本发明涉及直线交联透明质酸制备方法。
背景技术：
：透明质酸制造凝胶的过程中，一种现有技术是：透明质酸交联在热碱性条件进行，交联剂与透明质酸混合不均匀，造成结果交联反应不均一，这样的凝胶皮下注射会照成局部皮肤红肿或达不到修复皮下效果。另一种现有技术是：低温二次交联透明质酸技术，能让透明质酸和交联剂混合更均匀，但是对凝胶中交联剂残留去除不是很彻底，不能到达理想效果，导致局部皮肤红肿，皮下注射交联不彻底凝胶颗粒的话，达不到修复皮下的效果。现有技术交联产品具有颗粒状，植入皮下异物感比较强，注射过程疼痛感也比较强。也不能用于需无颗粒的手术创面，防粘连和关节功能改善方面。技术实现要素：本发明解决的技术问题是提供一种直线交联透明质酸制备方法，提高透明质酸的加工品质和使用范围。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种直线交联透明质酸制备方法，包括以下步骤：a、将透明质酸原料通过处理使其分子量降低；b、碱性溶液和交联剂混合成混合溶液，将透明质酸原料加入混合溶液中，搅拌完全溶解后，进行低温交联反应形成透明质酸凝胶，低温交联反应的温度为2℃～20℃，反应时间为12h～36h；c、对透明质酸凝胶进行热碱活化交联反应形成凝胶体，热碱活化交联反应温度为在25℃-65℃，热碱活化交联反应的反应时间为1h-6.5h；d、凝胶体采用pbs透析液进行透析处理得到凝胶膏体；进一步的，a步骤中，将分子量为100kda-300kda的透明质酸原料通过处理使其分子量降低至30kda-80kda。进一步的，a步骤中，所述透明质酸原料装入密闭容器中，放入湿热灭菌柜中热处理，温度为114℃～121℃，时间10min～45min。进一步的，b步骤中，所述交联剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚，所述碱性溶液的ph＞13，所述碱性溶液的浓度为0.5％-3.5％，所述交联剂与透明质酸重量比例1:20-1:33。进一步的，d步骤中，采用缓冲液透析3次-8次，缓冲液的ph6.5-7.5，渗透压控制在270mosm/l-330mosm/l，加入pbs透析液的用量是透明质酸凝胶的45倍-150倍，透析时间为16h-52h。进一步的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。本发明的有益效果：本发明直线交联透明质酸制备方法，是经处理降低分子量的透明质酸干粉在低温碱性条件下和交联剂进行浸润缓慢交联反应，而后在高温碱性条件下活化持续交联反应。这样一步步的交联反应，使得ha大分子之间形成稳定的共价键，增加ha空间网络结构的紧密程度。ha为大分子空间网状结构，每一个糖环上存在多个活性基团，在一定条件下受到小分子bdde(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)攻击反应后，获得空间结构更加紧密，性质安全稳定的共价结合基团衍生物,就是ha被bdde修饰羧基和羟基的结果。其次透明质酸分子间及分子内链接更充分，分子链节可以自由地旋转，整个分子链也能自由移动，从而形成是流非流的粘液，也就是无颗粒凝胶膏体。这样的交联ha无颗粒凝胶膏体既有液体的粘性，又有固体的弹性。用bdde(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)作为交联剂，比其它交联剂毒性要低，因为它是一种双环氧交联剂，bdde的用量既保证了交联ha凝胶有着良好的粘弹性和较长的体内持续时间，同时又能避免交联剂过多带来的毒性，保证了其应用的安全性。ha在bdde的作用下形成自由基,互相反应形成交联结构，使其变成ha团块，在保留其基本理化性质下，延长体内降解时间。直线交联内聚力和粘力远大于无交联剂的透明质酸，这是交联后分子量显著提高和分子链段长度增加的结果。此方法生产出来的产品，比其他交联制备方法省去了加入非交联透明质酸溶液的步骤，即简化了生产工序又降低了污染的风险，皮下注射时疼痛感减轻又能达到皮下修复理想效果。交联反应更彻底，交联剂残留更低，无颗粒凝胶膏体弹性好，皮下修复及嫩肤效果更明显，有效解决了气泡问题，注射时推动更轻松；还能用于隔离手术创面，改善关节功能，辅助减少术后粘连和松解手术后组织再生粘连，比其他产品持续时间更长，效果更佳。本发明的这些特点和优点将会在下面的具体实施方式中详细的揭露。【具体实施方式】本发明提供的直线交联透明质酸制备方法，包括以下步骤：a、将透明质酸原料通过处理使其分子量降低；优选将分子量为100kda-300kda的透明质酸原料通过处理使其分子量降低至30kda-80kda。例如：透明质酸原料装入密闭容器中，放入湿热灭菌柜中热处理，温度为114℃～121℃，时间10min～45min。降低透明质酸分子量的方法可为热处理、酸处理等方法。b、碱性溶液和交联剂混合成混合溶液，将透明质酸原料加入混合溶液中，搅拌完全溶解后，进行低温交联反应形成透明质酸凝胶；其中，交联剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚，碱性溶液的ph＞13，所述碱性溶液的浓度为0.5％-3.5％，所述交联剂与透明质酸重量比例1:20-1:33，低温交联反应的温度为2℃～20℃，反应时间为12h～36h。c、对透明质酸凝胶进行热碱活化交联反应形成凝胶体，热碱活化交联反应温度为在25℃-65℃，热碱活化交联反应的反应时间为1h-6.5h。d、凝胶体采用pbs透析液进行透析处理得到凝胶膏体，采用缓冲液透析3次-8次，缓冲液的ph6.5-7.5，渗透压控制在270mosm/l-330mosm/l，加入pbs透析液的用量是透明质酸凝胶的45倍-150倍，透析时间为16h-52h，优选缓冲液为磷酸盐缓冲液。形成直线交联透明质酸无颗粒的凝胶膏体的判断条件为：直线交联透明质酸无颗粒凝胶膏体中透明无气泡、看上去是流非流的膏状粘液、不会自然分层，具有稳定的等渗渗透压。本发明是先将最常用的透明质酸原料，经处理降低分子量后，再在低温碱性条件和交联剂进行浸润缓慢交联反应，而后在高温碱性条件下活化持续交联反应，这样一步步交联反应，能使透明质酸分子间及分子内链接更充分，分子链节可以自由地旋转，整个分子链也能自由移动，从而形成是流非流的粘液，也就是无颗粒凝胶膏体。再通过机械力装置的混合，这样生产出来的产品，交联反应更彻底，交联剂残留更低，保证原透明质酸本身内聚力特性，又能保持良好的皮下修复及嫩肤效果。弹性好，皮下修复及嫩肤效果更明显。还能用于隔离手术创面，改善关节功能，辅助减少术后粘连和松解手术后组织再生粘连，比其他产品持续时间更长，效果更佳。通过动物皮下降解试验和白兔肌腱损伤后防粘连试验，本发明技术皮下修复效果更好，皮刺效果更佳。以及无颗粒凝胶膏体能够产生比较理想的防粘连作用且不影响肌腱愈合，并能改善关节功能。下面结合基体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。实施例一：一种直线交联透明质酸制备方法，包括以下步骤：1)将最常用的透明质酸原料加热处理，使分子量降低至30kda，加热温度121℃，时间40min。2)将碱性溶液和交联剂混合成混合溶液，交联剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚，处理后的透明质酸原料加入混合溶液中，搅拌溶解后，进行低温交联反应，形成透明质酸凝胶，低温交联反应温度为2℃，反应时间为36h；其中，碱性溶液的ph＞13，碱性溶液的浓度为3.5％，交联剂与透明质酸原料重量比例1:33。3)对透明质酸凝胶进行热碱活化交联反应，温度控制在25℃，反应时间为1h-4.5h。4)采用pbs透析液进行透析处理得到凝胶膏体；该步骤中，采用缓冲液透析3次，缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，缓冲液的ph7.5，渗透压控制在330mosm/l，加入pbs透析液的用量是透明质酸凝胶的150倍，透析时间为16h。形成交联透明质酸无颗粒凝胶膏体的判断条件为：交联透明质酸无颗粒凝胶膏体透明无气泡，看上去是流非流的膏状粘液，不会自然分层，具有稳定的等渗渗透压。实施例二：一种直线交联透明质酸制备方法，包括以下步骤：1)将最常用的透明质酸原料加热处理，使分子量降低至80kda，加热温度114℃，时间15min。2)将碱性溶液和交联剂混合成混合溶液，交联剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚，处理后的透明质酸原料加入混合溶液中，搅拌溶解后，进行低温交联反应，形成透明质酸凝胶，低温交联反应温度为20℃，反应时间为12h；其中，碱性溶液的ph＞13，碱性溶液的浓度为0.5％，交联剂与透明质酸原料重量比例1:20。3)对透明质酸凝胶进行热碱活化交联反应，温度控制在60℃，反应时间为1h-4.5h。4)采用pbs透析液进行透析处理得到凝胶膏体；该步骤中，采用缓冲液透析8次，缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，缓冲液的ph6.5，渗透压控制在330mosm/l，加入pbs透析液的用量是透明质酸凝胶的45倍，透析时间为52h。形成交联透明质酸无颗粒凝胶膏体的判断条件为：交联透明质酸无颗粒凝胶膏体透明无气泡，看上去是流非流的膏状粘液，不会自然分层，具有稳定的等渗渗透压。试验过程：实施例一制得的凝胶膏体作为试样一，实施例二制得的凝胶膏体作为试样二。制作试样三：配制1％的氢氧化钠溶液20ml，加入1，4-丁二醇二缩水甘油醚0.2g混匀后，再加入2.0g透明质酸，搅匀后放入5℃冰箱静置16h，然后，再放入50℃的培养箱中，加热2h后，取出切成质量1cm3左右的凝胶，放入pbs缓冲液中透析7h，得到的透明质酸凝胶按质量比9:1加入未交联透明质酸溶液混匀，作为试样三。制作试样四：配制1％的氢氧化钠溶液15ml,加入1，4-丁二醇二缩水甘油醚0.16g混匀后，加入2.0g透明质酸，搅匀后放入49℃的水浴锅，加热2h后，放入冰箱静置51h，取出切成1g左右的小块，放入pbs缓冲液中，透析2次，得到的透明质酸凝胶按质量比9:1加入未交联透明质酸溶液混匀，得到的透明质酸凝胶作为试样四。将试样三和试样四按质量比9:1加入未交联透明质酸溶液，然后试样一、试样二、试样三和试样四进行灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min，再将试样一、试样二、试样三和试样四分别放入bdde(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)标准溶液，测定荧光值，绘制标准曲线，测得样品中bdde的残留值。对试样一、试样二、试样三和试样四进行动物皮内刺激实验和白兔肌腱损伤防粘连试验。试验一：准备健康白兔4只，出去脊背两侧的毛，在每只兔子的一侧注射16个点的同一种样品，注射量0.5ml,另一侧空白对比。备注：试样三和试样四的制备、bdde残留检测、皮内反应参照专利公布号cn103146003a指导下进行。参照yy/t0962-2014标准，检测试样一、试样二、试样三和试样四的溶胀度，透明质酸凝胶保留了透明质酸钠与水亲和的性质，与软组织填充修复效果有直接关联。交联透明质酸的饱和水凝胶的含水量多少与交联透明质酸的密度(即交联透明质酸凝胶三维网格的大小)呈正相关。溶胀度是评价交联透明质酸凝胶的结构的量化指标。测试过中，各试样在80℃的温度下烘干至恒重时，滴加水至膨胀后，分别测得烘干后质量m1与膨胀后质量m2。通过公式q＝(m2-m1)/m1计算其溶胀度，q为溶胀度。样品实例一实例三实例三实例四溶胀度45472719试验二：准备健康白兔四只，首先注射麻醉，再用尖刀割后趾纵向肌腱。取直线交联透明质酸无颗粒膏体于肌腱损伤处，再进行包扎，为a例。非修饰透明质酸凝胶涂于损伤处，为b例。修饰透明质酸凝胶涂于肌腱损伤处，为c例。不作任何处理，为d例。一周后，1.观察和测量白兔趾间关节活动度，a例优于b例、c例和d例。2.观察防粘连效果：a例有一层薄隔离带形成，可有效的防止粘连b例已完全吸收及肌腱周围有黏液c例有疏松的黏液样在损伤肌腱周围d例有组织增生，可看见粘连形成通过上述实施例，本发明的目的已经被完全有效的达到了。熟悉该项技术的人士应该明白本发明包括但不限上面具体实施方式中描述的内容。任何不偏离本发明的修改都将包括在权利要求书的范围中。当前第1页12