本发明属于食品、保健品和医药等交叉应用
技术领域：
，具体涉及一种中药药剂在促进保加利亚乳酸杆菌增殖和/或分泌乳酸中的应用。
背景技术：
：肠道微生态作为机体的第九大系统，在人体的生命活动中具有重要的作用。保加利亚乳酸杆菌作为胃肠道常见的益生菌种之一，与肠黏膜紧密结合构成肠道的生物屏障，通过营养竞争、占位效应及其分泌的各种代谢产物等方式抑制外来致病菌的入侵和定植生长以及条件致病菌的过度生长，维持肠道的微生态平衡(谢志玉,邱光钰.肠粘膜屏障功能与儿童过敏性紫癜的相关性分析[j].中国实验诊断学,2015,19(8):1396-1397.)。目前，肠道疾病多用抗生素等药物治疗，导致人体产生抗药性等问题。由于中药经过胃肠消化吸收，可以调整其微生态的平衡，减少肠道益生菌及代谢产物的易位，有效拮抗致病菌。目前，培养保加利亚乳酸杆菌，一般都让其常规繁殖，繁殖速度较慢，不能满足人们对保加利亚乳酸杆菌日益增长的需求。虽然，目前也有人用天然药物提取物促进其增殖和/或分泌乳酸，但是这些天然药物提取物多为单体，也没有较完善的配方可用于促进保加利亚乳酸杆菌的增殖，价格贵且增殖效果不明显。技术实现要素：为了解决现有技术中的技术问题，本发明提供了一种中药药剂在促进保加利亚乳酸杆菌增殖和/或分泌乳酸中的应用。本发明所采用的具体技术方案为：一种中药药剂在促进保加利亚乳酸杆菌增殖和/或分泌乳酸中的应用，所述中药药剂包括以下重量份的原材料：大黄3-50份、牡丹皮3-50份、桃仁5-30份、冬瓜子10-50份和芒硝5-20份。具体的，所述中药药剂用于制备促进保加利亚乳酸杆菌增殖和/或乳酸分泌的药物。具体的，所述中药药剂为冻干粉，所述冻干粉的制作方法如下：称取各原材料并加入到1000重量份的水中煮沸，固液分离，取滤液；将所述滤液放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到所述冻干粉。具体的，所述冷冻干燥包括以下步骤：-50℃预冻5h；-20℃低温升华干燥14h；30℃解析干燥10h。具体的，所述促进保加利亚乳酸杆菌增殖和/或乳酸分泌的药物中中药药剂的浓度为2.5mg/ml-40mg/ml。具体的，所述促进保加利亚乳酸杆菌增殖和/或乳酸分泌的药物中中药药剂的浓度为40mg/ml。具体的，所述乳酸为l-乳酸和/或d-乳酸。本发明的有益效果为：基于前述技术方案，并参见本发明的具体实施方式，本发明首次提供的中药药剂可以整体上促进乳酸杆菌各时期的繁殖，可以缩短菌种的延迟期，延长快速繁殖生长对数期，并保持高水平繁殖的稳定期，扩大菌种整体的繁殖水平和数量，有利于菌种的扩增和繁殖，并可以显著提高菌种产生有益人体健康的代谢产物l乳酸的产量，并提高用于工业生产的d-乳酸的含量。基于上述效果，本发明首次提供的中药药剂可以预期的能够广泛应用于益生菌保加利亚乳酸杆菌的生长培育之中，其长远应用包括但不限制于以下方面：1、所述中药药剂用于配置制成药物组合物，以应用于促进人体肠道中益生菌保加利亚乳酸杆菌的生长增殖和乳酸分泌。2、所述中药药剂应用于生物工业产业中的保加利亚乳酸杆菌的生长增殖，并进一步应用于食品(例如牛奶)中益生菌保加利亚乳酸杆菌的添加。3、所述中药药剂用于配置制成药物组合物，以应用于用于工业生产d乳酸。综上，本发明具有较好的产业化应用前景。具体实施方式本发明的具体实施方式部分提供一种中药药剂在促进保加利亚乳酸杆菌增殖和/或分泌乳酸中的应用。本发明提供的中药药剂由以下原材料制成：大黄3g、牡丹皮3g、桃仁5g，冬瓜子10g和芒硝5g。本发明提供的中药药剂还可由以下原材料制成：大黄9g、牡丹皮9g、桃仁10g，冬瓜子20g和芒硝10g。本发明提供的中药药剂还可由以下原材料制成：大黄18g、牡丹皮9g、桃仁12g、冬瓜子30g和芒硝9g。本发明提供的中药药剂还可由以下原材料制成：大黄36g、牡丹皮36g、桃仁20g，冬瓜子40g和芒硝15g。本发明提供的中药药剂还可由以下原材料制成：大黄50g、牡丹皮50g、桃仁30g，冬瓜子50g和芒硝20g。基于上述各原材料，所述中药药剂优选为冻干粉，冻干粉的制作方法为：称取各原材料并加入到1000重量份的水中煮沸，固液分离，取滤液；将所述滤液放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到所述冻干粉。冷冻干燥时可控制的干燥步骤为：-50℃预冻5h；-20℃低温升华干燥14h；30℃解析干燥10h。基于上述配比大黄18g、牡丹皮9g、桃仁12g、冬瓜子30g和芒硝9g的原材料制作所得的中药药剂冻干粉，本具体实施方式中进一步做了其对于保加利亚乳酸杆菌增殖和/或分泌乳酸的影响效果实验，具体如下：(1)保加利亚乳酸杆菌菌种的培养：将固体mrs(购于thermo，cm1175b)溶于适量蒸馏水中制备mrs培养基，使其中mrs的质量-体积浓度为6.3％(即将6.3g的mrs固体加入100ml蒸馏水中)，将所述mrs培养基放入高温高压蒸汽灭菌锅中，120℃灭菌15分钟消毒灭菌，完成后取出备用。取上述灭菌后的mrs培养基100ml，将1g保加利亚乳酸杆菌冻干粉(购于山东中科嘉忆生物工程有限公司，活菌数约为1.28×1010cfu/g)溶于其中，在磁力搅拌器上混匀制成菌株悬混液，保加利亚乳酸杆菌浓度约为108cfu/ml，共制作7组菌株悬混液。(2)给药处理：将上述7组菌株悬混液依次标记为1-7组，其分别代表：1：空白组；2-4组中分别依次加入高、中和低剂量的所述中药药剂冻干粉，配制成高、中和低浓度的中药药剂冻干粉作用下的菌种悬混液，依次命名为高、中和低复组；5-7组中分别依次加入高、中和低剂量的头孢曲松钠(购于武汉贝尔卡生物医药有限公司，74578-69-1)，配制成高、中和低浓度的头孢曲松钠作用下的菌种悬混液，依次命名为高、中和低抗组；2～7组中的高、中和低剂量浓度均分别依次为40mg/ml、10mg/m和2.5mg/ml。将配置完毕的1～7组放入恒温为37℃、5％co2微生物培养箱中进行培养24h。(3)菌种生长曲线的测量：分别吸取100μl上述各组菌种悬混液置于96孔板中，每组设置3个复孔，使用thermo酶标仪于波长600nm处进行菌种浓度测量，菌种浓度以吸光度od值表示。od值约以0.2-1之间较为真实反映菌种浓度。每隔2h观察一次各组菌种浓度变化，记录下各组菌种在0h、2h、4h、6h、8h……18h、20h、22h和24h的od值。当菌种繁殖浓度增加到od值远大于1时，取该组菌种混悬液1ml，加入到9ml无菌蒸馏水中进行稀释，震荡混匀，制成10-1稀释度的菌悬液。再取稀释液做3个复孔，进行od值测量，此时真实od值为测量值×稀释度倍数(稀释度倍数10)，菌种浓度用表示。7个组不同时间的od值测量统计数据列于下表1。表10h2h4h6h8h10h12h正常组0.5±0.04▲0.65±0.01▲1.01±0.03▲2.64±0.25▲2.98±0.21▲3.56±0.23▲3.62±0.02▲高复组0.49±0.01#▲4.02±0.17#▲4.01±0.33#▲4.34±0.29#▲4.98±0.16#▲5.64±0.72#▲5.51±0.6#中复组0.48±0.03#▲2.04±0.28#▲2.06±0.11#3.45±0.11#▲3.91±0.59#▲4.81±0.47#▲4.76±0.05#▲低复组0.51±0.01▲0.80±0.03▲1.6±0.1▲2.82±0.05▲2.97±0.33▲3.82±0.3▲3.78±0.07▲高抗组0.49±0.03#0.64±0.03#0.58±0.02#0.59±0.01#0.47±0.05#0.67±0.03#0.54±0.06#中抗组0.51±0.004#0.73±0.05#0.63±0.03#0.72±0.04#0.51±0.13#0.65±0.19#0.52±0.07#低抗组0.54±0.01#0.73±0.03#0.65±0.01#0.73±0.02#0.57±0.15#0.66±0.1#0.59±0.07#表1(续)14h16h18h20h22h24h正常组3.93±0.04▲3.72±0.13▲3.82±0.05▲3.7±0.1▲3.73±0.21▲3.52±0.1▲高复组6.32±0.81#▲6.47±0.1#▲6.67±0.31#▲6.7±0.19▲#6.93±0.12#▲6.15±0.04#▲中复组5.18±0.59#▲5.18±0.25#▲5.52±0.22#▲4.94±0.39▲#5.44±0.12#▲4.82±0.33#▲低复组3.77±0.59▲3.7±0.22▲4.16±0.31▲3.48±0.43▲4.02±0.17▲3.45±0.25▲高抗组0.58±0.07#0.66±0.03#0.75±0.03#0.63±0.13#0.71±0.06#0.73±0.03#中抗组0.63±0.04#0.56±0.17#0.74±0.05#0.64±0.08#0.74±0.02#0.7±0.01#低抗组0.67±0.05#0.59±0.06#0.66±0.02#0.61±0.03#0.68±0.05#0.58±0.03#注：#表示各组与正常组和低复组两两相比p<0.01，差异具有统计学意义；▲表示各组与高、中和低浓度抗生素组两两相比p<0.01，差异具有统计学意义。(4)代谢产物l-乳酸和d-乳酸的测量：采集0h、2h、6h、10h、14h、18h和22h时间点时的菌种培养基上清液，使用biovision的乳酸检测分析试剂盒(k607-100)和d-乳酸检测分析试剂盒(比色法)(k667-100)依据elisa方法对培养液进行l-乳酸和d-乳酸的检测。菌种产生的乳酸含量用表示。7个组不同时间的l-乳酸含量测量统计数据列于下表2，7个组不同时间的d-乳酸含量测量统计数据列于下表3。表2注：#表示各组与高抗组和中抗组两两相比p＝0.000，差异具有统计学意义。表30h2h6h10h14h18h22h正常组11.57±0.08▲18.15±0.45▲28.71±0.11▲40.34±0.48▲37.74±0.34▲39.19±1.46▲37.46±3.52▲高复组9.75±0.1#▲14.61±0.08#11.98±2.13#31.24±0.19#42.89±3.11#40.52±0.81#38.22±2.08#中复组11.63±0.19▲20.35±0.23▲18.31±3.94▲40.15±1.78▲39.52±0.54▲39.09±0.15▲39.88±0.76▲低复组12.33±0.39▲20.46±0.66▲25.2±2.8▲39.2±2.68▲38.39±1.31▲39.38±0.55▲39.23±0.29▲高抗组12.65±0.21#11.28±0.38#10.51±2.59#14.12±0.44#13.88±0.14#15.61±1.21#16.47±0.39#中抗组11.73±0.22#11.46±1.07#8.43±1.21#16.61±0.45#16.15±0.22#18.18±0.91#17.01±0.12#低抗组13.18±0.05▲#14.88±1.3#▲11.04±5.1#▲20.34±0.86▲#19.69±0.15▲#26.07±0.5#▲25.72±0.43▲#注：#表示各组与正常组、中和低复组两两相比p＝0.000，差异具有统计学意义。▲表示各组与高、中抗生素组两两相比p＝0.000，差异具有统计学意义。结果分析：一、头孢曲松钠和本发明提供的中药药剂对于保加利亚乳酸杆菌增殖的影响保加利亚乳酸杆菌菌种的正常繁殖周期为24h，其中迟缓期为(0-4h)：主要为进入生长对数期的快速繁殖提供充足的酶、辅酶、中间代谢产物等物质基础；生长对数期(4h-10h)：此时期活菌数大量上升，并同时产生大量的对人体健康或菌体自身有益或有害的代谢产物；稳定期(10h-22h)：活菌繁殖的稳定时期，抗菌物质的产生和代谢产物的大量累积；衰退期(22h-24h)：活菌数下降，死菌数上升，菌种生理代谢活动趋于停滞。如表1所示，与正常组和低复组相比，除各组0h的基础菌种浓度一致外，在保加利亚乳酸杆菌菌种的繁殖周期的各阶段，高复组和中复组的菌液od值显著高于正常组和低复组，且高复组的菌液od值高于中复组的菌液od值，说明高浓度中药药剂和中浓度中药药剂能促进各阶段菌种增殖，高浓度中药药剂促进各阶段菌种增殖的程度优于中浓度中药药剂。在保加利亚乳酸杆菌菌种的繁殖周期的各阶段，高、中和低抗组的菌液od值显著低于正常组的菌液od值，表明高、中和低浓度抗生素组能显著抑制各阶段菌种的增殖。在保加利亚乳酸杆菌菌种的繁殖周期的各阶段，高、中和低抗组的菌种od值均显著低于高、中和低复组，表明高、中和低浓度中药药剂促进菌种的增殖的作用显著优于高、中和低抗组。基于此，可以得到中药药剂对于促进保加利亚乳酸杆菌增殖具有较好作用，中药药剂可应用于促进保加利亚乳酸杆菌的增殖，显而易见的，中药药剂亦可进一步用于制备促进保加利亚乳酸杆菌增殖的药物，并且所述药物中中药药剂的浓度优选10mg/ml-40mg/ml，40mg/ml最优。二、头孢曲松钠和本发明提供的中药药剂对于保加利亚乳酸杆菌乳酸分泌的影响如表2所示，与高、中抗组相比，除各组0h的基础l-乳酸浓度相近外，在保加利亚乳酸杆菌菌种的繁殖周期的各阶段，其余各组在各时期的l-乳酸含量均显著高于高抗组和中抗组。相对正常组各时期产l-乳酸含量而言，高和中复组l-乳酸含量高于正常组l-乳酸含量，且高复组的l-乳酸含量高于中复组，表明高和中复组能促进各时期菌种产生l-乳酸的含量，高抗组和中抗组能显著抑制各时期菌种产生l-乳酸的含量。基于此，可以得到本发明提供的中药药剂对于促进保加利亚乳酸杆菌分泌l-乳酸具有较好作用，可应用于促进保加利亚乳酸杆菌的l-乳酸分泌，显而易见的，本发明提供的中药药剂亦可进一步用于制备促进保加利亚乳酸杆菌l-乳酸分泌的药物，并且所述药物中中药药剂的浓度为40mg/ml时效果最优。如表3所示，与正常组和中复组、低复组相比，除各组0h的产d-乳酸含量相近外，相对正常组各时期产d-乳酸含量而言，高复组作用下菌种在繁殖初期和生长对数期产生d-乳酸的含量弱于正常组、中复组和低复组，直到14h稳定期d-乳酸含量累积才高于正常组、中复组和低复组，而正常组、中复组和低复组的各时期d-乳酸累积含量相似。由于d-乳酸主要在保加利亚乳酸杆菌的平衡期的晚期产生，基于此，可以得到本发明提供的中药药剂对于促进保加利亚乳酸杆菌的平衡期晚期分泌d-乳酸具有一定作用，可应用于促进保加利亚乳酸杆菌的d-乳酸分泌，显而易见的，本发明提供的中药药剂亦可进一步用于制备促进保加利亚乳酸杆菌d-乳酸分泌的药物，并且所述药物中中药药剂的浓度为40mg/ml时效果最优。分泌产生的d-乳酸可用于工业上制造其他相关产品。抗生素组d-乳酸的产量随时间变化略有上升趋势，与高和中抗组相比，其余各组各时期产d乳酸含量高于高和中抗组，低抗组d乳酸产量累积略高于高和中抗组，表明高、中和低抗组能显著抑制各阶段菌种的增殖。由以上结果可知，本发明提供的中药药剂可以整体上促进乳酸杆菌各时期的繁殖，缩短菌种的延迟期(2h以内)，延长快速繁殖生长对数期(2h-14h)，并保持高水平繁殖的稳定期(14h-22h)，扩大菌种整体的繁殖水平和数量，尤其以40mg/ml浓度的中药药剂冻干粉为佳。可以肯定的是，本发明提供的中药药剂能够刺激乳酸杆菌的生长，缩短迟缓期，快速激发菌种进入生长对数期，延长菌种的生长对数期，有利于菌种的扩增和繁殖，并能显著提高菌种产生有益人体健康的代谢产物l-乳酸的产量，也能提高有益人体健康的代谢产物d-乳酸的产量。本次研究还发现头孢曲松钠对肠道益生菌乳酸杆菌的长效抑制作用，提示我们临床上要慎用抗生素治疗疾病，可能会造成机体短时间的肠内益生菌失调，反而不利于疾病的恢复。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。当前第1页12