铜绿丽金龟内参基因及应用的制作方法

技术特征：

1.一种铜绿丽金龟内参基因，其特征在于，所述内参基因为核糖体蛋白L23(RPL23)、ADP核糖基化因子6(ARF6)和核糖体蛋白L3(RPL3)；其中RPL23的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示，ARF6的核苷酸序列表如SEQ ID NO:2所示，RPL3的核苷酸序列表如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的铜绿丽金龟内参基因，其特征在于，所述内参基因序列由转录组测序获得，并进行验证，验证方法如下：以铜绿丽金龟成虫全身总RNA反转录获得的cDNA为模板，以如下引物对进行PCR扩增并测序；

内参基因RPL23对应的引物对为：正向引物5'-CTAAGAGAGGACGTGGTGGT-3'，反向引物5'-GTTACGCAAAAGTCCCCCA-3'；

内参基因ARF6对应的引物对为：正向引物5'-ACCATCTCCAGTTGTAGCAC-3'，反向引物5'-GGCAACAAGGAGATGAGGAT-3'；

内参基因RPL3对应的引物对为：正向引物5'-CCATAATATGAGCCTTCTTC-3'，反向引物5'-TGTCTCATCGTAAATTCAGC-3'。

3.根据权利要求2所述的铜绿丽金龟内参基因，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃下延伸8min。

4.权利要求1所述的铜绿丽金龟内参基因，其特征在于，所述内参基因RPL23、ARF6和RPL3在分析不同组织部位及不同发育时期基因表达模式的实时荧光定量PCR实验中作为内参基因。

5.一种实时荧光定量PCR引物，其特征在于，以权利要求1所述的内参基因核苷酸序列为基础，利用PrimerPremier5.0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；

内参基因RPL23的实时荧光定量PCR引物为：正向引物5'-GGTTCCGCTGGAGCCAAGTTC-3'，反向引物5'-CCTGCCGCTGGTAGACGATTC-3'；

内参基因ARF6的实时荧光定量PCR引物为：正向引物5'-ATATTCGTTGTGGACTGTGCTG-3'，反向引物5'-GCTTCATCGCCTCGGGTAG-3'；

内参基因RPL3的实时荧光定量PCR引物为：正向引物5'-AAGAAGAGATCCCAGCGACATC-3'，反向引物5'-TGCCAGCCTTGTATCCTATAAACG-3'。

6.根据权利要求5所述的实时荧光定量PCR引物，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃10s，58℃30s，共40个循环；58℃到95℃，每个循环上升0.5℃。