circRAPGEF52在垂体腺瘤生物标记中应用的制作方法

本发明涉及circRAPGEF52(circRNA-RAPGEF5-2)在垂体腺瘤生物标记中的应用，具体为天然核糖核苷酸的用途技术领域。

背景技术：

垂体腺瘤(简称垂体瘤)是人类最常见的颅内肿瘤之一，约占颅内肿瘤的10％-15％。垂体瘤在组织学上属于良性肿瘤，但有些垂体瘤呈侵袭性生长，包绕或侵犯周围组织结构，该部分肿瘤手术难以彻底切除，是肿瘤复发的主要原因之一。根据垂体瘤的生物学行为可分为非侵袭性垂体瘤、侵袭性垂体瘤和垂体癌。侵袭性垂体瘤介于非侵袭性垂体瘤和垂体癌之间，其组织学形态属于良性，生物学特征却似恶性。侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤的临床表现、预后均明显不同。侵袭性垂体腺瘤的坏死、卒中、囊变发生率明显高于非侵袭性垂体腺瘤。侵袭性生长使得外科手术难以做到全切肿瘤，而常用药物溴隐停、生长抑素对这类肿瘤的疗效较差；侵袭性生长同样限制了其对放疗的敏感性，且鞍区放疗容易导致正常垂体、下丘脑及视神经等重要结构的损伤。这些因素导致侵袭性垂体腺瘤术后复发率高，肿瘤残余组织增长快。显而易见，对侵袭性垂体瘤的治疗是神经外科领域和肿瘤治疗领域面临的巨大挑战。因此，寻找与垂体腺瘤侵袭性相关的分子标记对于及时治疗和改善预后至关重要。

环状RNA是一类能够闭合成环的长链非编码RNA，在病毒、植物，古细菌中已经发现大量环状RNA的存在。近年来，Norman E Sharpless等研究组通过高通量技术与生物信息学分析推测在哺乳类动物细胞中存在大量内源性环状RNAs，并通过Northern blot、二维凝胶电泳和反向引物PCR等生化实验手段得到了证实。部分研究成果揭示了环状RNAs可以通过消耗剪切小体、结合RNA聚合酶II以及吸附miRNA等方式，参与调控细胞生物行为中核心基因的表达。研究表明，环状RNAs在多种肿瘤细胞中表达异常，提示其可能与肿瘤的发生发展密切相关。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供circRAPGEF52(circRNA-RAPGEF5-2)在垂体腺瘤生物标记中的应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：circRAPGEF52(circRNA-RAPGEF5-2)在垂体腺瘤生物标记中的应用，circRNA-RAPGEF5-2长516bp，位于人类的第7条染色体上22330793到22357656，RAPGEF5是该环状RNA的覆盖基因。

所述方法包括检测来自所述对象的垂体腺瘤组织样本中circRNA-RAPGEF5-2的量，其中较低量的circRNA-RAPGEF5-2为所述对象垂体腺瘤侵袭性强，并与所述对象预后不良可能性增加有关。

本发明还提供circRAPGEF52(circRNA-RAPGEF5-2)在垂体腺瘤生物标记中表达，所述的表达方法包含以下步骤：

步骤一、侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织RNA提取；

步骤二、总RNA反转录cDNA；

步骤三、将cDNA进行定时定量PCR检测，反应结束后检测样品中circRNA-RAPGEF5-2的PCR识别序列，然后与PCR产物序列结果进行对比可知circRNA-RAPGEF5-2在垂体腺瘤组织中进行表达。

进一步优选，所述的步骤一中侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织RNA提取方法是相同的，具体提取方法为：称取2克组织材料，加入250微升RNAiso Plus，手持电动器研磨后，转移至1.5毫升RNase-free的离心管中，12000转4℃离心10分钟，去上清200微升加入1.5毫升RNase-free的离心管中，加入1毫升RNAiso Plus新混匀后室温静置5分钟。加入200微升的氯仿，充分混匀后，室温静置3分钟，12000转4℃离心15分钟，取上清250ul，加入500微升异丙醇混匀后室温静置10分钟，12000转4℃离心10分钟。弃掉上清，加入75％乙醇，颠倒混匀后，7500转4℃离心5分钟，弃掉上清，室温静置5分钟，加入15-20微升Nuclease-Free water溶解。Nanodrop测算所得液体的OD值及浓度。

进一步优选，所述的步骤二中总RNA反转录cDNA的方法为：按照反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser说明，加入1微克RNA进行基因组DNA的去除，具体加入DNA酶、反应缓冲液及Nuclease-Free水补齐10微升反应体系，PCR仪42℃孵育2分钟，而后进行反转录，具体加入反转录所需的随机引物，缓冲液、反转录酶及Nuclease-Free水补齐20微升反应体系，PCR仪37℃孵育15分钟，85℃孵育30秒，4℃保温，将反转录产物1：10稀释，在冰上制备qPCR混合物。

作为优选，所述的步骤三中将cDNA进行定时定量PCR检测反应条件如下：首先95℃下预变性30秒，然后95℃变性5秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，40个循环，热融解阶段95℃下变性60秒，56℃下热融解30秒，95℃热融解30秒。

本发明的有益效果是：(1)提出了circRNA-RAPGEF5-2的用途。(2)本发明的研究表明异常量的circRNA-RAPGEF5-2为所述对象垂体腺瘤侵袭性强，并与所述对象预后不良可能性增加有关。(3)环状RNA具有机构稳定、丰度和组织特异性表达等特征。且circRNA-RAPGEF5-2在侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤病人组织中表达量存在差异，因此circRNA-RAPGEF5-2具有成为垂体腺瘤生物标志物的应用前景。

附图说明

图1为circRNA-RAPGEF5-2的PCR识别序列与PCR产物测序结果对比图；

图2为circRNA-RAPGEF5-2溶解曲线图；

图3为使用circRNA-RAPGEF5-2筛查引物对垂体腺瘤患者组织样本表达量筛选结果图；

图4为circRNA-RAPGEF5-2的建议结构图及引物位置图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下面结合具体实施方式对本发明进行进一步描述

实验材料，临床样品：19例垂体腺瘤(8例侵袭性垂体腺瘤，9例非侵袭性垂体腺瘤)组织样本有大连医科大学附属第二医院所提供。

试剂：circRNA-RAPGEF5-2筛查引物由Invitrogen公司合成；

RNAiso Plus(货号9109)购自Takara公司；

氯仿购自永大化学试剂(天津)有限公司；

异丙醇购自永大化学试剂(天津)有限公司；

乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；

反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(货号：RR047Q)购自Takara公司；

SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205-02)购自天根生化科技(北京)有限公司；

Nuclease-Free water(货号RT121)购自根生化科技(北京)有限公司。

2、实验方法，侵袭性或非侵袭性垂体腺瘤组织RNA提取方法为：称取2克组织材料，加入250微升RNAiso Plus，手持电动器研磨后，转移至1.5毫升RNase-free的离心管中，12000转4℃离心10分钟，去上清200微升加入1.5毫升RNase-free的离心管中，加入1毫升RNAiso Plus新混匀后室温静置5分钟。加入200微升的氯仿，充分混匀后，室温静置3分钟，12000转4℃离心15分钟，取上清250ul，加入500微升异丙醇混匀后室温静置10分钟，12000转4℃离心10分钟。弃掉上清，加入75％乙醇，颠倒混匀后，7500转4℃离心5分钟，弃掉上清，室温静置5分钟，加入15-20微升Nuclease-Free water溶解。Nanodrop测算所得液体的0D值及浓度。

3、表达量筛查，按照反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagentKit with gDNA Eraser说明，加入1微克RNA进行基因组DNA的去除，具体加入DNA酶、反应缓冲液及Nuclease-Free水补齐10微升反应体系，PCR仪42℃孵育2分钟。而后进行反转录，具体加入反转录所需的随机引物，缓冲液、反转录酶及Nuclease-Free水补齐20微升反应体系，PCR仪37℃孵育15分钟，85℃孵育30秒，4℃保温。

B.Real-Time PCR(SYRB Green法)

将反转录产物1∶10稀释，在冰上制备qPCR混合物：

将样品放入qPCR仪器中运行，程序如下

4、结果分析，参见图1和图2，图1为circRNA-RAPGEF5-2的PCR识别序列与PCR产物序列结果的对比图，图2为circRNA-RAPGEF5-2溶解曲线图。实验结果表明circRNA-RAPGEF5-2的识别序列与PCR产物测序结果对比成功，circRNA-RAPGEF5-2在垂体腺瘤组织中表达。

图3为使用circRNA-RAPGEF5-2筛查引物对垂体腺瘤患者样品表达量筛查的结果图。实验结果表明circRNA-RAPGEF5-2在侵袭性垂体腺瘤中的表达显著降低，平均表达量(Ct值)差3.436，相当于侵袭性垂体腺瘤中circRNA-RAPGEF5-2的表达量是非侵袭性垂体腺瘤中的0.092倍。如此大的表达差异给了circRNA-RAPGEF5-2作为侵袭性垂体腺瘤生物标记物的应用前景。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 大连医科大学附属第二医院

<120> circRAPGEF52在垂体腺瘤生物标记中的应用

<141> 2018-01-04

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 516

<212> DNA

<213> 人类(homo sapiens)

<400> 1

actctatcaa gaagaatatc taatccgtac cttgaacata cgccttccca gatttatgga 60

gagaattctt cttgtgcagg aagagcattg aggaatatta ttatcgttca agcagctgac 120

ctgataaagg acagagtgaa cctcaagggg ttttacagga ggagctgcgt tgggtcagag 180

ctggtagact ggcttctaga acactgtcct ttcgtccagt gcagatctat ggccatagga 240

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attcctgcca gaggtggcat ctgtgaactg tctcatcaga aaattgaaga ctccgaagaa 480

agcagtgatg aaattcttgt gcgtctaaca tctgcg 516

<210> 2

<211> 176

<212> DNA

<213> 人类(homo sapiens)

<400> 2

tctaacatct gcgactctat caagaagaat atctaatccg taccttgaac atacgccttc 60

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