本发明属于水稻基因工程领域，具体涉及一种水稻穗顶退化相关蛋白，以及该蛋白质的编码基因。
背景技术：
：穗顶退化是指水稻在孕穗期穗发育过程中顶部颖花发育停滞，逐渐衰退的现象。穗顶部退化现象在水稻中时有发生，发生时穗顶部颖花及一次枝梗顶部颖花呈现发育停滞，过度衰退，这就造成穗子大小和穗粒数大幅度下降，导致单穗实粒数降低，严重影响水稻的总产量。穗顶部退化现象易受穗分化期间温度、湿度等环境条件的影响，在研究过程中表型鉴定困难或不稳定，因而增加了研究难度。目前引起该现象的原因还不是很清楚，因此在实际生产中难以控制，是水稻生产中亟待解决的问题。选育抗穗顶退化品种是控制水稻穗顶退化最经济有效的方法，但是由于对水稻穗退化的致病机理尚不清楚，且关于控制穗顶退化表型的基因的报道极少，更主要的是水稻穗退化抗源材料少，造成选育抗穗顶退化品种比较困难。目前关于穗退化的基因的报道主要集中在qtl位点：在第1、10和11染色体上发现了开花前水稻穗基部小花败育的3个主效qtl(yamagishij等.theoreticalandappliedgenetics，2004，109(8)：1555-1561)；调控花序结构内枝梗及穗长度相关基因sp1(lis等.theplantjournal，2009，58(4)：592-605)；在日本晴和9311代换系群体中检测到5个穗顶退化qtl位点，分别位于第1、2、4、7和9号染色体上，其中第9染色体的ds-9位点对水稻穗顶退化的效应相对较大(徐华山等.作物学报，2007，33(6)：979-986)；位于3号染色体的qtl同位于第9染色体的qtl存在上位性互作(tanc等.plantbreeding，2011,130：177-184)。另外关于穗顶退化图位克隆报道的基因不多：spd-hp73(任三娟等.浙江大学学报，2013，39(3)：267-273)。目前被克隆的关于水稻穗顶退化性状的基因很少，已报道的多数为qtl位点，难以在水稻育种实践中应用。技术实现要素：本发明人在对籼稻品种宜香1b进行ems(甲基磺酸乙酯)诱变时，意外发现一个籼稻背景的穗顶退化突变体材料，命名为paa74，经研究发现该水稻穗顶退化性状由单隐性基因控制；进一步研究发现，野生型基因发生点突变后会导致水稻穗顶部颖花发生明显的退化衰退现象。本发明是在上述意外发现的基础上完成的。本发明目的在于提供一种控制水稻穗顶退化相关蛋白。本发明另一目的在于提供编码上述相关蛋白的基因。本发明第三目的在于提供含有上述基因的表达载体。本发明第四目的在于提供上述蛋白在控制水稻穗顶退化性状上的用途。本发明第五目的在于提供上述基因在控制水稻穗顶退化性状上的用途。本发明第六目的在于提供用于敲除上述基因的靶标序列。本发明第七目的在于提供一种水稻穗顶退化基因。本发明第八目的在于提供用于检测水稻穗顶退化材料的分子标记。本发明第九目的在于提供利用上述分子标记检测水稻穗顶退化材料的方法。本发明第八目的在于提供利用上述基因改良穗顶退化水稻品种的方法。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种控制水稻穗顶退化相关蛋白，命名为paa74，所述的蛋白由seqidno.1所示的氨基酸序列组成。本发明还提供了编码上述相关蛋白的基因，命名为ospaa74，所述的基因由seqidno.2所示的核苷酸序列组成。含有上述基因的表达载体。上述蛋白在控制水稻穗顶退化性状上的应用。上述基因在控制水稻穗顶退化性状上的应用。用于敲除上述基因的靶标序列，由seqidno.7所示的核苷酸序列组成。用于敲除上述基因的sgrna，其靶标序列由seqidno.7所示的核苷酸序列组成。本发明还提供了一种水稻穗顶退化基因，所述的水稻穗顶退化基因通过对上述基因进行基因编辑获得，所述的基因编辑是通过crispr/cas9系统进行的。上述水稻穗顶退化基因，所述的基因由seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5或seqidno.6所示的核苷酸序列组成。本发明还提供了利用上述基因改良穗顶退化水稻品种的方法，包括通过转基因方法将上述基因转化到穗顶退化的水稻品种中。本发明具有的优点或技术效果：(1)本发明发现了一个新的控制水稻穗顶退化的基因，为研究籼稻穗顶退化的原因并为最终解决籼稻品种穗顶退化问题提供了一种新的途径。(2)本发明穗顶退化性状由单隐形基因控制，转基因或杂交后代鉴定和选择比较简单，便于应用。(3)本发明分子标记为鉴定水稻育种后代中带有穗顶退化基因的材料提供了一种重要手段。附图说明图1为抽穗期宜香1b和paa74植株对比照片；其中1为宜香1b；2为paa74。图2为抽穗期宜香1b和paa74穗部对比照片；其中1为宜香1b；2为paa74。图3为宜香1b和paa74主穗长柱形图；其中1为宜香1b，2为paa74。图4为宜香1b和paa74单穗实粒数柱形图；其中1为宜香1b，2为paa74。图5为宜香1b和paa74单穗退化率柱形图；其中1为宜香1b，2为paa74。图6为台酚蓝和伊文斯蓝颖花染色照片；其中1为台酚蓝染色的宜香1b，2为台酚蓝染色的paa74；3为伊文斯蓝染色的宜香1b，4为伊文斯蓝染色的paa74。图7为dab染色照片；其中1为宜香1b的孕穗前期幼穗，2为宜香1b的孕穗后期穗，3为paa74的孕穗前期幼穗，4为paa74的孕穗后期穗。图8为在paa74与02428(粳稻)杂交构建的f2群体中筛选第2号染色体上连锁分子标记的电泳图谱；其中泳道1是显性池，泳道2是隐性池，使用分子标记是rm6；泳道3是显性池，泳道4是隐性池，使用分子标记是rm263；泳道5是显性池，泳道6是隐性池，使用分子标记是rm3763。图9为基因定位时其中一个连锁标记的部分电泳图谱；其中1为paa74，2为02428(粳稻)，泳道3-14、16、18、20-24为隐性单株带型；泳道15、17、19为单交换带型。图10为敲除株系的植株照片；其中1为宜香1b，2为paa74，3、4、5分别为独立转基因阳性株系ko74-2、ko74-15和ko74-21。图11为敲除株系的穗部退化表型照片；其中1为宜香1b，2为paa74，3、4、5分别为独立转基因阳性株系ko74-2、ko74-15和ko74-21。图12为敲除株系的穗顶部退化率统计柱形图；其中1为宜香1b，2为paa74，3、4、5分别为独立转基因阳性株系ko74-2、ko74-15和ko74-21。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步的解释和说明，但本发明不限于此。如无特别说明，以下实施例中所用的方法，均为常规方法；实施例中所用的化学试剂均为常规试剂。以下实施例中所涉及的穗顶退化突变体paa74，宜香1b(籼稻)和02428(粳稻)等材料均来自于四川农业大学水稻研究所杂种优势利用实验室。其中穗顶退化突变体paa74是从以宜香1b所构建ems(甲基磺酸乙酯)诱变库中筛选获得，该突变体表型为穗顶部颖花发生退化萎焉，退化现象出现在幼穗孕穗期一直到抽穗期。经在四川温江和海南陵水与宜香1b进行多代回交后发现，该穗退化表型能稳定遗传。实施例1本发明突变体paa74穗顶退化性状的分离与遗传分析试验按照如下方法进行：将穗顶退化突变体paa74和宜香1b种在四川农业大学水稻研究所温江试验田。以paa74与宜香1b为亲本杂交，构建f2群体；分别观测亲本、f1和f2群体的穗部表型，并统计paa74与宜香1b杂交后的f1和f2群体的分离比。(1)穗顶退化表型分析：与野生型宜香1b相比，突变体paa74从孕穗期幼穗开始出现有顶部退化现象，在这之前无论是顶端分生组织原基还是枝梗原基以及小穗原基，野生型宜香1b与突变体paa74的穗部发育无差异。随着穗的发育逐步成熟，paa74的穗顶部退化现象趋于严重(见图1～图5)。(2)遗传分析：f1代具有正常的穗部表型和生育期；经卡方检验，f2代中的野生型和穗顶退化表型的分离比符合孟德尔单基因隐性性状3:1的分离比(见表1)，说明突变体paa74的穗顶退化性状受单隐性核基因控制。表1突变体paa74的穗顶部退化性状遗传分析结果组合世代总株数穗顶部退化株数分离比卡方检验paa74/宜香1bf25001302.85：1χ2(3：1)＝0.583注：χ20.05，1＝3.36实施例2本发明突变体paa74穗顶退化部分细胞活性鉴定对比试验(一)利用台盼蓝染色检测突变体paa74退化穗部的细胞活性(1)、台盼蓝染液制备：在每1ml乳酚溶液中加入2.5mg台盼蓝配制而成；其中乳酚溶液的组成成分及其体积比为：乳酚25％，水溶苯酚23％，甘油25％和无菌水27％。配制好的台盼蓝染液需在避光低温条件下保存。台盼蓝是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性，检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色.(2)、将生长于人工气候室中处于抽穗期的突变体paa74的穗顶退化穗以及宜香1b的同时期正常穗在煮沸的台盼蓝染液中染色10min，将穗取出在室温下放置12h，接着在浓度为2.5mg/ml的水合氯醛溶液中脱色3-4天，再用体视显微镜观察穗中的细胞死亡情况并拍照。结果宜香1b几乎没有被染色(见图6-1)，而突变体paa74的退化颖花被染成深蓝色(见图6-2)，说明paa74的退化穗部细胞程序性死亡。(二)利用伊文斯蓝染色检测突变体paa74退化穗部的细胞活性将生长于人工气候室中处于抽穗期的突变体paa74的穗顶退化穗以及宜香1b的同时期正常穗浸泡在0.25％(w/v)的伊文思蓝溶液中24h，随后取出穗，用水彻底清洗表面的蓝色染液，吸去表面水分后放入煮沸的脱色液(脱色液组成为无水乙醇：甘油＝9：1)中30min，除去叶绿素至颖壳底色接近白色。将脱色后的宜香1b、paa74的颖花分别在体式显微镜下观察，拍照。结果宜香1b的颖花基本无染色(见图6-3)，而突变体paa74的退化颖花被染成深蓝色(见图6-4)，说明突变体paa74的退化穗部细胞程序性死亡。(三)利用dab染色检测突变体paa74穗部细胞产生的过氧化氢积累量试验。(1)dab工作液制备：按照da1010dab显色试剂盒(20×)solarbio(北京索莱宝科技有限公司)的产品说明书制备dab工作液。(2)将宜香1b和paa74的孕穗前期幼穗和孕穗后期的穗浸泡在dab工作液中，室温下避光孵育3-10分钟，直至显色至预期深浅；去除dab染色工作液，用蒸馏水洗涤2-3次后终止反应。用体视镜观察显色情况并拍照。结果(见图7)与野生型宜香1b相比，无论是孕穗前期的幼穗还是孕穗后期的穗，突变体paa74穗的过氧化氢积累量均高于野生型宜香1b，说明穗顶退化表型的出现可能与过氧化物的积累有关。实施例3本发明paa74穗顶退化性状候选基因的定位(1)基因定位群体的构建和基因组dna提取以突变体paa74与02428(粳稻)为亲本杂交，得f1代；f1代自交得f2代。从f2群体中，挑选具有明显穗顶退化表型的单株叶片200个(隐单)和正常穗表型的叶片10个(显单)，分别挑选10个叶片，等量混合，采用改良ctab法提取叶片dna，构建隐池和显池两个子代池，用于突变体paa74和02428基因组之间的多态性检测以及初步定位引物筛选。(2)paa74与02428亲本间多态性引物的筛选分别以paa74或02428的基因组dna为模板，利用平均分布于水稻12条染色体上的543对ssr引物(引物序列见http://www.gramene.org/bd/markers)进行pcr扩增，其中pcr反应体系(20ul)为：tap酶(5u/μl)0.2ul，引物(10mmol/l)2ul，dntp(2.5mmol/l)2ul，dna模板(20-100ng/μl)2ul，10×buffer(25mm)2ul，ddh2o11.8ul。pcr反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃7min，12℃5min。所得扩增产物在恒压180-200v条件下在3.0％的琼脂糖凝胶上电泳0.5h-1h，用凝胶成像系统成像并保存记录。结果筛选出突变体paa74与02428基因组之间具有多态性的引物102对。(3)随后用筛选出的多态性引物检测(1)中构建的子代混池，以及用突变体paa74与02428构建的f2群体中的隐性单株，进行基因初步定位；连锁图谱的构建:将带型为突变体paa74的单株标记为0，带型为杂合的单株记为1，带型为02428的单株记为2，未出带的单株记为3；用mapmarker3.0软件对f2分离群体中分子标记和突变性状的分离数据进行连锁分析，再将重组值转化为遗传图距(centmorgan,cm)。(4)候选基因初定位结果利用(2)中筛选的102对多态性引物在f2群体中200个隐性单株进行筛选，结果(见图8和图9)发现第2号染色体的长臂端两个ssr标记rm3763和rm1385均与候选基因有连锁关系。(5)全基因组重测序分析snp位点(bsa法)将突变体paa74与宜香1b杂交，f1代自交，从f2代中取25个有显著突变表型的植株叶片，等量混合构成隐性子代池提取dna，连同宜香1b的dna送诺禾致源生物科技有限公司重测序。待文库构建完毕并质检合格后进行illuminahiseqtmpe150测序。将最终得到的测序数据连同参考基因组(9311基因组作参考，下载地址ftp：//ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-26/fasta/oryza_indica/dna/)进行比对，利用生物信息学分析存在的snp差异，明确候选基因。经比对发现16个候选位点，符合位于外显子区的非同义突变且snp-index值>80％，再结合之前的初定位区间分析得出，有且仅有一个snp候选位点处在rm3763和rm1385之间。该位点位于27392625，属于loc_os02g45160，野生型宜香1b的碱基为g(见seqidno.2)，而突变体paa74变为了a(见seqidno.6)，将该基因命名为osppa74。实施例4候选基因ospaa74的敲除验证试验本试验所用大肠杆菌dh5α和农杆菌eha105菌株购自于全式金生物技术有限公司。1、crispr/cas9-ospaa74基因敲除载体构建以野生型宜香1b中ospaa74(loc_os02g45160)基因的核苷酸序列为模板，选择合适的区域，设计1个敲除的靶位点，利用bwa(v)h-cas9载体参照试剂盒(杭州百格生物公司)构建crispr/cas9-ospaa74载体。具体构建流程如下：(1)设计用于敲除目的基因的靶标序列：5’-aggcccgtgtacgacggcgt-3’(seqidno.7)。(2)、根据靶标序列，设计并合成下述接头引物以形成grna靶点序列：f1:5’-cagtggtctcaggcaggcccgtgtacgacggcgt-3’，r1:5’-cagtggtctcaaaacacgccgtcgtacacgggcc-3’。(3)、制备引物二聚体将步骤(2)合成的接头引物对加水溶解至10μm，按下列反应体系混合后，在pcr仪95℃加热3分钟，然后以0.2℃/秒缓慢降至20℃，得引物二聚体。所述的反应体系为：退火buffer18ul,grna靶点引物各1ul，加ddh2o,补足至20ul。(4)、将(3)中所得的引物二聚体构建至bwa(v)h载体。按下列反应体系在冰上混合各个组分，混匀后20℃反应1小时后转化大肠杆菌备用，获得包含启动子、靶序列、grna等元件的基因敲除表达载体，命名为crispr/cas9-ospaa74。所述的反应体系：bwa(v)h载体2ul，oligo二聚体1ul，酶混合液1ul，加ddh2o,补足至10ul。2大肠杆菌转化(1)、从-80℃冰箱中取出一管制备好的大肠杆菌感受态细胞，置于冰上融化；(2)、每100ng连接产物crispr/cas9-ospaa74加入100μl感受态细胞悬浮液，混匀后在冰上放置30min；(3)、42℃热激30s，迅速取出立即置于冰上2min；(4)、加入500μl不含抗生素的lb液体培养基，37℃、200rpm培养1小时左右活化菌液；(5)、将活化的菌液以5000rpm离心1min，在无菌条件下倒掉大部分上清夜，用移液枪轻轻吸打混匀沉淀，吸取100μl，在超净台上把菌液转移并涂到含有卡那霉素的lb筛选平板上；(6)、将涂有菌液的lb固体培养基平板正面向上放置10分钟左右，待菌液完全被lb固体培养基吸收后将涂板的培养基倒置，于恒温箱中37℃过夜培养；(7)、挑取单菌落，以p45160-1f和p45160-1r为引物对菌液进行pcr检测。所述的p45160-1f和p45160-1r为：p45160-1f:5’-ggcccgtgtacgacggcgt-3’，p45160-1r:5’-atacgaagttatgactgcgaccga-3’。其中pcr反应程序：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，12℃1min。(8)、将(7)检测所得的阳性克隆加入3ml含有卡那霉素(50mg/l)的lb培养液中，置于摇床上在37℃、200rpm下培养约10h，保存菌液并提取质粒。3、按照omegaplasmidextractionkit产品说明书提取大肠杆菌质粒，将提取的质粒dna收集到干净的离心管中，-20℃保存。4、质粒序列的测定和序列分析将阳性克隆质粒送到成都擎科科技股份有限公司进行测序。用dnaman软件对测序结果进行序列比对，确证grna序列的正确性，得crispr/cas9-ospaa74质粒。5、农杆菌转化(1)农杆菌化学转化法按照一个质粒：50ul感受态细胞从-80℃拿出来时快速放手心化冻；将构建好的crispr/cas9-ospaa74质粒0.4～1ug加入到50ul感受态细胞中，冰上放置30分钟；液氮中冷冻2分钟；37℃水浴2min,溶化细胞；立即加入5倍体积的无抗生素lb液体培养基，在28℃、170rpm下摇床培养2～3hr；7000rpm离心2分钟，在100ullb液体培养基中悬浮细胞；涂在利福平加卡那抗性板，吹干，28℃培养2-3天；用潮霉素分子标记p9150-1引物进行菌液pcr检测，将能扩增出目的条带的阳性农杆菌单克隆，加入甘油作为保护剂后置于-80℃保存备用。(2)农杆菌浸染法转化水稻(a)愈伤组织的诱导：先用75％酒精将日本晴种子消毒1分钟，用无菌水漂洗3次，再用40％的次氯酸钠漂洗30分钟，再用无菌水冲洗5次，放置于带滤纸的培养皿中滤干，用镊子接种于nmb培养基上，于28℃、光照条件下培养7天。每7天继代一次。继代2～3次后，挑取从种子上生长出的良好愈伤组织，把它们继代于nmb培养基上，28℃、黑暗条件下培养4天。(b)农杆菌菌株的活化：将(1)中-80℃保存的30ul农杆菌加入3ml含有利福平和卡那霉素的yep液体培养基中，于28℃下振荡培养14h；再取其中1ml于含有利福平和卡那霉素的50mlyep液体培养基中，28℃再振荡培养4h，得活化的农杆菌菌液。(c)共培养转化：将(b)活化好的农杆菌菌液在5000rpm下离心收集菌体，用含有100μm/l乙酰丁香酮的aam液体培养基30ml重悬菌体，将(a)中预先挑好的愈伤组织浸于农杆菌菌液中20min，吸去多余的菌液，平铺于共培养固体培养基上，28℃暗培养2d。(d)愈伤脱菌培养与愈伤抗性筛选：将共培养2d后的愈伤组织用无菌水冲洗至水澄清，然后用含头孢霉素(500mg/l)的无菌水振荡30min杀菌，将愈伤组织用无菌滤纸或吸水纸彻底吸干，然后接种于选择培养基上培养3周左右。(e)转基因植株的分化与生根：将(d)中新长出的抗性愈伤组织接种到分化培养基上，光照培养1～2个月，然后将长出的3cm左右高的幼苗转到生根培养基上进行生根培养，当苗长至约10cm时，取叶片提取dna，利用扩增目的基因全长dna的p45160-2引物进行鉴定阳性植株苗，最终获得3株转基因阳性植株，分别命名为ko74-2、ko74-15和ko74-21。(f)将阳性转基因植株室内炼苗2-3天后，移栽于大田。6、转基因水稻的检测(1)应用改进的ctab法提取阳性转基因水稻dna，以p45160-2引物对为引物对转基因植株中的敲除靶基因的部分序列进行pcr扩增，得pcr扩增产物。所述的p45160-2引物对为：p45160-2f：5'-aaagcaacgagagcagag-3'，p45160-2r：5'-acgaaacgagcctaacaa-3'；其中pcr反应体系(25ul)：tap酶(5u/μl)0.5ul，primer(10mmol/l)2ul，dntp(2.5mmol/l)0.5ul，dna(20-100ng/μl)2ul，2×buffer(25mm)12.5ul，ddh2o7.5ul。pcr反应程序为：95℃5min；95℃30s，56℃5s，72℃1min，30个循环；72℃10min，12℃1min。(2)pcr产物的回收和测序按照omegagelextractionkit产品说明书中回收目的dna片段，取2μl胶回收产物置于1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，检测后送成都擎科科技股份有限公司测序。结果3个独立转基因阳性株系叶片均表现为穗顶退化(见图10和图11)，转基因阳性株系与突变体paa74的退化率一致(见图12)。与阴性对照基因序列相比发现，它们均在cds编码区发生了突变，有核苷酸的插入或替换(见seqidno.3～5)。上述敲除试验结果证明了ospaa74是控制穗顶退化性状的基因。序列表<110>四川农业大学<120>一种水稻穗顶退化相关蛋白及其编码基因<141>2017-12-04<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>511<212>prt<213>oryzasativa<400>1argileglualatyrasnargaspproserglyvalcysserglyala151015argvalprovalalailesermetaspalaalaalaargglualagln202530valglnglyserleuglutrpargvalthrvalprogluglyserser354045valthrvalgluhisglualaglyvalalagluargalatrpalatrp505560valvalargmetleuvalalavalargalaalavalalaglypheala65707580arglysvaltrplysileglyalaaspaspproargargalavalhis859095serleulysvalglyleualaleuthrleuvalserilevaltyrtyr100105110thrargprovaltyraspglyvalglyglyasnalamettrpalaval115120125metthrvalvalvalvalpheglutyrthrvalglyglycysmettyr130135140lysglypheasnargalavalalathralaseralaglyleuleuala145150155160leuglyvalasntrpvalalaasplysserglyasplysleuglupro165170175pheileleuserglyserleupheleuleualaalaalaalathrphe180185190serargpheileprothrvallysalaargpheasptyrglyvalthr195200205ilepheileleuthrpheserleuvalalavalserglytyrargval210215220aspglnleuleuaspleualaglnglnargmetserthrileglyile225230235240glyilevalilecysleualavalcysvalvaliletrpprovaltrp245250255alaglyglngluleuhisleuleuthrvalargasnmetglulysleu260265270alaglyalavalgluglycysvalgluasptyrphealaalalyspro275280285alaalaalalyssergluglytyrlyscysvalleuasnserlysala290295300sergluaspserglnalaasnleualaargtrpgluproprohisgly305310315320argpheglyphearghisprotyralaglntyrthrlysvalglyala325330335alametarghiscysalatyrcysvalglualaleuasnsercysval340345350argalagluvalglnalaprogluhisvallysargleuleuglyasp355360365valcysthrargleualaserglncysalaargvalleuarggluala370375380serthrservalalaalametthrserprolysthrleuasppheala385390395400valalaaspmetasnthralavalhisgluleuglnglyaspleuarg405410415alaleuproprovalleualaleugluproalaalaglumetserleu420425430metaspalametproleuphethrvalalaserleuleuilegluile435440445seralaargilegluglyvalvalaspalavalgluthrleualaser450455460leualaserphelysglnvalgluaspaspaspasplyslysglygln465470475480thrglumetlysvalhisproleuasnvalproaspasphisaspala485490495serthrhisgluserglnthrthrthrlyshisprogluglnval500505510<210>2<211>1533<212>dna<213>oryzasativa<400>2agaatcgaggcttacaatagggacccatctggtgtgtgcagcggcgctcgtgtaccggtc60gccatcagcatggacgccgccgcgagggaagcgcaggtgcagggcagtctggaatggcgg120gtgacggtgccggagggctcgtcggtgacggtggagcacgaggccggcgtcgccgagagg180gcgtgggcgtgggtggtgaggatgctggtcgcggtcagggcggcggtggccggcttcgcc240aggaaggtgtggaagatcggcgccgacgatccccggagagcggtgcacagcctcaaagtc300ggcctggctctcaccctcgtctccatcgtctactacaccaggcccgtgtacgacggcgtc360ggcggcaatgccatgtgggccgtcatgacggttgtcgtggtcttcgagtacaccgtcggt420ggatgcatgtacaagggattcaacagagccgtcgcgacggcgagcgccgggctgctcgcg480ctcggcgtgaactgggtggcggacaaatccggcgacaagctcgagccgttcatcctcagc540ggctccctgtttttactggctgcggcggccaccttctcgcggttcataccaacggtgaag600gcgcggttcgactacggcgtgaccatcttcatcctgacgttcagcctcgtcgccgtgtcg660gggtaccgcgtcgaccagctgctggacctggcgcagcagcggatgtccaccatcggcatc720ggcatcgtcatctgcctcgccgtctgcgtcgtcatctggccggtgtgggccggccaggag780ctgcacctcctcacggtgcgcaacatggagaagctcgccggcgccgtcgagggctgcgtc840gaggactacttcgcggcgaagcccgccgcggccaagtcggaggggtacaagtgcgtgctc900aactccaaggcgtcggaggactcgcaggccaacctggcgcggtgggagccgccgcacggg960cggttcggcttccgccacccgtacgcgcagtacaccaaggtgggcgccgcgatgcgccac1020tgcgcgtactgcgtcgaggcgctcaacagctgcgtccgcgccgaggtccaggcgcccgag1080cacgtcaagcggctgctcggcgacgtgtgcacgcggctggcctcgcagtgcgcgcgggtt1140ctcagggaggcgtccacctcggtcgccgccatgaccagccccaagacgctggacttcgcc1200gtggcggacatgaacacggccgtgcacgagcttcagggcgacctgcgcgcgctcccgccc1260gtcctggccttggaaccggcggcggagatgtcgctgatggacgcgatgccgctcttcacc1320gtggcgtcgctgctgatagagatatcggcgaggatcgagggcgtcgtcgacgccgtcgag1380acgctggccagcctcgccagcttcaagcaggtggaggatgatgacgacaagaagggacaa1440accgagatgaaagtgcacccgctgaacgtgccggatgatcacgacgcgtcgacacatgaa1500agccagactacaacgaagcaccctgaacaggtc1533<210>3<211>1350<212>dna<213>artificialsequence<220><221>mutation<222>(287)..(288)<223>敲除株系ko74-2中ospaa74基因序列<400>3atgtatagggctaagagggctgcattatctccaaaggtgaagcgccgtgtagggaagtat60gagctcgggcgcaccattggagaaggaacctttgcaaaggtccggtttgcgaagaacact120gaaaatgacgaaccagttgctatcaaaatccttgacaaggagaaggttcagaagcacaga180ttggttgaacagattaggcgtgaaatttgtactatgaagttagtaaagcatcctaatgtt240gttcggctgttcgaggtcatgggaagtaaagcaagaattttcattgttctggaatatgtt300actggaggagagctctttgaaatcattgcggccaatgacagatgatggaaggaggaggaa360gcacgaaaatactttcaacaacttatcaatgcagttgactactgccacagtaggggtgtg420taccacagagacttgaagttagaaaatttgctgcttgatgcttctggaaacctgaaagta480tctgactttggtttgagtgctttaaccgagcaagtgaaggctgacggtttgctgcacacg540acatgtggaactcctaattatgttgctccagaggtgattgaggacagaggctatgatggg600gcagctgcagatatctggtcttgtggggtaatcctttatgttctgcttgctgggttttta660ccatttgaggatgacaacatcattgctctttataaaaagatctctgaagctcagtttacc720tgtccctcttggttttctactggagctaagaagctgatcaccagaattctggatcccaac780cctacaactaggatcaccatttctcaaatactggaagatccttggttcaaaaagggttac840aaaccgcctgtatttgacgagaaatatgaaactagttttgacgatgtcgatgctgctttt900ggagactccgaagaccggcatgtcaaagaagaaactgaagatcagcctacctctatgaac960gcgtttgaactcatttcactgaatcaggcactgaatctggacaatttgttcgaggcaaaa1020aaggagtataaaagagagacaagattcacatcacaatgtcctccaaaagaaattatcacc1080aagattgaagaagctgcaaagccacttggatttgatattcaaaagaaaaattacaagatg1140cgcatggagaacctgaaagcaggtagaaaaggcaatctcaatgttgcaactgaggttttc1200caagtagctccatccttacatgtggttgagctcaagaaggcaaagggggacactctggag1260ttccaaaagttctacagaaccctgtcgacccagctcaaggacgtggtctggaagtgcgac1320ggcgaggtcgaaggcaacggcgccgcggcg1350<210>4<211>1465<212>dna<213>artificialsequence<220><221>mutation<222>(285)..(286)<223>敲除株系ko74-15的ospaa74基因序列<400>4atggacgccgccgcgagggaagcgcaggtgcagggcagtctggaatggcgggtgacggtg60ccggagggctcgtcggtgacggtggagcacgaggccggcgtcgccgagagggcgtgggcg120tgggtggtgaggatgctggtcgcggtcagggcggcggtggccggcttcgccaggaaggtg180tggaagatcggcgccgacgatccccggagagcggtgcacagcctcaaagtcggcctggct240ctcaccctcgtctccatcgtctactacaccaggcccgtgttcgacgggcgtcggcggcaa300tgccatgtgggccgtcatgacggttgtcgtggtcttcgagtacaccgtcggtggatgcat360gtacaagggattcaacagagccgtcgcgacggcgagcgccgggctgctcgcgctcggcgt420gaactgggtggcggacaaatccggcgacaagctcgagccgttcatcctcagcggctccct480gtttttactggctgcggcggccaccttctcgcggttcataccaacggtgaaggcgcggtt540cgactacggcgtgaccatcttcatcctgacgttcagcctcgtcgccgtgtcggggtaccg600cgtcgaccagctgctggacctggcgcagcagcggatgtccaccatcggcatcggcatcgt660catctgcctcgccgtctgcgtcgtcatctggccggtgtgggccggccaggagctgcacct720cctcacggtgcgcaacatggagaagctcgccggcgccgtcgagggctgcgtcgaggacta780cttcgcggcgaagcccgccgcggccaagtcggaggggtacaagtgcgtgctcaactccaa840ggcgtcggaggactcgcaggccaacctggcgcggtgggagccgccgcacgggcggttcgg900cttccgccacccgtacgcgcagtacaccaaggtgggcgccgcgatgcgccactgcgcgta960ctgcgtcgaggcgctcaacagctgcgtccgcgccgaggtccaggcgcccgagcacgtcaa1020gcggctgctcggcgacgtgtgcacgcggctggcctcgcagtgcgcgcgggttctcaggga1080ggcgtccacctcggtcgccgccatgaccagccccaagacgctggacttcgccgtggcgga1140catgaacacggccgtgcacgagcttcagggcgacctgcgcgcgctcccgcccgtcctggc1200cttggaaccggcggcggagatgtcgctgatggacgcgatgccgctcttcaccgtggcgtc1260gctgctgatagagatatcggcgaggatcgagggcgtcgtcgacgccgtcgagacgctggc1320cagcctcgccagcttcaagcaggtggaggatgatgacgacaagaagggacaaaccgagat1380gaaagtgcacccgctgaacgtgccggatgatcacgacgcgtcgacacatgaaagccagac1440tacaacgaagcaccctgaacaggtc1465<210>5<211>1465<212>dna<213>artificialsequence<220><221>mutation<222>(287)..(288)<223>敲除株系ko74-21的ospaa74基因序列<400>5atggacgccgccgcgagggaagcgcaggtgcagggcagtctggaatggcgggtgacggtg60ccggagggctcgtcggtgacggtggagcacgaggccggcgtcgccgagagggcgtgggcg120tgggtggtgaggatgctggtcgcggtcagggcggcggtggccggcttcgccaggaaggtg180tggaagatcggcgccgacgatccccggagagcggtgcacagcctcaaagtcggcctggct240ctcaccctcgtctccatcgtctactacaccaggcccgtgtacgacggtcgtcggcggcaa300tgccatgtgggccgtcatgacggttgtcgtggtcttcgagtacaccgtcggtggatgcat360gtacaagggattcaacagagccgtcgcgacggcgagcgccgggctgctcgcgctcggcgt420gaactgggtggcggacaaatccggcgacaagctcgagccgttcatcctcagcggctccct480gtttttactggctgcggcggccaccttctcgcggttcataccaacggtgaaggcgcggtt540cgactacggcgtgaccatcttcatcctgacgttcagcctcgtcgccgtgtcggggtaccg600cgtcgaccagctgctggacctggcgcagcagcggatgtccaccatcggcatcggcatcgt660catctgcctcgccgtctgcgtcgtcatctggccggtgtgggccggccaggagctgcacct720cctcacggtgcgcaacatggagaagctcgccggcgccgtcgagggctgcgtcgaggacta780cttcgcggcgaagcccgccgcggccaagtcggaggggtacaagtgcgtgctcaactccaa840ggcgtcggaggactcgcaggccaacctggcgcggtgggagccgccgcacgggcggttcgg900cttccgccacccgtacgcgcagtacaccaaggtgggcgccgcgatgcgccactgcgcgta960ctgcgtcgaggcgctcaacagctgcgtccgcgccgaggtccaggcgcccgagcacgtcaa1020gcggctgctcggcgacgtgtgcacgcggctggcctcgcagtgcgcgcgggttctcaggga1080ggcgtccacctcggtcgccgccatgaccagccccaagacgctggacttcgccgtggcgga1140catgaacacggccgtgcacgagcttcagggcgacctgcgcgcgctcccgcccgtcctggc1200cttggaaccggcggcggagatgtcgctgatggacgcgatgccgctcttcaccgtggcgtc1260gctgctgatagagatatcggcgaggatcgagggcgtcgtcgacgccgtcgagacgctggc1320cagcctcgccagcttcaagcaggtggaggatgatgacgacaagaagggacaaaccgagat1380gaaagtgcacccgctgaacgtgccggatgatcacgacgcgtcgacacatgaaagccagac1440tacaacgaagcaccctgaacaggtc1465<210>6<211>1464<212>dna<213>artificialsequence<220><221>mutation<222>(1008)..(1008)<223>突变体paa74的ospaa74基因序列<400>6atggacgccgccgcgagggaagcgcaggtgcagggcagtctggaatggcgggtgacggtg60ccggagggctcgtcggtgacggtggagcacgaggccggcgtcgccgagagggcgtgggcg120tgggtggtgaggatgctggtcgcggtcagggcggcggtggccggcttcgccaggaaggtg180tggaagatcggcgccgacgatccccggagagcggtgcacagcctcaaagtcggcctggct240ctcaccctcgtctccatcgtctactacaccaggcccgtgtacgacggcgtcggcggcaat300gccatgtgggccgtcatgacggttgtcgtggtcttcgagtacaccgtcggtggatgcatg360tacaagggattcaacagagccgtcgcgacggcgagcgccgggctgctcgcgctcggcgtg420aactgggtggcggacaaatccggcgacaagctcgagccgttcatcctcagcggctccctg480tttttactggctgcggcggccaccttctcgcggttcataccaacggtgaaggcgcggttc540gactacggcgtgaccatcttcatcctgacgttcagcctcgtcgccgtgtcggggtaccgc600gtcgaccagctgctggacctggcgcagcagcggatgtccaccatcggcatcggcatcgtc660atctgcctcgccgtctgcgtcgtcatctggccggtgtgggccggccaggagctgcacctc720ctcacggtgcgcaacatggagaagctcgccggcgccgtcgagggctgcgtcgaggactac780ttcgcggcgaagcccgccgcggccaagtcggaggggtacaagtgcgtgctcaactccaag840gcgtcggaggactcgcaggccaacctggcgcggtgggagccgccgcacgggcggttcggc900ttccgccacccgtacgcgcagtacaccaaggtgggcgccgcgatgcgccactgcgcgtac960tgcgtcgaggcgctcaacagctgcgtccgcgccgaggtccaggcgcccaagcacgtcaag1020cggctgctcggcgacgtgtgcacgcggctggcctcgcagtgcgcgcgggttctcagggag1080gcgtccacctcggtcgccgccatgaccagccccaagacgctggacttcgccgtggcggac1140atgaacacggccgtgcacgagcttcagggcgacctgcgcgcgctcccgcccgtcctggcc1200ttggaaccggcggcggagatgtcgctgatggacgcgatgccgctcttcaccgtggcgtcg1260ctgctgatagagatatcggcgaggatcgagggcgtcgtcgacgccgtcgagacgctggcc1320agcctcgccagcttcaagcaggtggaggatgatgacgacaagaagggacaaaccgagatg1380aaagtgcacccgctgaacgtgccggatgatcacgacgcgtcgacacatgaaagccagact1440acaacgaagcaccctgaacaggtc1464<210>7<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_binding<222>(1)..(20)<223>用于敲除ospaa74的靶标序列<400>7aggcccgtgtacgacggcgt20当前第1页12