运用graphpadprism6软件进行分析，点击分析“analyze”选择非线性拟合“nonlinearregression”，打开酶促动力学“enzymekinetics”选项，选择米氏常数计算方式“michaelis-mentenenzymekinetics”进行分析。

实验结果见图4。结果表明，cyp76b74蛋白的酶促动力学参数如下：km为22.97±6.201μm，vmax为8.277±0.828(μmolsproduct/mmolsprotein/min)，由此可见，ghq与cyp76b74蛋白具有较高的亲和性。

上述结果与sung，p.h.等(sung，p.h.，etal.(2011)."functionalexpressionofgeraniol10-hydroxylaserevealsitsdualfunctioninthebiosynthesisofterpenoidandphenylpropanoid."journalofagriculturalandfoodchemistry59(9)：4637-4643.)研究cyp450基因crg10h对其天然底物香叶醇的催化活力km值相似。结果表明，ghq可能是cyp76b74蛋白在植物体内的天然底物。

实施例4、cyp76b74蛋白催化ghq生成3”hghq

1、配制反应体系。反应体系为1ml，由微粒体蛋白溶液(蛋白含量为500μg)、tris-hcl(ph7.5)50mm、nadph1mm、fad5μm、fmn5μm、6-磷酸-葡萄糖50mm、6-磷酸-葡萄糖脱氢酶1u、ghq和蒸馏水组成。ghq在反应体系中的浓度为100μm。

2、取步骤1配制的反应体系，进行体外酶促反应，得到反应产物。

反应条件：30℃、150rpm反应4h。

3、向反应产物中加入等体积的乙酸乙酯，涡旋1min，离心收集上清有机相，保留下层菌液。

4、向步骤3的下层菌液中再次加入等体积乙酸乙酯，涡旋1min，离心收集上清有机相。

5、合并步骤3和步骤4得到的上清有机相，用氮气吹干乙酸乙酯，得到混合物。

6、取步骤5得到的混合物，加入等体积甲醇溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，用于uplc检测。

uplc检测的参数同实施例2步骤二中8。

检测结果见图5。结果表明，cyp76b74蛋白能有效的催化ghq生成3”hghq，ghq的底物转化率达到89.46％。

实施例5、rna干扰功能验证

1、采用gateway技术构建rna干扰载体。具体步骤如下：将序列2自5’末端起第83-492位所示的dna分子和入门载体pentr^tmsd/d-vector进行br反应，得到重组质粒；将重组质粒和rna干扰载体pk7gwiwg2d进行lr反应，得到rna干扰载体。

2、完成步骤1后，将rna干扰载体转化发根农杆菌c58c1，得到重组农杆菌c58c1-cyp76b74-rnai。

3、完成步骤2后，采用农杆菌侵染法将重组农杆菌c58c1-cyp76b74-rnai侵染新疆紫草的子叶，培养，得到多个不同新疆紫草cyp76b74干扰毛状根株系。

4、完成步骤3后，分别切下长至2-3cm的新疆紫草cyp76b74干扰毛状根株系，转移至含50mg/l卡那霉素和400mg/l头孢霉素的无铵离子1/2ms固体培养基，培养，待毛状根长至5cm时，切下部分根尖并通过荧光显微镜观察，将4个长势良好并成功转化干扰载体(有gfp荧光蛋白表达)的毛状根株系分别命名为rr1至rr4。

5、完成步骤4后，分别将rr1至rr4的毛状根转移至含50mg/l卡那霉素和400mg/l头孢霉素的无铵离子1/2ms液体培养基，在黑暗条件下25℃、110rpm振荡培养10d。

6、对步骤5得到的rr1至rr4毛状根，分别切取根尖采用体视显微镜的观察。

7、对步骤5得到毛状根提取总rna，反转录，得到cdna。然后对得到的cdna的cyp76b74基因、aegdps基因(genebank号为dq395088.1)、aepgt基因(genebank号为dq397513.2)、aepal基因(genebank号为dq445051.1)、aehmgr基因(genebank号为dq453140.1)、ae4cl基因(genebank号为dq400697.2)、aepgt6基因(genebank号为kt991524)和aec4h基因(genebank号为dq417206.3)进行实时定量pcr分析。检测cyp76b74基因的引物为5′caacatcggattcttctaaac-3′和5′-attgctgggactgatacaact-3′。检测aegdps基因的引物为5′-gcggggaaggatgtggta-3′和5′-aaatggaaggggagcgaat-3′。检测aepgt基因的引物为5′-gtccaagcaagcacagcag-3′和5′-ccaaactgcccaccatcc-3′。检测aepal基因的引物为5′-tggctcggtcctcttattga-3′和5′-aataggcgtgccctggaa-3′。检测aehmgr基因的引物为5′-ggctactaccgaagggtgc-3′和5′-ggtgccaaacctcacgaca-3′。检测ae4cl基因的引物为5′-aggagcatgtggtacagtcgtta-3′和5′-agacaccagtttcggtatctatga-3′。检测aepgt6基因的引物为5′-gcttcttggtgggtttgttatc-3′和5′-cggtgaagataggtcaactgtaa-3′。检测aec4h基因的引物为5′-cgtcgtttcgtcccctgat-3′和5′-catgtcttgtcctttacctgtga-3′。内参为18s基因(wang,s.，etal.(2014)."differentsecondarymetabolicresponsestomejatreatmentinshikonin-proficientandshikonin-deficientcelllinesfromarnebiaeuchroma(royle)johnst."plantcelltissueandorganculture119(3):587-598.)，内参的引物为5′-tgttggatgtggtggattgtg-3′和5′-aacgaacgagttggaaagca-3′。

8、完成步骤5后，分别取rr1至rr4的毛状根和相应的液体培养基，采用uplc检测紫草素类化合物(如异戊酰紫草素(ivs)、β,β二甲基丙烯酰紫草素(dms)、异丁酰紫草素(ibs)、β-乙酰氧基异戊酰紫草素(aoivs)、乙酰紫草素(as)和β羟基异戊酰紫草素(hivs)的含量。

按照上述步骤2-8，将重组农杆菌c58c1-cyp76b74-rnai替换为重组农杆菌c58c1-pk7gwiwg2d，其它步骤均不变，得到4个独立的成功转化空载体(有gfp荧光蛋白表达)的新疆紫草(分别命名为ri1至ri4)的毛状根株系。重组农杆菌c58c1-pk7gwiwg2d为将载体pk7gwiwg2d转化发根农杆菌c58c1得到的。

体视显微镜观察结果见图6(左图为转干扰载体的新疆紫草，右图为转空载体的新疆紫草)。结果表明，转干扰载体的新疆紫草的毛状根呈现出粉红色或白色，紫草素的积累受到严重抑制；转空载体的新疆紫草的毛状根则呈深红色。

实时定量pcr的实验结果见图7(a为cyp76b74基因，b为aegdps基因，c为aepgt基因，d为aepal基因，e为aehmgr基因，f为ae4cl基因，g为aepgt6基因，h为aec4h基因)。结果表明，转干扰载体的新疆紫草的毛状根中，cyp76b74基因的表达量明显受到了抑制，同时新疆紫草紫草素生物合成途径的其它关键酶基因(如aegdps基因、aepgt基因、aepal基因、aehmgr基因、ae4cl基因、aepgt6基因、aec4h基因)的表达量也显著下调。

uplc检测结果见图8(左图为毛状根中紫草素类化合物的含量，右图为毛状根的液体培养基中紫草素类化合物的含量)。与转空载体的新疆紫草相比，转干扰载体的新疆紫草的毛状根中紫草素类化合物的平均含量下降了6－8倍。转干扰载体的新疆紫草的毛状根和其液体培养基中的6种紫草素类化合物的积累都得到了抑制，尤其是β-乙酰氧基异戊酰紫草素(aoivs)的含量几乎完全被抑制，在毛状根中其含量平均下降了36倍，在液体培养基中其含量平均下降了476倍。cyp76b74基因的表达量下降与紫草素类化合物含量下降的正相关性表明cyp76b74蛋白在新疆紫草体内紫草素生物合成过程中具有重要的功能。

<110>中国中医科学院中药研究所

<120>一种参与紫草素生物合成的cyp76b74蛋白及其编码基因与应用

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