一种K-Ras基因突变检测方法及其应用与流程

本发明涉及一种K-Ras基因点突变检测方法，包括用于扩增K-Ras基因片段的引物，检测用锁核酸标记探针，及该方法在检测DNA中K-Ras基因突变比例中的应用。
背景技术：
：恶性肿瘤的发生发展往往是一个多因素多步骤的演变过程，涉及到多个癌基因的异常活化和抑癌基因的失活。其中，作为第一个从人类肿瘤细胞中分离出来的癌基因,Ras基因在恶性肿瘤的发生过程中发挥着极其重要的作用(KarnoubandWeinberg,Rasoncogenes:splitpersonalities,2008,10.1038/nrm2438)。Ras蛋白活性的有序调控是正常细胞维持接触抑制的关键。在正常细胞中，只有在生长因子结合相关受体后，Ras才会被激活；而在正常细胞向肿瘤细胞的转化过程中，往往伴随着Ras的异常活化，这通常是因Ras基因的点突变而引起的。这些点突变使得Ras蛋白不能被Ras灭活因子灭活而处于持续活化状态。在很多肿瘤细胞中都可检测到Ras基因的点突变，其中甲状腺癌中约为53％，结直肠癌约为47％，在胰腺癌中更有90％以上，且点突变几乎皆位于12，13和61密码子(MalumbresandBarbacid,RASoncogenes:thefirst30years,2003,10.1038/nrc1097；KarnoubandWeinberg,Rasoncogenes:splitpersonalities,2008,10.1038/nrm2438)。Ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——H-Ras、K-Ras和N-Ras，其中K-Ras基因的突变最为常见，且大多数突变点位于第12和13密码子。近年来，靶向Ras及其信号通路关键分子的分子靶向药物逐步开发并已广泛应用于临床治疗(Burgess,Anticancerdrugs:blockingRASeffects,2013,10.1038/nrd4033)，因此K-Ras基因突变的检测被作为肿瘤诊断和治疗预后的一项重要指标，在临床实验室中已经广泛开展，应用的方法也较多，但现有的方法存在灵敏度差、稳定性低和特异性不高等问题。现有方法及其缺陷主要如下：(1)限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)(Hatzaki,Razietal.,AmodifiedmutagenicPCR-RFLPmethodforK-rascodon12and13mutationsdetectioninNSCLCpatients,2001,10.1006/mcpr.2001.0367)。RFLP法能有效鉴别不同基因型，简便、快速，无需特殊仪器，适合于一般实验室应用及大规模临床检验检测，但灵敏度不够，且该法操作中需开盖用PCR产物进行酶切，增加了产物污染的风险造成污染。(2)单链构象多态性分析(PCR-SSCP)(Watanabe,Sawabuetal.,DetectionofK-raspointmutationsatcodon12inpurepancreaticjuiceforthediagnosisofpancreaticcancerbyPCR-RFLPanalysis,1996)。PCR-SSCP是一种利用K-Ras基因突变后DNA单链构象会发生改变，使正常和突变的单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显现出不同的带型，从而确定K-Ras野生型和突变型，该方法不需特殊设备，但对电泳的条件要求比较严格，通量较低。(3)DNA直接测序(Maekawa,Nagaokaetal.,Three-dimensionalmicroarraycomparedwithPCR-single-strandconformationpolymorphismanalysis/DNAsequencingformutationanalysisofK-rascodons12and13,2004,10.1373/clinchem.2004.032060)。DNA直接测定法可靠直观，能直接明确具体的突变类型并可检测出多位点变异，但耗时、灵敏度低，尤其在混合模板时检出率低。(4)焦磷酸测序(Poehlmann,Kuesteretal.,K-rasmutationdetectionincolorectalcancerusingthePyrosequencingtechnique,2007,10.1016/j.prp.2007.06.001)。该方法利用扩增过程中每个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷酸序列。该方法可用于少量DNA样品的检测，但需要特殊的设备和操作人员，能检测的片段长度较短。(5)扩增阻碍突变系统(ARMS/S)(Nordgard,Oltedaletal.,ComparisonofaPNAclampPCRandanARMS/ScorpionPCRassayforthedetectionofK-rasmutations,2012,10.1097/PDM.0b013e31821e59dc)。ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，并利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上对样品DNA中突变的检测。该方法灵敏度高，操作简单，但是该方法只能检测特定的已知突变，且只能检测一种突变。(6)高分辨率熔解曲线(HRM)(Jancik,Drabeketal.,AcomparisonofDirectsequencing,Pyrosequencing,Highresolutionmeltinganalysis,TheraScreenDxS,andtheK-rasStripAssayfordetectingKRASmutationsinnonsmallcelllungcarcinomas,2012,10.1186/1756-9966-31-79)。HRM是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，从荧光强度和时间曲线上来判断是否存在突变，操作比较简单，也易于进行高通量大样本检测，但对于像K-Ras基因这样主要是单个密码子点突变的情况，HRM法的特异性和灵敏度较低。总而言之，现有的方法或多或少存在灵敏度差、稳定性低和特异性不高等问题，而且检测样本主要还是肿瘤组织，获取样本对病人创伤大(尤其是晚期没法进行手术切除根治的病人)，所以发展更为快速、简便、创伤小并且特异性和灵敏度高的K-Ras基因突变检测方法，对临床肿瘤防治意义重大。高分辨率熔解曲线(HRM)分析操作比较简单，也易于进行高通量大样本检测，它主要是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况。点突变位点因不匹配会使双链DNA在升温过程中先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在点突变，而且不同突变位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同位点突变与不同基因型(Slinger,Bellfoyetal.,High-resolutionmeltingassayforthedetectionofgyrAmutationscausingquinoloneresistanceinSalmonellaentericaserovarsTyphiandParatyphi,2007,10.1016/j.diagmicrobio.2006.09.011；KristensenandHansen,PCR-basedmethodsfordetectingsingle-locusDNAmethylationbiomarkersincancerdiagnostics,prognostics,andresponsetotreatment,2009,10.1373/clinchem.2008.121962)。该检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品突变位点的分析。但对于像K-Ras基因这样主要是单个密码子点突变的情况，HRM法的特异性和灵敏度较低，不能检出突变比例低的样本。因此，如果能大大增加HRM分析的特异性和灵敏度，将极有可能推进HRM分析在K-Ras基因点突变检测中的应用前景，也能简化K-Ras基因点突变检测方法并提高检测通量。锁核酸(LNA-Lockednucleicacid)是近年来发现的新型核酸类似物，结构中β-D-呋喃核糖的2’-O、4’-C位通过缩水作用形成刚性的结构使LNA与DNA/RNA链结合的复合体具有很高的热稳定性和亲和力,LNA的掺入可以增加引物或探针的融解温度(Tm值可增加3-8℃)，但又对碱基错配敏感，一个碱基的错配可使Tm值较大幅度地下降。利用LNA的这个特点，可用于检测单个碱基的突变。近年来的研究表明肿瘤病人血浆中的游离DNA含量显著高于正常人，并已证实血浆游离DNA中可检测到与肿瘤细胞一致的基因突变(Benesova,Belsanovaetal.,Mutation-baseddetectionandmonitoringofcell-freetumorDNAinperipheralbloodofcancerpatients,2013,10.1016/j.ab.2012.06.018)，利用肿瘤患者血浆游离DNA用于基因诊断是最新的研究热点。血浆游离DNA中的肿瘤标志物检测极有可能成为肿瘤早期诊断和预后监测的一大助力，而且血浆采集方便，创伤小，与传统的利用肿瘤病理组织进行肿瘤标志物及基因点突变检测的方法相比具有无可比拟的优越性，随着进一步的深入研究和完善，必将迎来广泛的应用。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是克服现有K-Ras基因突变检测方法缺陷，提供一种更为高通量、快速、简便、创伤小并且特异性和灵敏度高的K-Ras基因突变检测方法，并基于此构建K-Ras基因突变检测试剂盒。为了实现发明目的，本发明基于LNA标记探针对碱基错配敏感的特性，联合高分辨率溶解曲线(HRM)建立了一种96孔板高通量检测，操作简单，耗时少，创伤小并且特异性和灵敏度高的K-Ras基因突变检测方法，该方法能检测K-Ras基因第12、13密码子任意已知和未知的突变。本发明采用如下技术方案：1.一对K-Ras基因扩增引物在检测人K-Ras基因突变的用途，其特征在于所述引物的序列如SEQIDNO:1所示。2.进一步地，所述的SEQIDNO:1的正向引物：5-ATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACT-3，反向引物：5-GGATCATATTCGTCCACAAAATGA-3。3.一种用于检测人K-Ras基因突变的锁核酸标记探针，其特征如SEQIDNO:2所示，其中序列的第3、5、6、8、9、10个碱基进行LNA标记。4.进一步地所述SEQIDNO:2的序列为5-TACGCCACCAGCTC-3，其中序列的第3、5、6、8、9、10个碱基进行LNA标记。5.一种混合物，包括如前所述的引物和如前所述的探针。该混合物可用于荧光定量PCR和高分辨率溶解曲线96孔板高通量检测人K-Ras基因突变。6.一种试剂盒，包括如前所述的混合物及常用的荧光定量PCR试剂和耗材，该试剂盒可用于96孔板高通量检测K-Ras基因突变。7.本发明所述的检测K-Ras基因突变试剂盒在检测K-Ras基因突变比例中的应用。8.本发明所述的检测K-Ras基因突变试剂盒在检测K-Ras基因新突变位点中的应用。本发明设计和合成PCR扩增K-Ras基因片段的引物，利用锁核酸(LNA)的特性，围绕K-Ras的第12，13密码子设计合成锁核酸标记的探针，联合荧光定量PCR和高分辨率溶解曲线(HRM)分析，不仅能检测K-Ras基因突变，还能确定K-Ras基因突变的具体比例，从而完成本发明。本发明从实验得知，不仅可以用该方法检测K-Ras第12或13位密码子突变，而且能定量分析突变的K-Ras基因占总K-Ras中的百分比。因此表明，该方法具有特异性检测DNA中K-Ras基因点突变比例的能力。作为优选，根据本发明所述的K-Ras基因突变检测为基础的检测手段和延伸应用，包括基于此方法应用于96孔板高通量检测血浆和肿瘤组织DNA中K-Ras基因突变比例及新K-Ras基因突变筛选和鉴定等。附图说明图1为实时荧光定量PCR检测K-Ras基因扩增的溶解曲线；图2为K-Ras基因PCR扩增产物的DNA凝胶电泳图；图3为实时荧光定量PCR后K-Ras基因的扩增曲线；图4为两条不同的LNA标记探针抑制野生型K-Ras基因扩增效果的示意图；图5为实时荧光定量PCR检测LNA探针作用示意图；图6为常规HRM法分析K-Ras基因突变比例示意图；图7为联合LNA探针的HRM分析检测K-Ras基因点突变比例示意图。具体实施方式下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。一对K-Ras基因PCR扩增引物，包括：SEQIDNO:1所示的DNA序列；一种LNA标记的探针，包括：SEQIDNO:2所示的DNA序列及LNA标记位点。SEQIDNO:1：正向引物：5-ATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACT-3反向引物：5-GGATCATATTCGTCCACAAAATGA-3。SEQIDNO:2：5-TACGCCACCAGCTC-3，其中序列的第3、5、6、8、9、10个碱基进行LNA标记。实施例1：K-RAS基因扩增引物筛选(1)试剂名称公司产地琼脂糖上海生工生物工程股份有限公司上海100bpDNALadder天根生化科技有限公司北京UltraSYBRMixture康为世纪生物科技有限公司北京(2)引物设计和合成：利用“primer-blast”设计多对K-RAS基因扩增引物并送生工生物工程(上海)股份有限公司。具体引物序列如下：(3)实时荧光定量PCR分析20μl体系，配比如下：QPCR反应程序如下：溶解曲线分析结果和DNA电泳结果见图1和图2，图1为96孔板实时荧光定量PCR后产物绘制的熔解曲线，每条曲线代表一对引物的扩增特异性，曲线上的每个峰代表一条扩增产物，单一的扩增峰提示引物的特异性扩增；图2为琼脂糖凝胶DNA电泳结果，显示Primer12条带特异，片段长度较短，较适合用于HRM分析。由图可知，Primer12扩增效率、特异性均较好，且PCR产物长度较短，适合行HRM分析。因此我们选用Primer12进行后续的HRM等分析。实施例2实时荧光定量PCR检测LNA-Blocker的封闭效果(1)试剂(2)MgCl2浓度优化用Primer12引物对罗氏(Roche)公司的HRM试剂“LightCycler480highresolutionmeltingmaster”在LightCycler480(Roche)机器上进行MgCl2浓度的优化。20μl体系，配比如下：PCR程序如下：结果如图3所示，在MgCl2为2mM条件下K-Ras基因的扩增效率最高(Cp值越小代表扩增效率越好)，后续选取此浓度用于96孔板高分辨率溶解曲线(HRM)分析。(3)PCR比较两条LNA-Blocker的封闭效果用Primer12引物和Promega公司的Go-TaqTMPCR试剂，利用使K-Ras野生型对照质粒为模板，进行普通PCR后琼脂糖凝胶电泳比较两条LNA标记探针对K-Ras野生型模板PCR扩增的抑制作用。其中Blocker1的序列为：5'CACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTAC3‘(其中第15，16，18，19，20位碱基进行LNA标记)。Blocker2的特征如SEQIDNO:2所示。反应体系和程序如下：20μl体系，配比如下：PCR程序如下：结果如图4所示，两条LNA-blockers都能产生封闭作用而降低Primer12扩增野生型K-Ras基因的效率，而且LNA-blocker2的效果更佳。因此我们选用LNA-blocker2进行后续实验。(4)实时荧光定量PCR检测LNA-Blocker的封闭效果用Primer12引物和罗氏(Roche)公司的HRM试剂“LightCycler480highresolutionmeltingmaster”在LightCycler480(Roche)机器上进行定量PCR分析。20μl体系，配比如下：PCR程序如下：结果如图5所示，LNA-blocker2能使K-Ras野生型对照质粒为模板的样品Ct值增加3左右，而LNA探针却对K-Ras突变型对照质粒为模板的样品Ct值没有明显改变，表明LNA探针能明显封闭野生型K-Ras基因的扩增，但对突变型K-Ras基因的扩增却没有抑制作用。实施例3HRM分析验证K-RAS基因突变①用Primer12引物和“LightCycler480highresolutionmeltingmaster”在LightCycler480(Roche)机器分析普通HRM和采用LNA-blocker2联合HRM分析K-Ras基因点突变。常规HRM分析PCR体系和程序同上。模板为：突变型与野生型对照质粒按1/0、100/1、10/1、1/1、1/10、1/10、1/100、0/1比例混合。HRM分析程序如下：95℃1min50℃1min72℃5secondscontinuousacquisitionto95℃at30acquisitionsper1℃.②用Primer12引物和“LightCycler480highresolutionmeltingmaster”在LightCycler480(Roche)机器分析常规HRM和采用LNA标记探针联合HRM分析K-Ras基因点突变。联合LNA标记探针的HRM分析PCR体系和程序如下：20μl体系，配比如下：PCR程序如下：HRM分析程序同上。结果如图(6、7)所示，表明常规96孔板HRM分析对于K-RAS基因突变比例的分辨率仅为50％左右(分辨率越低表明灵敏度越高)，而联合LNA-blocker2的96孔板HRM分析对于K-RAS基因突变比例的分辨率约为10％，远高于常规HRM分析。当前第1页1 2 3