本发明涉及生物医学
技术领域：
，具体而言，涉及一种胎儿游离核酸浓度的检测方法及试剂盒。
背景技术：
：已有研究发现孕妇的血浆游离核酸中含有微量的胎儿游离核酸，胎儿游离核酸主要来源于胎盘，目前被广泛应用于无创产前染色体非整倍体检测。一般要求胎儿游离核酸浓度大于5％，检测灵敏度达到99％以上。若胎儿游离核酸浓度低于5％，则可能出现假阴性结果，导致18、21或13三体胎儿被漏检。因此，胎儿游离核酸浓度是影响无创产前染色体非整倍体检测准确性的一个关键因素，准确定量胎儿游离核酸浓度有利于辅助发现假阳性，提升无创产前检测结果的准确性。现有的胎儿游离核酸浓度定量方法主要是根据SRY基因(Y染色体特异基因)或RASSF1A基因(胎儿核酸中该基因被甲基化)与内参基因的相对定量结果计算胎儿游离核酸浓度。另外，也有报道利用高通量测序检测Y染色体或SNP位点进行定量的方法。根据SRY基因定量或高通量测序Y染色体reads定量的方法都是利用男胎的特有核酸片段与母体核酸区分开，但是只适用于怀男胎的孕妇，应用范围有限。根据RASSF1A基因定量的方法是利用该基因在胎儿中被甲基化但在母体中没有甲基化的特点区分胎儿核酸和母体核酸，该方法适用于男胎和女胎，具有广泛的适用性。但是实验中的酶处理对cffDNA有损伤，实验操作也较复杂，难以满足大样本量的检测。根据SNP位点定量的方法的技术应用平台包括荧光定量PCR、质谱和高通量测序，利用多态性位点在母亲和胎儿中基因型不一致定量胎儿游离核酸浓度，适用于男胎和女胎。一般要检测大量的SNP位点，成本投入高，结果分析难度大。技术实现要素：本发明旨在提供一种胎儿游离核酸浓度的检测方法及试剂盒，以解决现有技术中通过SNP位点检测胎儿游离核酸浓度成本高、分析难度大的技术问题。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种胎儿游离核酸浓度的检测方法。该检测方法包括以下步骤：通过29个特定SNP位点的定量检测确定胎儿游离核酸浓度，其中，29个特定SNP位点为：chr1:42353344、chr1:66731182、chr2:238668802、chr2:45258427、chr3:57139833、chr3:59488340、chr4:54352768、chr5:8410917、chr5:139514964、chr6:134792926、chr7:41782208、chr8:133367096、chr8:72606485、chr9:32432565、chr10:64525547、chr10:21307586、chr10:49524715、chr11:10399977、chr12:26809316、chr13:40596928、chr14:77236380、chr15:67407899、chr16:57445376、chr17:69428504、chr18:36224766、chr20:22957249、chr21:27426823、chr22:33279447、和chrX:36297113。进一步地，利用多重PCR引物对29个特定SNP位点进行扩增。进一步地，29对多重PCR引物在一个反应中完成对29个特定SNP位点的扩增。进一步地，利用多重PCR引物上的分子标签直接标记原始核酸模板，发现和纠正PCR扩增引入的突变。进一步地，多重PCR引物为：SEQIDNO：1～SEQIDNO：58所示的引物。进一步地，当母亲的基因型是野生纯合型时，胎儿的基因型是突变杂合型，胎儿核酸浓度等于突变reads频率的两倍；当母亲的基因型是突变纯合型时，胎儿的基因型是突变杂合型，胎儿核酸浓度等于1-突变reads频率的结果的两倍；当母亲的基因型是突变杂合型时，胎儿的基因型是野生纯合型，胎儿核酸浓度等于0.5-突变reads频率的结果的两倍；当母亲的基因型是突变杂合型时，胎儿的基因型是突变纯合型，胎儿核酸浓度等于突变reads频率-0.5的结果的两倍。根据本发明的另一方面，提供了一种胎儿游离核酸浓度的检测试剂盒。该试剂盒包括：用于定量检测29个特定SNP位点的试剂，其中，29个特定SNP位点为：chr1:42353344、chr1:66731182、chr2:238668802、chr2:45258427、chr3:57139833、chr3:59488340、chr4:54352768、chr5:8410917、chr5:139514964、chr6:134792926、chr7:41782208、chr8:133367096、chr8:72606485、chr9:32432565、chr10:64525547、chr10:21307586、chr10:49524715、chr11:10399977、chr12:26809316、chr13:40596928、chr14:77236380、chr15:67407899、chr16:57445376、chr17:69428504、chr18:36224766、chr20:22957249、chr21:27426823、chr22:33279447、和chrX:36297113。进一步地，试剂包括29对多重PCR引物。进一步地，多重PCR引物具有分子标签能够标记原始核酸模板。进一步地，多重PCR引物为SEQIDNO：1～SEQIDNO：58所示的引物。应用本发明的技术方案，利用中国人群数据筛选出的适用于中国孕妇的SNP位点，次等位基因频率高，有更高的概率出现母亲与胎儿不一致的情况，可操作性强，重复性稳定，准确率高，另外，由于本发明的技术方案中仅检测29个SNP位点，远远少于现有技术中SNP位点的检测数量，因此，检测成本和分析难度得到了极大的降低。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1示出了panelV2测试值与理论值具有高度一致性的结果图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。针对现有技术中通过SNP位点检测胎儿游离核酸浓度成本高、分析难度大的技术问题，本发明的发明人提出了下列技术方案。本发明的发明构思如下：通过大规模数据筛选和验证，找到适用于中国孕妇的SNP位点，并利用多重PCR引物将多个位点的引物放在一个反应中完成，同时利用引物上的分子标签直接标记原始核酸模板，发现和纠正PCR扩增引入的突变，使得SNP位点的基因频率检测结果更精确，提高胎儿游离核酸浓度定量的准确性。首先，位点筛选与引物设计如下：由于中国人与欧美人在基因组水平上存在一定的种群差异，因此所查文献中的SNP位点未必全部适用于中国人群。因此本发明的发明人收集了近万例中国孕妇的无创产前筛查商业样本，将其测序数据合并，使用bwa+picardtools+GATK检出全基因组范围的SNP变异。然后对检出的中国人群特有的SNP位点按照如下的标准进行筛选：(1)SNP位点的AF(AlleleFrequency)要尽可能接近50％，因此仅保留AF在48％～52％之间的SNP位点；(2)剔除落在参考基因组上重复区域(repeatregion)里的SNP位点；(3)剔除落在DGV数据库中常见微缺微重区域的SNP位点；(4)将SNP位点上下游各100bp的片段比对到参考基因组，剔除能map到参考基因组上多个位置的；(5)对于落在外显子区域的SNP位点，仅保留上下游各100bp的片段的GC含量在0.4～0.6之间的SNP位点；(6)对于落在内含子区域的SNP位点，仅保留上下游各100bp的片段的GC含量在0.45～0.55之间的SNP位点；按照上述标准从中国人群测序数据中筛选了1082个SNP位点，然后进行引物设计和筛选。按照严格的参数设计引物，设计上的SNP位点数为868个。针对868对引物按照如下标准再进行筛选：(1)相邻的两个SNP位点之间的距离大于200Kb；(2)调整每条染色体上的SNP位点数量使其分布均匀，数量与染色体大小成正比。分配等比例数量的SNP位点，使相邻SNP位点的距离最大化，最终距离为1170k(两相邻位点之间的距离至少为1170k)。经引物设计和筛选，从1082个SNP位点中保留了548个。经多重PCR引物设计与合成，最终将548对引物混合到一个反应管中，形成panelV1。panelV1引物合成与测试为了测试panelV1的表现并进一步筛选数据表现良好的SNP位点，第一批实验先对3例样本各重复10次实验，统计分析548个SNP位点的扩增效率、重复性和准确性等。第二批实验测试100例不同的样本，统计分析SNP基因型的分布情况。两批实验的结果筛选标准如下：(1)根据548个SNP位点的测序深度统计四分位数，剔除从小到大排列的前25％和后25％的位点，保留第一四分位数(25％)和第三四分位数(75％)之间的SNP位点。取每次实验保留的274个SNP位点的交集，共筛选出268个SNP位点。(2)根据每个样本的SNP位点基因分型结果，分三组统计变异reads的频率，即该位点的突变reads/总reads。第一组为0/0(野生纯合型)，变异reads频率理论值为0，保留测试结果小于0.25％，且10次重复的标准偏差小于0.25％的SNP位点；第二组为0/1(突变杂合型)，变异reads频率理论值为50％，保留测试结果介于49.5％-50.5％，且标准偏差小于0.25％的SNP位点；第三组为1/1(突变纯合型)，变异reads频率理论值为100％，保留测试结果大于99.5％，且标准偏差小于0.25％的SNP位点。(3)每个SNP位点的三种基因型在100例不同样本中出现至少2种，且满足(2)的基因型变异reads频率和标准偏差的要求，最终筛选出29个SNP位点，即chr1:42353344、chr1:66731182、chr2:238668802、chr2:45258427、chr3:57139833、chr3:59488340、chr4:54352768、chr5:8410917、chr5:139514964、chr6:134792926、chr7:41782208、chr8:133367096、chr8:72606485、chr9:32432565、chr10:64525547、chr10:21307586、chr10:49524715、chr11:10399977、chr12:26809316、chr13:40596928、chr14:77236380、chr15:67407899、chr16:57445376、chr17:69428504、chr18:36224766、chr20:22957249、chr21:27426823、chr22:33279447、和chrX:36297113。基于此发现，根据本发明一种典型的实施方式，提供一种胎儿游离核酸浓度的检测方法。该检测方法包括以下步骤：通过29个特定SNP位点的定量检测确定胎儿游离核酸浓度，其中，29个特定SNP位点为：chr1:42353344、chr1:66731182、chr2:238668802、chr2:45258427、chr3:57139833、chr3:59488340、chr4:54352768、chr5:8410917、chr5:139514964、chr6:134792926、chr7:41782208、chr8:133367096、chr8:72606485、chr9:32432565、chr10:64525547、chr10:21307586、chr10:49524715、chr11:10399977、chr12:26809316、chr13:40596928、chr14:77236380、chr15:67407899、chr16:57445376、chr17:69428504、chr18:36224766、chr20:22957249、chr21:27426823、chr22:33279447、和chrX:36297113。应用本发明的技术方案，利用中国人群数据筛选出的适用于中国孕妇的SNP位点，次等位基因频率高，有更高的概率出现母亲与胎儿不一致的情况，可操作性强，重复性稳定，准确率高，另外，由于本发明的技术方案中仅检测29个SNP位点，远远少于现有技术中SNP位点的检测数量，因此，检测成本和分析难度得到了极大的降低。多重PCR引物对SNP位点检测灵敏度高，优选的，利用多重PCR引物对29个特定SNP位点进行扩增。为了方便操作的执行及降低检测成本，优选的，29对多重PCR引物在一个反应中完成对29个特定SNP位点的扩增。为了利用上述29个SNP位点精确计算胎儿核酸浓度，在panelV1的引物上额外设计12bp随机分子标签序列，形成新的引物混合物panelV2。利用PanelV2能标记原始核酸模板，经过文库扩增和测序后，来源于同一个原始模板的reads可以通过同一分子标签进行聚类分析，从而发现PCR扩增引入的突变，提高SNP位点突变reads频率的准确性。根据本发明一种典型的实施方式，利用多重PCR引物上的分子标签直接标记原始核酸模板，从而发现和纠正由聚合酶链式反应产生的扩增错误，降低背景噪音以提高reads频率计算的准确性。其中评估聚合酶链式反应的错配率可采用本领域常规技术手段实现。优选的，多重PCR引物为：SEQIDNO：1～SEQIDNO：58所示的引物，具体如表1所示。表1当然，利用其他技术平台如荧光定量PCR、质谱和数字PCR对这29个位点进行检测，同样能实现发明目的。孕妇及其胎儿是具有亲缘关系的两个个体，通过SNP位点定量胎儿核酸浓度的原理是：寻找胎儿和母亲基因型不一致的SNP位点：1.当母亲的基因型是0/0(野生纯合型)时，胎儿的基因型是0/1(突变杂合型)，胎儿核酸浓度等于突变reads频率的两倍；2.当母亲的基因型是1/1(突变纯合型)时，胎儿的基因型是0/1(突变杂合型)，胎儿核酸浓度等于(1-突变reads频率)的两倍；3.当母亲的基因型是0/1(突变杂合型)时，胎儿的基因型是0/0(野生纯合型)，胎儿核酸浓度等于(0.5-突变reads频率)的两倍；4.当母亲的基因型是0/1(突变杂合型)时，胎儿的基因型是1/1(突变纯合型)，胎儿核酸浓度等于(突变reads频率-0.5)的两倍。换句话说就是，当母亲的基因型是野生纯合型时，胎儿的基因型是突变杂合型，胎儿核酸浓度等于突变reads频率的两倍；当母亲的基因型是突变纯合型时，胎儿的基因型是突变杂合型，胎儿核酸浓度等于1-突变reads频率的结果的两倍；当母亲的基因型是突变杂合型时，胎儿的基因型是野生纯合型，胎儿核酸浓度等于0.5-突变reads频率的结果的两倍；当母亲的基因型是突变杂合型时，胎儿的基因型是突变纯合型，胎儿核酸浓度等于突变reads频率-0.5的结果的两倍。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种胎儿游离核酸浓度的检测试剂盒。该试剂盒包括：用于定量检测29个特定SNP位点的试剂，其中，29个特定SNP位点为：chr1:42353344、chr1:66731182、chr2:238668802、chr2:45258427、chr3:57139833、chr3:59488340、chr4:54352768、chr5:8410917、chr5:139514964、chr6:134792926、chr7:41782208、chr8:133367096、chr8:72606485、chr9:32432565、chr10:64525547、chr10:21307586、chr10:49524715、chr11:10399977、chr12:26809316、chr13:40596928、chr14:77236380、chr15:67407899、chr16:57445376、chr17:69428504、chr18:36224766、chr20:22957249、chr21:27426823、chr22:33279447、和chrX:36297113。应用本发明的技术方案，利用中国人群数据筛选出的适用于中国孕妇的SNP位点，次等位基因频率高，有更高的概率出现母亲与胎儿不一致的情况，可操作性强，重复性稳定，准确率高，另外，由于本发明的技术方案中仅检测29个SNP位点，远远少于现有技术中SNP位点的检测数量，因此，检测成本和分析难度得到了极大的降低。多重PCR引物对SNP位点检测灵敏度高，优选的试剂包括29对多重PCR引物。更优选的，利用多重PCR引物上的分子标签直接标记原始核酸模板，从而发现和纠正由聚合酶链式反应产生的扩增错误，降低背景噪音以提高reads频率计算的准确性。其中评估聚合酶链式反应的错配率可采用本领域常规技术手段实现。优选的，多重PCR引物为：SEQIDNO：1～SEQIDNO：58所示的引物，具体如表1所示。PanelV2测试为了验证panelV2定量胎儿核酸浓度的性能，第一批实验利用6个胎儿核酸模拟样本进行测试。模拟样本是将母亲及其孩子的核酸以不同比例混合后打断到游离核酸的大小，孩子的核酸浓度预期理论值分别是40％，20％，10％，5％，2.5％和1％。实验结果显示，panelV2测试值与理论值具有高度一致性，结果见图1。第二批实验利用20名怀男胎孕妇的血浆同时进行panelV2检测和SRY基因检测，分别计算胎儿核酸浓度，结果两者的胎儿核酸浓度也具有较高的一致性，结果见表2。表2样本编号SRY定量胎儿游离核酸浓度本发明panelV2定量胎儿游离核酸浓度RBNP0010.07220.0815RBNP0020.08640.1025RBNP0030.09520.0921RBNP0040.06560.076RBNP0050.05980.07RBNP0060.1220.145RBNP0070.1160.134RBNP0080.1860.196RBNP0090.09830.0842RBNP0100.1560.165RBNP0110.2120.201RBNP0120.1640.185RBNP0130.07810.093RBNP0140.06950.0831RBNP0150.1120.132RBNP0160.09280.115RBNP0170.1650.155RBNP0180.1430.169RBNP0190.1630.145RBNP0200.08530.102从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：基因频率检测结果精确，胎儿游离核酸浓度定量的准确性。该方法大大降低了检测成本，并简化结果分析。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>北京科迅生物技术有限公司<120>胎儿游离核酸浓度的检测方法及试剂盒<130>PN79646KXSW<141>2017-11-09<160>58<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>85<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(85)<223>引物220><220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>1ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggccagcacatgtggcttctacct85<210>2<211>58<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(58)<223>引物<400>2gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttctgggcacttggttttaacagag58<210>3<211>88<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(88)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>3ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggatgatgtagaatgacgtcccagttc88<210>4<211>58<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(58)<223>引物<400>4gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgatctctccacttcagtgaacggt58<210>5<211>86<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(86)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>5ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggccaatggagagacttccgacacc86<210>6<211>56<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(56)<223>引物<400>6gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcctgtcgacttgagggcattta56<210>7<211>87<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(87)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>7ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggtctctctgtggcaatgagaactca87<210>8<211>58<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(58)<223>引物<400>8gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccagacctctttccaagacacatt58<210>9<211>87<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(87)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>9ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggcactgagagccaacaaagcctaat87<210>10<211>55<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(55)<223>引物<400>10gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgtaagcaggtgagctgctgg55<210>11<211>88<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(88)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>11ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggagagattgcaaagtgggttgtttct88<210>12<211>57<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(57)<223>引物<400>12gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcagcaatttgtacatgggtgcaa57<210>13<211>84<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(84)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>13ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cgggcagggacagtcagatgggag84<210>14<211>58<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(58)<223>引物<400>14gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgatggttcctatttcctcagccag58<210>15<211>88<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(88)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>15ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggaaagatggtagaagactcctcggat88<210>16<211>59<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(59)<223>引物<400>16gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctttcccatctggccattgatattgtg59<210>17<211>84<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(84)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>17ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggattcagcaggtacttggggcc84<210>18<211>55<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(55)<223>引物<400>18gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgagtgagtgcccagcaaacca55<210>19<211>86<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(86)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>19ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cgggagctgaggactgcatatccaga86<210>20<211>55<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(55)<223>引物<400>20gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctggtggctgtgtgcactctagc55<210>21<211>88<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(88)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>21ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggttgtcactgtctgttttcctctttt88<210>22<211>55<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(55)<223>引物<400>22gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcgggatggcagtgacagagtt55<210>23<211>87<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(87)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>23ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggtggccagtctcatttcctgtactg87<210>24<211>55<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(55)<223>引物<400>24gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaacccatccccagaaccagtg55<210>25<211>88<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(88)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>25ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggatggtgaaaacactgttgtctaggt88<210>26<211>56<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(56)<223>引物<400>26gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctgagctccaaggcctcattta56<210>27<211>86<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(86)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>27ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cgggggagatggtgttagggagcttg86<210>28<211>58<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(58)<223>引物<400>28gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttggtttgaattctgtccacaggtc58<210>29<211>85<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(85)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>29ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggctcaccctccctctgtgaaagt85<210>30<211>57<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(57)<223>引物<400>30gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgccttttcagcagtggtaacta57<210>31<211>87<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(87)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>31ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggtggactgagaagtgatcccaagtc87<210>32<211>57<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(57)<223>引物<400>32gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctctcagtggcttgggattgaat57<210>33<211>88<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(88)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>33ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggagggtcttaagcttggaaaaatgca88<210>34<211>58<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(58)<223>引物<400>34gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcccaatccagttgccaaatcaaac58<210>35<211>85<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(85)<223>引物<220><221>misc_feature<222>(37)..(48)<223>nisa,c,g,toru<400>35ccgacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnntttaaagagtgt60cggccaggaccaaggctttcaggtt85<210>36<211>57<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(57)<223>引物<400>36gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctatttccaccactcaagttcccca57<210>37<211>85<212>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