本发明涉及一种食品检测领域，具体的，本发明涉及一种肉制品中动物源性成分的鉴定方法及鉴定试剂盒。
背景技术：
：近年来，国内外市场上的肉及肉制品掺假事件屡屡发生，这些不法行为不但破坏了公平贸易，给消费者带来经济损失，更重要的是也引起了食品过敏、宗教信仰、食品安全等方面担忧和恐慌。目前，人们主要采用聚合酶链式反应(PCR技术)特别是所谓的实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术进行肉及肉制品中动物源性(包括猪源性)成分的鉴定，以打击肉及肉制品中的掺假行为。我国已颁布的食品及饲料中动物源性成分鉴别的国家标准和行业标准主要采用(Real-time)PCR技术，具有准确、高效、快速、灵敏的特点，并已经形成了成熟的方法体系。然而，PCR技术是一种变温核酸扩增技术，其反应必须经过变性、退火、延伸三个步骤的多次(约40次)循环，每个步骤均在不同的温度下进行，需要复杂的温度循环控制设备，必须在专业的实验室才可以实现，一定程度上限制了它的应用和推广，难以满足现场快速检测的需要。技术实现要素：基于此，本发明在于克服现有技术的缺陷，提供一种新型的肉制品中动物源性成分的鉴定方法，所述的鉴定方法是采用实时荧光重组酶聚合酶扩增(realtimeRPA)技术对肉制品中动物源性成分进行鉴定。本发明所述的实时荧光重组酶聚合酶扩增技术反应灵敏、快速，无需依赖昂贵、复杂的温度循环控制设备，能够满足食品检测现场快速检测的需求。其技术方案如下：一种肉制品中动物源性成分的鉴定方法，采用实时荧光重组酶聚合酶扩增技术，所述鉴定方法包括如下步骤：S1、制备待测样品；S2、从所述待测样品中提取总DNA；S3、引物、探针的设计筛选：根据目标动物的基因组DNA序列设计引物和探针；S4、扩增试剂准备：将步骤S3设计的引物和探针与缓冲溶液、模板DNA、无菌双蒸水混合，得到混合液，再与冻干重组酶聚合酶混合均匀，其中，所述模板DNA包括：阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，阳性对照组用目标动物的基因组DNA作为模板DNA，阴性对照组用其他动物的基因组DNA作为模板DNA，空白对照组用去离子水替代基因组DNA作为模板DNA；S5、实时荧光重组酶聚合酶扩增：进行实时荧光重组酶聚合酶扩增反应，获取阳性对照组、阴性对照组和空白对照组的实时荧光强度曲线，验证所述荧光重组酶聚合酶扩增技术的有效性；S6、结果鉴定：将待测样品的总DNA、阳性对照组的模板DNA在相同条件下进行实时荧光重组酶聚合酶扩增反应，得到结果。本发明提供了一套利用实时荧光重组酶聚合酶扩增技术进行肉制品中动物源性成分鉴定的方法，所述方法是根据目标动物的基因组DNA序列设计引物和探针，再应用设计合成好的引物和探针进行实时荧光重组酶聚合酶扩增，以确定所设计引物和探针的有效性并筛选出较优的引物和探针。然后分别以待测样品的基因组DNA、阳性对照组的基因组DNA为扩增模板，采用筛选出的引物和探针，在相同条件下进行实时荧光重组酶聚合酶扩增反应，根据待测样品、阳性对照组的实时荧光强度曲线的走势得知样品中是否含有目标动物成分。在其中一个实施例中，所述目标动物为猪。在其中一个实施例中，所述目标动物的基因组DNA序列是猪细胞色素b的基因序列。在其中一个实施例中，所述引物、探针的设计筛选为：根据TwistDX公司总结的设计Real-timeRPA反应引物和探针的一般原则以及猪细胞色素b的基因序列进行引物和探针的初步设计，进行探针筛选时将探针的位置设计在猪细胞色素b的DNA序列的中间位置，进行引物筛选时先固定一个上游引物分别配对下游引物进行RPA反应，根据荧光信号强弱筛选出最优下游引物，然后用选定的最优下游引物筛选出最优的上游引物，从而得到最佳的上、下游引物组合。对于RPA扩增，探针相对于引物是序列不敏感的，因此将探针的位置尽量可能的设计在DNA序列(1140bp)的中间位置，以便于不同的上、下游引物组合可共享探针。在其中一个实施例中，本发明共设计了上、下游引物各三个和一个探针，将设计好的引物和探针交由专业生物技术公司进行合成。在其中一个实施例中，TwistDX公司总结的设计Real-timeRPA反应引物和探针的一般原则为：引物长度应该在30～35bp之间，GC含量应在30～70％之间，5’端前3～5个核苷酸应避免有连续的鸟嘌呤(G)，3’端最后3个核苷酸最好是鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)，引物内部不应有较长的单一核苷酸重复或者小的重复序列，引物自身和引物之间不易形成二级结构或者二聚体，理想的扩增产物应该在100～200bp之间；探针的长度应在46～52bp之间，是扩增子(Amplicon)的同源寡聚核苷酸，其间嵌有一个碱基类似物(THF或‘dSpacer’)以代替目标序列中的一个碱基，一个标记了荧光集团的脱氧胸腺嘧啶(dT-fluorophore)和另一个标记了淬灭基团的脱氧胸腺嘧啶(dT-quencher)(代替相应序列中的T)分别位于THF的两侧，这两个dT碱基之间的距离不应超过6bp。而且，THF的位置应该在探针5’端至少30bp处，距离3’端的位置至少应该有15bp。另外，探针3’端应经过适当的修饰(例如：C3-spacer、磷酸、biotin-TEG或氨基)，以阻断任何可能的聚合酶的延伸反应。在其中一个实施例中，所述引物的序列为：上游引物：SEQIDNO.1(5’-CTACGGATCCTATATATTCCTAGAAACATG-3’)，下游引物：SEQIDNO.2(5’-GATATAAGGGATAGCTGATAGTAGATTTGTG-3’)。在其中一个实施例中，所述探针的序列为：SEQIDNO.3(CATAGGCTA-CGTCCTGCCCTGAGGACAAATA(FAM-dT)(dSpacer)A-(BHQ1-dT)TCTGAGGAGCTACGG(C3-Spacer)，其中，FAM-dT表示标记了FAM荧光基团(6-羧基荧光素)的胸腺嘧啶(代替相应序列中的一个胸腺嘧啶)；dSpacer表示碱基类似物(代替相应序列中的一个碱基)；BHQ1-dT表示标记了荧光BHQ1淬灭基团的胸腺嘧啶(代替相应序列中的一个胸腺嘧啶)；C3-Spacer表示C3间臂。在其中一个实施例中，所述混合液包括：上游引物：200～600nM；下游引物：200～600nM；探针：50～150nM。在其中一个实施例中，所述混合液为：在其中一个实施例中，所述扩增试剂准备为：所述混合液在离心管中混合均匀，用微量移液枪将反应体系转移至装有冻干重组酶聚合酶的微量离心管，溶解混合均匀。在其中一个实施例中，所述实时荧光重组酶聚合酶扩增为：加入醋酸镁溶液至反应离心管中使其终浓度为12～21mM，启动反应，反应条件为：反应时间：10min～25min；反应温度：37～40℃之间恒温。在其中一个实施例中，所述实时荧光重组酶聚合酶扩增为：加入3.6μL浓度为280mM的醋酸镁溶液至反应离心管中，启动反应，反应条件为：反应时间：15min；反应温度：37～40℃之间恒温。在其中一个实施例中，所述制备待测样品为：用组织捣碎机将待测样品均质成粉状或糜状，或者将所述待测样品切成小块在液氮冷冻的情况下研磨至粉状。具体的，当所述待测样品为干燥固体时，用组织捣碎机将待测样品均质成粉状或糜状；当所述待测样品为湿状时，将所述待测样品切成小块在液氮冷冻的情况下研磨至粉状。在其中一个实施例中，从所述待测样品中提取总DNA：采用商品化试剂盒从待测样品中提取总DNA。在其中一个实施例中，所述结果鉴定：将待测样品的总DNA、阳性对照组的模板DNA、阴性对照组的模板DNA和空白对照组的模板DNA在相同条件下进行实时荧光重组酶聚合酶扩增反应，反应结束后，若待测样品与阳性对照组的实时荧光强度曲线均出现典型的S形扩增曲线，同时阴性对照组、空白对照组的实时荧光强度曲线未出现典型的S形扩增曲线，则鉴定结果为所述待测样品中存在目标动物的源性成分。此外，还有必要提供一种肉制品中动物源性成分的鉴定试剂盒，其包括所述引物和探针，所述引物的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述探针的序列如SEQIDNO.3所示。使用本发明所述的试剂盒，可以使猪细胞色素b的DNA进行实时荧光重组酶聚合酶扩增，从而可鉴定出所述待测样品中是否存在猪肉成分。本发明的有益效果在于：本发明采用实时荧光重组酶聚合酶扩增技术对动物源性成分进行鉴定，该技术反应灵敏，鉴定快速，无需依赖昂贵、复杂的设备，能够满足食品检测现场快速检测的需求，具有可观的实用价值和应用推广前景。附图说明图1为实施例1的荧光RPA反应扩增曲线。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。以下实施例是对猪肉丸中的猪源性成分进行鉴定，可理解，在其他实施例中，对于其他肉制品中猪源性成分或其他动物源性成分的鉴定可按照类似的鉴定方法进行，在此不再赘述。实施例1一种猪肉丸中猪源性成分的鉴定方法，采用实时荧光重组酶聚合酶扩增技术，所述鉴定方法如下：S1、制备待测样品。在本实施例中，可先将猪肉丸切成小块在液氮冷冻的情况下研磨至粉状。S2、从所述待测样品中提取总DNA。在本实施例中，采用商品化试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)生产的基因组DNA提取试剂盒(柱式法))从待测样品中提取总DNA。S3、引物、探针的设计筛选：根据TwistDX公司总结的设计Real-timeRPA反应引物和探针的一般原则以及猪细胞色素b的基因序列进行引物和探针的初步设计，进行探针筛选时将探针的位置设计在猪细胞色素b的DNA序列的中间位置，进行引物筛选时先固定一个上游引物分别配对下游引物进行RPA反应，根据荧光信号强弱筛选出最优下游引物，然后用选定的最优下游引物筛选出最优的上游引物，从而得到最佳的上、下游引物组合，所筛选出的引物和探针见表1，具体参见序列表。表1猪源性成分RPA扩增应用的引物和探针S4、扩增试剂准备：采用英国TwistDxInc.公司生产的exo重组酶聚合酶扩增试剂盒，按照表2在1.5mL离心管中配置反应混合液，轻微振荡混匀后，用微量移液枪将反应液转移至装有冻干重组酶聚合酶的微量离心管，溶解混匀，其中，所述模板DNA包括：阳性对照组、阴性对照组、空白对照组，所述阳性对照组用目标动物的基因组DNA作为模板DNA，所述阴性对照组用其他动物的基因组DNA作为模板DNA(本实施例中使用的是牛肉的基因组DNA作为模板DNA)，所述空白对照组用去离子水替代基因组DNA作为模板DNA。S5、实时荧光重组酶聚合酶扩增：加入3.6μL浓度为280mM的醋酸镁溶液至反应离心管中，混匀后于便携式基因扩增与荧光检测仪中启动反应；仪器条件应设置为：检测通道：FAM；反应温度：37～40℃之间恒温；反应时间：15min，获取阳性对照组、阴性对照组和空白对照组的实时荧光强度曲线。S6、结果判定：将待测样品的总DNA、阳性对照组的模板DNA、阴性对照组的模板DNA和空白对照组的的模板DNA在相同条件下进行实时荧光重组酶聚合酶扩增反应。反应结束后，若待测样品与阳性对照组的实时荧光信号均出现典型的S形扩增曲线，同时阴性对照组、空白对照组的荧光信号未出现典型的S形扩增曲线，则鉴定为所述待测样品中存在目标动物的源性成分。表2实时荧光RPA反应体系序号溶液体积(μL)1上游引物，10μM2.12下游引物，10μM2.13探针，10μM0.64缓冲溶液29.55模板DNA*1.06无菌双蒸水11.17合计46.4*阳性对照组用相应成分样品的DNA作为模板DNA，阴性对照组用不含相应成分样品的DNA作为模板，空白对照组用等体积去离子水作为模板DNA。通过上述方法进行实时荧光重组酶聚合酶扩增，实时荧光强度曲线见图1。根据图1可知，所测猪肉丸样品中，提取出的DNA的实时荧光强度与阳性对照DNA模板的扩增曲线走势相同，荧光强度随时间的变化曲线均为先缓慢增长，然后急速增长，再缓慢增长的典型S型曲线，表明检测的猪肉丸样品中所提取的DNA发生了RPA扩增反应，由此可知，该猪肉丸中含有猪肉成分。以上所述的实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述的实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。SEQUENCELISTING<110>河南广电计量检测有限公司、广州广电计量检测股份有限公司<120>肉制品中动物源性成分的鉴定方法及鉴定试剂盒<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>1ctacggatcctatatattcctagaaacatg30<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>2gatataagggatagctgatagtagatttgtg31<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>3cataggctacgtcctgccctgaggacaaata(fam-dt)(dspacer)a-(bhq1-dt)tctgaggagctacgg(c3-spacer)50当前第1页1 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