本发明涉及生物催化领域，具体地涉及一种四氢呋喃-2-甲酸的制备方法。
背景技术：
头孢维星(cefovecin)是由smithklinebeecham公司研发的一种半合成第3代头孢菌素。在20世纪90年代中期，辉瑞动物保健公司收购了smithk-linebeecham公司的动物保健部门之后，研发了头孢维星钠盐，即头孢维星钠，大大降低了生产成本，使得头孢维星可以形成商品化规模生产(商品名：康卫宁，convenia)。头孢维星现主要用于犬和猫，具有吸收迅速、消除缓慢、生物利用度高、药效维持时间长、治疗指数高等特点，可作为犬、猫的长效抗生素使用。
(s)-四氢呋喃-2-乙酰基(cas：131328-27-3)是其中的关键中间体，结构式如下：
目前国内外报道的(s)-四氢呋喃-2-乙酰基的制备方法有us20030114693a1公布的以(s)-四氢呋喃-2-甲酰胺为原料，经由甲苯磺酰氯-吡啶脱水剂脱水反应得到(s)-四氢呋喃-2-甲腈，再经与甲基氯化镁反应得到(s)-四氢呋喃-2-乙酰基的方法。另有精细化工中间体，2015,45(1),39-41报道了其改进方法，以(s)-四氢呋喃甲酸为原料，先经酯化为(s)-四氢呋喃-2-甲酸乙酯，再经酰化为(s)-四氢呋喃-2-甲酰胺，再将脱水剂甲苯磺酰氯-吡啶替换成二氯亚砜-二甲基甲酰胺进行脱水，收率从73％提高至91％。cn201610000556x公开了以(s)-四氢呋喃甲酸为原料经氯化得到(s)-四氢呋喃甲酰氯，再与麦氏酸缩合，经水解得到目标产物(s)-四氢呋喃-2-乙酰基的方法。以上三种方法均采用手性化合物(s)-四氢呋喃-2-甲酰胺或(s)-四氢呋喃甲酸为原料，其中(s)-四氢呋喃-2-甲酰胺也可由(s)-四氢呋喃甲酸经酰化得到，因此(s)-四氢呋喃甲酸的制备方法对(s)-四氢呋喃-2-乙酰基的制备方法极其重要。
目前制备(s)-四氢呋喃-2-甲酸的方法主要是化学拆分法，如tetrahedron：asymmetry,1993,4(4),617-620和j.med.chem.1995,38,2830-2841报道的由消旋的四氢呋喃-2-乙醇经jones’试剂氧化得到消旋的四氢呋喃-2-甲酸，与番木鳖碱和(+)-麻黄碱反应得到非对映异构盐，经由重结晶可以得到(s)-四氢呋喃-2-甲酸和(r)-四氢呋喃-2-甲酸的方法。但是此方法需要多步重结晶，操作比较复杂。
因此，本领域迫切需要开发低成本、条件温和、高效、光学纯度高的(s)-四氢呋喃-2-甲酸制备方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种低成本、条件温和、高效、光学纯度高的(s)-四氢呋喃-2-甲酸制备方法。
本发明的第一方面，提供了一种制备(s)-四氢呋喃-2-甲酸的方法，所述方法包括步骤：
(a)在反应体系中，以化合物a为底物，在脂肪酶催化下，进行反应式i所示的立体异构催化反应，从而形成(s)-四氢呋喃-2-甲酸；
其中r为c1-c4烷基；和
(b)任选地从所述步骤(a)的反应后的反应体系中分离出(s)-四氢呋喃-2-甲酸。
在另一优选例中，所述步骤(a)的反应为水解反应。
在另一优选例中，所述r为甲基或乙基。
在另一优选例中，所述(s)-四氢呋喃-2-甲酸的ee值≥80％，较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％。
在另一优选例中，反应式i所示的反应的转化率≥40％(如40-60％)，更佳地≥45％，最佳地≥50％。
在另一优选例中，所述脂肪酶为酵母脂肪酶。
在另一优选例中，所述脂肪酶为假丝酵母脂肪酶。
在另一优选例中，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶。
在另一优选例中，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶b。
在另一优选例中，所述脂肪酶包括野生型或突变型脂肪酶。
在另一优选例中，所述脂肪酶选自下组：
(a)氨基酸序列如seqidno.:1所示的多肽；或
(b)将seqidno.:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a)所述多肽功能的由seqidno.:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的多肽功能指能够催化化合物a进行反应式i所示的立体异构催化反应，从而形成(s)-四氢呋喃-2-甲酸。
在另一优选例中，所述脂肪酶的氨基酸序列与seqidno.:1所示的序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。
在另一优选例中，所述脂肪酶为选自下组的形式：静息细胞、菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液、或其组合。
在另一优选例中，所述步骤(a)的反应体系中，所述脂肪酶的浓度为5-50μl/100ml。
在另一优选例中，所述步骤(a)的反应体系中，所述化合物a的浓度(如初始浓度)为43-430g/l。
在另一优选例中，所述步骤(a)的反应为连续反应或间歇式反应。
在另一优选例中，步骤(a)中，反应体系的ph为7.0-9.0，较佳地，7.5-9.0，更佳地，8.0-8.5。
在另一优选例中，步骤(a)中，反应温度10-40℃，较佳地，15-30℃，更佳地，15-25℃。
在另一优选例中，步骤(a)中，反应时间10-180min，较佳地，20-120min，更佳地，30-60min。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(a1)：
用化合物b与r-oh进行反应，得到化合物a，其中r为c1-c4烷基(优选为甲基或乙基)。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(a2)：将化合物c(较佳地为步骤(a)中未反应的化合物c)经消旋化得到化合物a，并以得到的化合物a进行反应式i所示的反应；
其中，r为c1-c4烷基(优选为甲基或乙基)。
本发明的第二方面，提供了一种脂肪酶的用途，用于制备一制剂，所述制剂用于催化反应式i所示的立体异构催化反应：
本发明的第三方面，提供了一种(s)-四氢呋喃-2-甲酸生产菌株，所述菌株表达多肽，所述多肽为外源的脂肪酶，并用于催化反应式i所示的立体异构催化反应：
在另一优选例中，所述生产菌株为大肠杆菌(优选为大肠杆菌bl21(de3))。
在另一优选例中，所述的大肠杆菌为导入了所述外源脂肪酶的表达盒的大肠杆菌。
本发明的第四方面，提供了一种生产(s)-四氢呋喃-2-甲酸的方法，所述方法包括步骤：
1)采用生产条件培养本发明第三方面所述的生产菌株，从而得到(s)-四氢呋喃-2-甲酸；和
2)任选地，从1)的培养体系中分离获得(s)-四氢呋喃-2-甲酸。
本发明的第五方面，提供了一种生产方法，所述方法包括步骤：
(a)利用本发明第一方面中所述的方法制备得到(s)-四氢呋喃-2-甲酸；和(b)利用所述的(s)-四氢呋喃-2-甲酸制备得到(s)-四氢呋喃-2-乙酰基。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(b1)用所述的(s)-四氢呋喃-2-甲酸和化合物d反应，得到化合物e；和
(b2)任选地在惰性溶剂中，用所述化合物e反应，得到(s)-四氢呋喃-2-乙酰基；
在另一优选例中，所述步骤(b2)中的反应体系中还包括甲基溴化镁。
在另一优选例中，所述惰性溶剂为四氢呋喃。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地发现一种低成本、高效、光学纯度高的(s)-四氢呋喃-2-甲酸制备方法。该方法利用脂肪酶(例如南极假丝酵母脂肪酶b(calb))，可以非常高效、高立体选择性(ee值≥98％)地制备得到(s)-四氢呋喃-2-甲酸。本发明方法不仅降低了成本，减少了精制工序，从而极大地提高转化效率(转化率可高达约48％或更高)和缩短反应时间降低生产成本，具有很大的经济价值。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，“c1-c4烷基”是指包括1、2、3或4个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或类似基团。
如本文所用，“ee值”或“对映体过量”用来表征手性分子中一个对映异构体相对于另一个对映异构体的过量值，通常用百分数表示。
脂肪酶
本文所用的术语“酶”、“多肽”、“本发明多肽”具有相同的意义，在本文可以互换使用，均是指本发明第一方面中所述的具有立体异构催化产生(s)-四氢呋喃-2-甲酸活性的蛋白。
在另一优选例中，所述脂肪酶为选自下组的形式：菌体、粗酶液、纯酶、粗酶粉、固定化酶、游离酶、发酵液、或其组合。
在另一优选例中，所述脂肪酶为酵母脂肪酶，较佳地，假丝酵母脂肪酶，更佳地，南极假丝酵母脂肪酶，最佳地，南极假丝酵母脂肪酶b。
在本发明的一个优选例中，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶b(calb)。
在具体的实施方式中，所述脂肪酶的氨基酸序列如seqidno.:1所示，编码该多肽的核酸序列如seqidno.:2所示。
脂肪酶的氨基酸序列：
脂肪酶的核酸编码序列：
在本发明中，所述脂肪酶包括与氨基酸序列seqidno.:1所示的多肽相比，有至多20个、较佳地至多10个，又佳地至多8个，再佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的突变体。这些保守性变异的突变体可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。
表a
本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是80％以上，优选90％以上，更优选95％-98％，最优选99％以上。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(computationalmolecularbiology)，lesk，a.m.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(biocomputing:informaticsandgenomeprojects)，smith，d.w.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(computeranalysisofsequencedata)，第一部分，griffin，a.m.和griffin，h.g.编，humanapress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(sequenceanalysisinmolecularbiology)，vonheinje，g.，学术出版社，1987和序列分析引物(sequenceanalysisprimer)，gribskov，m.与devereux，j.编mstocktonpress，纽约，1991和carillo，h.与lipman，d.，siamj.appliedmath.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：gcg程序包(devereux，j.等，1984)、blastp、blastn和fasta(altschul，s，f.等，1990)。公众可从ncbi和其它来源得到blastx程序(blast手册，altschul，s.等，ncbinlmnihbethesda，md.20894；altschul，s.等，1990)。熟知的smithwaterman算法也可用于测定相同性。
本发明的主要优点：
本发明提供了一种能够高效、低成本、高立体异构的(s)-四氢呋喃-2-甲酸制备方法，反应转化率可高达48％或更高，ee值≥98％，极大地提高转化效率和ee值，减少了精制工序，缩短反应时间，降低生产成本。
本发明的方法转化率高、成本低、收率高、生产周期短、工艺简单、易于放大、适合进行大生产，获得的(s)-四氢呋喃-2-甲酸ee值极高。在(s)-四氢呋喃-2-甲酸以及以(s)-四氢呋喃-2-甲酸为前体的下游产物的生产中具有极大的应用前景和经济价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明所用试剂和原料均市售可得。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。
实施例1.2-四氢呋喃甲酸甲酯的制备
三口瓶中加入2-四氢呋喃甲酸10.0g，浓硫酸0.1g，无水甲醇30ml，加热回流，反应16小时，gc监测反应完全。加入0.1g碳酸钠，ph＝4.60，搅拌10min，ph不变，继续加碳酸钠，ph最高达到5.80.过滤，滤液旋干，得2-四氢呋喃甲酸甲酯11.2g，为黄色液体。
实施例2.2-四氢呋喃甲酸乙酯的制备
三口瓶中加入2-四氢呋喃甲酸10.0g，浓硫酸0.1g，无水乙醇30ml，加热回流，反应16小时，gc监测反应完全。加入0.1g碳酸钠，ph＝4.60，搅拌10分钟，ph不变，继续加碳酸钠，ph最高达到5.80.过滤，滤液旋干，得2-四氢呋喃甲酸乙酯12.4g，为黄色液体。
实施例3.酶催化制备(s)-2-四氢呋喃甲酸
3.1反应体系中，加入9g实施例1所得2-四氢呋喃甲酸甲酯，10ul南极假丝酵母脂肪酶b，100ml磷酸盐缓冲液ph＝8，20℃反应40min，gc检测转化率，mtbe萃取出未反应的原料，水相调到ph＝2，mtbe萃取出产品，旋蒸，脱溶剂，得到产品。检测结果如表1。
3.2反应体系中，加入9g实施例1所得2-四氢呋喃甲酸甲酯，10ul蜂蜜曲霉蛋白酶(来源于nagasechemtex公司,preteasexp-488)，100ml磷酸盐缓冲液ph＝8，20℃反应40min，gc检测转化率，mtbe萃取出未反应的原料，水相调到ph＝2，mtbe萃取出产品，旋蒸，脱溶剂，得到产品。检测结果如表1。
3.3反应体系中，加入9g实施例1所得2-四氢呋喃甲酸甲酯，10ul猪胰腺脂肪酶(来源于sigma公司)，100ml磷酸盐缓冲液ph＝8，20℃反应40min，gc检测转化率，mtbe萃取出未反应的原料，水相调到ph＝2，mtbe萃取出产品，旋蒸，脱溶剂，得到产品。检测结果如表1。
3.4反应体系中，加入9g实施例2所得2-四氢呋喃甲酸乙酯，10ul南极假丝酵母脂肪酶b，100ml磷酸盐缓冲液ph＝8，20℃反应40min，gc检测转化率，mtbe萃取出未反应的原料，水相调到ph＝2，mtbe萃取出产品，旋蒸，脱溶剂，得到产品。检测结果如表1。
3.5反应体系中，加入9g实施例2所得2-四氢呋喃甲酸乙酯，10ul蜂蜜曲霉蛋白酶，100ml磷酸盐缓冲液ph＝8，20℃反应40min，gc检测转化率，mtbe萃取出未反应的原料，水相调到ph＝2，mtbe萃取出产品，旋蒸，脱溶剂，得到产品。检测结果如表1。
3.6反应体系中，加入9g实施例2所得2-四氢呋喃甲酸乙酯，10ul猪胰腺脂肪酶，100ml磷酸盐缓冲液ph＝8，20℃反应40min，gc检测转化率，mtbe萃取出未反应的原料，水相调到ph＝2，mtbe萃取出产品，旋蒸，脱溶剂，得到产品。检测结果如表1。
如表1所示，与实施例3.2、3.3、3.5、3.6中的方法相比，采用南极假丝酵母脂肪酶b(calb)催化制备(s)-四氢呋喃-2-甲酸的效果最好，得到的(s)-2-四氢呋喃甲酸光学纯度高(ee值可高达98％或更高)，且转化率为46％或更高。本发明利用脂肪酶(例如南极假丝酵母脂肪酶b(calb))，可以非常高效、高立体选择性地制备得到(s)-四氢呋喃-2-甲酸。不仅降低了成本，减少了精制工序，从而极大地提高转化效率和缩短反应时间降低生产成本，具有很大的经济价值。
表1:(s)-四氢呋喃-2-甲酸的制备
实施例4.(r)-2-四氢呋喃甲酸乙酯的消旋化
实施例3.5中未反应原料的mtbe相，减压浓缩干，加入乙醇钠，乙醇，加热回流，16小时后，浓缩反应液，加入ea和h2o，溶液分层，取有机相，mgso4干燥，浓缩得消旋体2-四氢呋喃甲酸乙酯。将消旋体2-四氢呋喃甲酸乙酯加入实施例3.4循环使用。
实施例5.(s)-n-甲氧基-n-甲基四氢呋喃-2-酰胺的制备
反应容器中，加入100ml二氯甲烷，实施例3.4得到的(s)-四氢呋喃-2-甲酸4.0g，控制温度0℃，再加入5ml三乙胺，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐9.9g，n,o-二甲基羟胺盐酸盐3.4g，4-二甲氨基吡啶0.04g。反应混合物室温搅拌过夜，并随后用1mhcl和1mnaoh洗涤，有机相mgso4干燥，真空浓缩得到(s)-n-甲氧基-n-甲基四氢呋喃-2-酰胺。
实施例6.(s)-四氢呋喃-2-乙酰基的制备
反应容器中，加入四氢呋喃50ml，实施例5得到的(s)-n-甲氧基-n-甲基四氢呋喃-2-酰胺4.0g，控制温度0℃，加入甲基溴化镁8.8ml(3m的四氢呋喃溶液)，反应混合物-78℃搅拌1h，随后用饱和nh4cl溶液猝灭，加入乙酸乙酯并分离有机相，进一步用饱和nh4cl溶液洗涤，mgso4干燥，真空浓缩得到(s)-四氢呋喃-2-乙酰基。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海弈柯莱生物医药科技有限公司
<120>四氢呋喃-2-甲酸的制备方法
<130>p2017-1659
<160>2
<170>patentinversion3.5
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<211>327
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<213>南极假丝酵母(candidaantarctica)
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