基于酸粥的高抗氧化和降胆固醇活性益生菌及应用的制作方法

本发明属于益生菌发酵谷物饮料技术领域，尤其涉及一种基于酸粥的高抗氧化和降胆固醇活性益生菌及该菌发酵谷物饮料。

背景技术：

胆固醇是人体重要的营养元素之一，其与于胆酸的形成、细胞膜的构建和激素的合成密切相关，而血清中胆固醇含量过高是引起动脉粥样硬化和心血管疾病的重要原因。目前我国有近1/3的成年人的血脂偏高，高血脂现在已成为影响人类健康的第一隐形杀手。

益生菌被广泛的应用于食品行业。益生菌可通过菌体自身和其产生的代谢产物来调节人体肠道内环境，从而达到维持人体健康的有益功效。经过益生菌发酵的食品，能够在保持原材料营养价值的基础上，改善产品的风味口感。在发酵过程中产生的生物活性物质，具有调节肠道菌群平衡、抗菌、抗肿瘤、减肥、降低胆固醇、防治便秘、改善乳糖不适、延缓衰老等重要的生理保健作用。鉴于以上益生菌饮品所具有的酸甜怡人口感和健康功能，益生菌产品近年来受到普遍欢迎。

随着人们对生活品质要求的不断提高，人们对饮料的营养和品质的要求也越来越高。目前，市场上的饮料以果蔬汁饮料为主，谷物饮料缺寥寥无几。谷物经益生菌发酵后，能够在较大程度的保持营养物质的同时，可以使谷物具有独特的风味，且使其营养物质更有利于人体吸收。益生菌在发酵谷物中的应用是谷物加工技术的进一步深入和延伸。益生菌发酵谷物饮料不仅具有特殊的营养功能，也增加了谷物制品特殊的医疗保健功能。同时，极大的丰富了我国饮料和谷物制品的种类，解决了谷物加工行业进一步发展的技术难题。

酸粥是一种流行于我国西北地区及内蒙古河套地区的一种极具特色的民间小吃，是一种经过自然发酵而成的酸食。其发酵底物主要是糜米，其次添加少量的大米和玉米碎，经蒸煮、糖化、发酵、再蒸煮等步骤制成。目前，我国酸粥的制作主要以家庭式的小规模生产为主，并且对于其发酵菌株不明确。所以就存在产品口感不稳定，产品质量不可控等一系列问题。为了解决此发酵谷物在生产过程中存在的问题，本发明旨在探究一种可科学化、规范化，适合大规模生产的发酵谷物饮料制作工艺。

技术实现要素：

本发明的目的是对传统工艺的酸粥中的益生菌进行分离，筛选出优势菌株用来后期发酵。然后对传统工艺的酸粥进行条件优化，发明出产品质量稳定、营养丰富、口感风味俱佳的发酵复合谷物饮料。

本发明提供的一种基于酸粥的高抗氧化和降胆固醇活性益生菌及应用，包括益生菌发酵谷物饮料，发酵菌株是从内蒙古河套地区传统发酵酸粥中分离纯化出的乳酸菌，经耐酸、耐胆盐实验实验及16srdna序列分析，鉴定该菌株是植物乳杆(lactobacillusplantarum)sz8，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.13311。

为达到上述目的，本发明采用如下技术路线：

一种基于酸粥的高抗氧化和降胆固醇活性益生菌，名称为sz8，分类命名为植物乳杆(lactobacillusplantarum)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2016年11月15日，保藏号为cgmccno.13311。

一种益生菌发酵谷物饮料，采用上述益生菌发酵获得，发酵方法如下

⑴原料的加工：按如下重量份组成糜米40-50份、大米20-30份、玉米碎10-20份混合均匀，加入水后用打浆设备打浆，制得混合谷物浆液；

⑵过滤：用200-300目筛网过滤除去混合谷物浆液中的大颗粒物质，使滤液中无肉眼可见杂质；

⑶糊化：将⑵中的浆液放入锅内加热至糊化状态，使淀粉变性；

⑷酶解：待⑶中的浆液冷却至50-60℃时，加入α-淀粉酶，50-60℃的条件下反应3h-5h，之后90-100℃水浴灭酶5min，降温后加入糖化酶，50-60℃的条件下反应3h-5h，即得酶解液；

⑸调味：将⑷中的酶解液中加入调味剂；

⑹均质：将⑸中的浆液与稳定剂混合均匀后，用均质机均质2-4次；

⑺灭菌：将均质过的浆液分装后，在115-120℃灭菌15-20min，无菌环境下冷却至室温；

⑻发酵：将灭菌后的复合谷物浆液，接入4-8％的权利要求1所述的益生菌菌种液，静态发酵至其ph为3-5；

⑼灌装：在无菌的条件下将含有活益生菌的谷物饮料灌装成益生菌发酵谷物饮料。

而且，所述步骤⑴中谷物总量与水的质量比例是1：5～15。

而且，所述步骤⑸中所使用的调味剂为4wt％-8wt％的蔗糖。

而且，所述步骤⑹稳定剂为黄原胶、琼脂、海藻酸钠和羧甲基纤维素钠四种复合的稳定剂，其添加量为0.04-0.12％，均质条件是在浆液50-60℃时，在20-30mpa的压力下均质2-4次。

而且，所述步骤⑻中的接菌量是4-8％，30-37℃的条件下厌氧发酵8-16h。

本发明的有益效果和优点是：

1.本发明从中国传统发酵酸粥中筛选出了一株既耐酸有耐胆盐的乳酸菌，此菌株能够耐受来自肠胃的严峻挑战。其可以提高此菌株在人体肠道内的存活率，使定植于肠道内的乳酸菌含量增多。从而达到增加肠道有益菌、维持肠道菌群平衡、增加肠胃蠕动、促进人体膳食健康的有益效果。

2.本发明研究的菌株sz8是一株既耐酸耐胆盐又可清除人体有害自由基。可被用来开发成发酵菌剂、保健食品。

3.本发明在原传统发酵酸粥的基础上，以糜米、大米和玉米碎为发酵原料，并对其进行粉碎和酶解处理，使谷物中的活性物质充分释放，同时不同谷物的搭配使发酵谷物的营养更加丰富、全面。

4.鉴于谷物饮料颗粒密度大难以稳定，本发明利用琼脂、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠四种稳定剂结合均质机对谷物浆液进行稳定。使产品质量具有很好的稳定性的同时还具有口感细腻爽滑的特点。

5.通过抗氧化实验发现，发酵后的发酵谷物对于abts和dpph清除率显著提高，说明在发酵的过程中产生了更多的抗氧化物质。所以此活菌型谷物饮料可作为一款抗氧化的新型功能性饮料使用。

6.通过对建立了高脂模型的小鼠灌胃发酵酸粥谷物饮料，发现此谷物饮料可以显著缓解小鼠的高血脂病情。所以长期饮用此饮料，可以对高血脂病人的病情有很好的缓解作用。并且通过对小鼠体重的称量发现此谷物饮料具有很好的控制小鼠体重的效果，可被用做减肥产品。

附图说明

图1-1为sz5的镜检结果，图1-2为sz8的镜检结果，图1-3为sz8的镜检结果。

图216srdna扩增电泳图。

图3为从酸粥中筛选出的23株菌耐酸能力检测结果图。

图4为从酸粥中筛选出的23株菌耐胆盐能力检测结果图。

图5为基于河套酸粥的益生菌发酵谷物饮料产品照片。

图6为发酵谷物样品发酵前后对abts自由基清除力的比较图。

图7为发酵谷物样品发酵前后对dpph自由基清除力的比较图。

图8-1到图8-4为动物肝脏病理切片观察图，图8-1为基础组；图8-2为模型组；图8-3为辛伐他汀组；图8-4为发酵发酵谷物组。

图9为发酵谷物样品对小鼠体重的控制图。

具体实施方式

为了更清楚的说明本发明，下面对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明提供一种基于河套糜米酸粥的高抗氧化及降胆固醇活性益生菌筛选，及采用该菌种发酵谷物饮料，按照如下制作步骤进行：

⑴在实验室条件下对中国传统发酵酸粥中的菌株进行初步的分离、筛选、鉴定，并于mrs肉汤培养基中培养；

⑵通过耐酸、耐胆盐实验，筛选出既耐酸又耐胆盐的优势菌株，之后通过16srdna序列分析确定其为植物乳杆菌；

⑶通过对小鼠灌胃该优势菌株，确定在长期的灌胃过程中，小鼠健康状况良好。证明该菌株属于安全菌株可作为后续发酵饮料的益生菌使用。

⑷原料的加工：将各谷物按如下重量份组成糜米40-50份、大米20-30份、玉米碎10-20份混合均匀，加入适量的水后用打浆设备打浆，制得混合谷物浆液。

⑸过滤：用200-300目筛网过滤除去混合谷物浆液中的大颗粒物质，使滤液中无肉眼可见杂质。

⑹糊化：将⑶中的浆液放入锅内加热至糊化状态，使淀粉变性。

⑺酶解：待⑷中的浆液冷却至50-60℃时，加入α-淀粉酶，50-60℃的条件下反应3h-5h，之后90-100℃水浴灭酶5min。降温后加入糖化酶，50-60℃的条件下反应3h-5h，即得酶解液。

⑻调味：将⑸中的酶解液中加入蔗糖。

⑼均质：将⑹中的浆液与四种稳定剂混合均匀后，用均质机均质2-4次。

⑽灭菌：将均质过的浆液分装后，在115-120℃灭菌15-20min，无菌环境下冷却至室温。

⑾发酵：将灭菌后的复合谷物浆液，接入4-8％的菌种液，静态发酵至其ph为3-5。

⑿灌装：在无菌的条件下将含有活益生菌的谷物饮料灌装成成品。

⒀抗氧化：对发酵前后的谷物饮料分别进行abts及dpph抗氧化能力测定。

⒁动物实验：将发酵的酸粥谷物饮料灌胃给建高脂模型的小鼠，检验发酵谷物饮料对高血脂的降低情况。

⒂并通过动物实验期间小鼠体重的称量检测该饮料对小鼠体重的控制情况。

实施例1

样品来源：发酵酸粥样品采集自内蒙古河套地区常年制作酸粥的家庭。

将采集的酸粥样品混匀，用无菌水对样品进行系列稀释，取0.1ml样品加入0.9ml无菌水(10倍梯度稀释)，取稀释后的酸粥0.1ml在mrs固体培养基上进行涂布。培养48h后从分离平板上挑取产生透明圈的菌落进行三区划线纯化，经镜检确认为纯种后，挑取单菌落于mrs液体培养基中培养48h。取菌液与60％甘油按3:1的体积比混合均匀后储存于-80℃备用。

mrs固体培养基的配方及条件为：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、无水乙酸钠5g、吐温-801ml、柠檬酸二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、碳酸钙20g、琼脂18g、蒸馏水1000ml，ph6.5～6.7，115℃，灭菌15min。

实施例2

菌株形态学鉴定

采用革兰氏染色法检测菌株的形态特征。结果如图1所示，本发明所筛选的菌株属于革兰氏阳性菌。分离的23株菌中有杆状、短杆状和球状三种，呈单个、成对或短链排列。

实施例3

菌株的分子生物学鉴定

分离菌株使用mrs液体培养基于37℃培养箱静置培养12h，菌液dna提取使用tiangen细菌提取试剂盒按照其说明书方法进行。使用下列引物27f5’agagtttgatcctggctcag3’和1492r5’ggttaccttgttacgactt3’对该细菌的16srrna基因序列进行pcr扩增，扩增结果见图2。pcr反应条件如下：95℃，10min；94℃，1min；55℃，1min；72℃，2min，30个循环；72℃，10min。扩增片段长度为1500bp左右。pcr扩增产物纯化后交由金维智公司进行分析测定。测序结果在genbank上进行blast比对，结果显示从传统酸粥中分离到的乳酸菌包含植物乳杆菌、短乳杆菌和乳酸乳球菌三种。

实施例4

优势菌株的筛选

对分离得到的23株乳酸菌分别进行耐酸及耐胆盐实验检测，从而筛选出一株耐酸、耐胆盐性能都很强的优势菌株，作为后期酸粥产品的开发。

⑴菌株的耐酸能力

菌株如果要在体内存活定植，首先必须经受来自胃内强酸环境的考验。本发明选择ph3.0的mrs培养基来模拟胃酸环境，在厌氧条件下培养4h后来检测分离到的所有菌株对强酸的耐受能力。结果表明，8号菌株耐酸的能力更强。

⑵菌株的耐胆盐能力

人体的肠道内存在大量的胆盐以杀死进入人体的有害菌，乳酸菌在人体内是否能够安全的定植于肠道内，从而发挥益生作用，与他们对于胆盐的耐受能力有密切的关系。本发明用含胆盐量为0.3％的mrs培养基来模拟肠道内胆盐环境，在厌氧条件下培养4h后，以菌株的存活率作为判断各菌株对于胆盐的耐受性能的大小。结果表明，8号菌株的耐胆盐性能也是最强的。

通过对所分离菌株的耐酸性及耐胆盐性试验结果分析表明，以8号菌株的耐酸性及耐胆盐性能力最强。经16srdna序列分析，鉴定该菌株是植物乳杆(lactobacillusplantarum)，并命名为sz8，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.13311。

实施例5

一种基于河套糜米酸粥的高抗氧化及降胆固醇活性益生菌发酵谷物饮料的方法，包括如下方法：

⑴原料的处理：分别称取糜米、大米和玉米碎各50g、20g和10g混合均匀后用清水淘洗两遍。将水沥干后加入800ml的开水浸泡30min。之后将混合谷物连同水一起放入打浆机里打浆20min。后用200目的筛网进行过滤，除去大颗粒杂质。之后将过滤后的浆液放入锅内糊化2-3min，至浆液变成米黄色。

⑵酶解：将糊化后的浆液冷却至60℃后，按浆液体积1％加入α-淀粉酶，于60℃恒温水浴锅内酶解3h，至加入碘液后无蓝色显示表明淀粉降解完全得到第一酶解液。将第一酶解液在沸水锅内灭酶5min。冷却至60℃时，按浆液体积0.4％加入糖化酶，酶解3h后得第二酶解液。

⑶均质：将第二酶解液中依次加入稳定剂海藻酸钠、琼脂、羧甲基纤维素钠、黄原胶，分别按浆液体积百分比的0.08％、0.04％、0.10％、0.12％加入其中。搅拌均匀后在温度降60℃时，在压强25mpa的均质机里均质2～3次。

⑷调味：将均质后的浆液分装到250ml锥形瓶内，按浆液体积百分比5％的量加入蔗糖调味。

⑸灭菌：将分装好的浆液放入高温高压灭菌锅内115℃灭菌15min。

⑹种子液配制：将植物乳杆菌sz8的浓度调整为10⁸cfu/ml，用mrs液体培养基在厌氧培养箱中活化3代后，放在4℃冰箱中储存备用。

⑺发酵：将灭菌后的复合谷物浆液，接入5％的lpsz8，在厌氧培养箱中静态发酵12h。之后转入4℃冰箱内后发酵24h。

⑻灌装：在无菌条件下将发酵后的酸粥装入无菌瓶内，即为活菌型的酸粥成品。

本实施例制得的发酵谷物饮料均匀性好，在储存期间稳定性佳，4℃储存15天不会出现沉淀和变质现象。且本实施例制得的发酵谷物酸甜可口，风味怡人。

实施例6

发酵谷物饮料的抗氧化能力

⑴样品的处理：将上述发酵谷物饮料，12000rpm离心1min，取上清过0.22μm微孔滤膜，得发酵谷物饮料测试样品。

⑵abts抗氧化实验：将配制好的abts自由基储备液，混匀后避光储存于4℃冰箱中过夜后使用。将abts储备液用pbs稀释40倍即得abts工作液。将一定量样品与abts工作液混合摇匀，在黑暗中37℃放置6min，在734nm测其吸光度分别为a1。将一定量的水与abts工作液混合摇匀，在黑暗中37℃放置6min，测其吸光度a2。

根据以下公式计算样品对abts的清除率，即

抑制率/％＝[(a2-a1)/a1]×100

⑶dpph抗氧化实验：将dpph配置成0.5mmol/l的储备液，之后dpph储备液用甲醇稀释5倍即得dpph工作液。将一定量样品分别与dpph工作液混合摇匀，在黑暗中37℃放置30min，在514nm测其吸光度a1。将一定量甲醇与dpph工作液混合摇匀，在黑暗中37℃放置30min，测其吸光度a2。

根据以下公式计算样品对dpph的清除率，即

抑制率/％＝[(a2-a1)/a1]×100

实施例7

发酵谷物饮料的降胆固醇能力及减肥能力

为了检测发酵后的此发酵谷物饮料对于胆固醇的降解能力。本发明选择健康spf级雄性小鼠40只(体重20±2g)，设基础组、模型组、辛伐他汀组(阳性对照组)和实验组(各10只)。实验分组及饲养方式如表1所示：

表1实验分组及饲养方式

连续喂养40天，每天观察的行为状态，包括毛色、精神状态，大小便、食物摄入量等一般状态及是否出现死亡现象。在整个观察期间，各组小鼠毛色光洁、活动状态正常、大小便正常、饮食量正常、无死亡现象。40天后脱颈椎处死小鼠，并对所有动物进行尸检。取血清、肝脏等器官。通过对肝脏病理切片的结果分析得出，此发酵谷物饮料对降低高血脂有显著的效果。通过对小鼠在喂养期间的体重称量，发现此发酵谷物饮料对小鼠的体重具有显著的控制效果。