一种检测急性早幼粒细胞白血病的基因探针组合物及试剂盒和应用的制作方法

文档序号：14827953发布日期：2018-06-30 09:14阅读：272来源：国知局

本发明涉及生物遗传领域，尤其是一种检测急性早幼粒细胞白血病的基因探针组合物及试剂盒和应用。

背景技术：

急性早幼粒细胞白血病(APL)是一种血液系统恶性肿瘤，是急性髓细胞白血病(AML) 的一种特殊类型，被FAB协作组定为急性髓细胞白血病M3型。其特点是骨髓及其他造血组织中有大量白血病细胞无限制地增生，并进入外周血液，而正常血细胞的制造被明显抑制，该病居年轻人恶性疾病中的首位，病因至今仍不完全清楚。而急性早幼粒细胞白血病约95％以上存在有PML/RARα融合基因。分子生物学研究表明该融合基因是APL特异的分子标志物，具有高度的特异性，是APL患者发病的重要机制。

目前各类型肿瘤的诊断都有着从细胞学诊断的水平向分子诊断水平发展的趋势，荧光原位杂交(FISH)是2O世纪8O年代初期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术，Bauman将RNA标记上荧光后作为探针进行DNA检测。其基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。荧光原位杂交具有安全、快速、灵敏度高、检测信号强、杂交特异性高、能同时显示多种颜色等优点，但目前应用于急性早幼粒细胞白血病(APL)分子诊断的FISH诊断试剂盒在国内市场上仍为空白。

随着细胞遗传学与肿瘤病因学研究的不断深入，各种研究显示染色体不稳定性即数值异常(非整倍体)和结构重排(缺失、基因扩增和易位)与肿瘤的形成和发展密切相关。包括比较基因组杂交等的急性早幼粒细胞白血病基因组异常相关研究发现包括PML和 RARα等一系列重要基因在急性早幼粒细胞白血病的发生发展中起重要作用。15号染色体长臂2区2带和17号染色体长臂2区1带易位t(15；17)(q22；q21)是急性早幼粒白血病(Acute Promyelocytic Leukemia,APL)所具有的特征型染色体畸变。该染色体改变导致位于15q22的早幼粒白血病(PML)基因与位于17q21的维甲酸受体a(RARa) 基因发生融合。PML/RARa融合基因在90％以上APL初发患者均可检出，已成为APL的特异分子标志。病毒可能是主要的致病因子，但还有许多因素如放射、化学毒物(苯等) 或药物、遗传素质等可能是致病的辅因子。相关研究已发现融合蛋白PML/RARα在APL 发病过程中具有极为重要的作用，它能阻滞正常造血分化，引起细胞分化停滞在早幼粒细胞阶段，导致早幼粒细胞白血病的发生。

APL发病凶险、死亡率高，但近年由于诱导分化剂-全反式维甲酸(ATRA)的应用，骨髓移植的开展以及三氧化二砷联合用药，使得APL成为AML中治疗效果和预后最好的一型。靶向药物ATRA可以特异性地抑制PML/RARa融合蛋白的活力，从而有效地治疗APL 白血病。检测PML/RARa融合基因，一方面可以为APL提供初始诊断，进而为ATRA靶向治疗提供用药依据。另一方面，还可用于APL微小残余白血病的监测。由于APL即使经 ATRA诱导达完全缓解后，PML/RARa仍有较高的阳性率,因此，PML/RARa融合基因阳性率还可用作预后评估的依据。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种检测急性早幼粒细胞白血病的基因探针组合物及试剂盒和应用，可以用于确定急性早幼粒细胞白血病的分子病理类型，判断病情预后，指导个体化治疗，评估临床治疗效果，监测病灶复发和转移。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：一种检测急性早幼粒细胞白血病的基因探针组合物，包括PML基因探针和RaRα基因探针。

所述PML基因探针包括RP11-8P11、RP11-243B22、RP11-161C1；所述RaRα基因探针包括RP11-58E20、RP11-48O10、RP11-465J4。

所述PML基因探针和RaRα基因探针均为经过荧光素标记的探针。

一种检测急性早幼粒细胞白血病的基因探针组合物的制备方法，包括如下步骤：

1)克隆筛选：检索UCSC genome browser，NCBI Clone Registry， EnsemblGenomeBrowser数据库分别含有PML、RaRα基因的所有细菌人工染色体BAC克隆，并对这些克隆进行筛选，选出最佳的克隆；

2)克隆培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买BAC克隆,取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇活化培养8-16小时；然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震摇培养8-16小时；对 PML、RaRα的BAC克隆用相对应的基因引物进行多聚酶链式反应扩增，用1-2％(质量浓度) 的琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析，完成待选克隆的分子鉴定；

3)基因探针的制备和鉴定：获得目的基因的克隆后，提取大量DNA，酶切DNA后采用缺口平移的方法对酶切后的DNA进行荧光素标记，再对PML和RaRα基因探针组合后进行沉淀和浓缩，将制作好的探针组合物溶解到含有50％(体积浓度)去离子甲酰胺的杂交缓冲液中，即得荧光标记探针组杂交混合液，采用正常人外周血单个核细胞甩片进行探针鉴定。

所述克隆筛选步骤中含PML基因最优的克隆，编号为RP11-8P11、RP11-243B22、 RP11-161C1；含RaRα基因最优的克隆，编号为RP11-58E20、RP11-48O10、RP11-465J4。

克隆培养和鉴定步骤中使用的引物序列为：

PML基因探针:

RP11-8P11

上游引物:CCTCCGAGTCCCACATTTAA SEQ ID NO.1

下游引物:AGGAATGCTTTGGGGACAC SEQ ID NO.2

RP11-243B22

上游引物:GACAGCACAGTCTGGAACAAAGA SEQ ID NO.3

下游引物:CGGAAGGCAGTGGAGAGTATAAA SEQ ID NO.4

RP11-161C1

上游引物:AGGGATGAGTGCTGGAGCTA SEQ ID NO.5

下游引物:AGGAAGTGGGGAACACTGTG SEQ ID NO.6

RaRα基因探针:

RP11-58E20

上游引物:TGATAACCATGCTCAGCAATG SEQ ID NO.7

下游引物:CGTTGATAACATTACTCAAGTCACA SEQ ID NO.8

RP11-48O10

上游引物:AAGCTCAGACTTGCCAGG SEQ ID NO.9

下游引物:AGGCACATTCAGTCCACTC SEQ ID NO.10

RP11-465J4

上游引物:TTGGACCTTTAAGAAACATATACCA SEQ ID NO.11

下游引物:GATAACCTTAGTAAAGCCTTGGAGC SEQ ID NO.12。

一种含有上述检测急性早幼粒细胞白血病的基因探针组合物的试剂盒。

所述试剂盒还包括杂交缓冲液，所述基因探针组合物溶解在杂交缓冲液中，即荧光标记探针组杂交混合液，PML基因探针的浓度为：4ng/μl，RaRα基因探针的浓度为:4ng/μl。

所述杂交缓冲液的组分包括质量百分比浓度为50％的去离子甲酰胺，2×SSC和0.1克/ 毫升的硫酸葡聚糖。

所述试剂盒在急性早幼粒细胞白血病荧光原位杂交检测中的应用。

本发明所具有的有益效果：

1、国际上有进口双色探针用于检测PML/RARa融合基因，然而价格昂贵。国内公司尚无药监局注册的PML/RARa探针，难于满足临床的需求。本发明提供了一种检测急性早幼粒细胞白血病的荧光原位杂交试剂盒，克服了国内市场空白。

2、本试剂盒可用于对急性早幼粒细胞白血病进行分子病理分型。

3、本发明试剂盒可直接用于中期或间期急性早幼粒细胞白血病细胞的荧光杂交法检测，而无需细胞培养和制备高质量的中期染色体片，操作大大简化。

附图说明

图1是本发明将成功制作的Green-RARα(绿色荧光素标记的RARα探针)，PF555-PML (红色荧光素标记的PML探针)，2种探针(表1)混合后对正常人外周血单个核细胞进行杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。

图2是本发明成功制备的Green-RARα，PF555-PML基因检测试剂盒对急性早幼粒细胞白血病患者骨髓细胞标本进行检测获得的图像。

具体实施方式

本发明提供了一种检测急性早幼粒细胞白血病的基因探针组合物，包括PML基因探针, RARα基因探针。

优选地，所述的基因探针组合物包括：

PML基因探针：RP11-8P11、RP11-243B22、RP11-161C1(UCSC genome browser)；

RARα基因探针：RP11-58E20、RP11-48O10、RP11-465J4(UCSC genome browser)；

上述基因探针组合物中所涉及的基因探针均为经过荧光素标记的探针。

根据本发明一个优选的实施方案，PML、RARα单个基因探针制备步骤如下：

1)、克隆筛选：检索UCSC genome browser，NCBI Clone Registry，Ensembl Genome Browser等数据库分别含PML、RARα基因的所有克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最佳的克隆；

2)、克隆培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买BAC克隆(美国Invitrogen公司), 取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇活化培养 8-16小时；然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震摇培养8-16小时；对PML、RARα的BAC克隆用相对应的基因引物进行多聚酶链式反应扩增，用1-2％的琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析，从而完成待选克隆的分子鉴定；

3)、基因探针的制备和验证：获得目的基因的克隆后，提取大量DNA，用ND-1000超微量分光光度计对质粒进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定；采用缺口平移的方法对质粒 DNA进行荧光标记，(选择最佳的荧光染料和镜检的荧光显微镜的滤光片匹配组合，使检测到的荧光信号强度最大)；对标记产物进行沉淀和浓缩；将荧光标记的探针溶于含有 50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液中，-20℃避光，储存，采用正常人外周血单个核细胞甩片进行探针鉴定。

本发明一个优越的实施方案，克隆筛选步骤中含PML基因最优的克隆，编号为 RP11-8P11、RP11-243B22、RP11-161C1(UCSC genome browser)；

本发明一个优越的实施方案，克隆筛选步骤中含RARα基因最优的克隆，编号为RP11-58E20、RP11-48O10、RP11-465J4(UCSC genome browser)；

本发明一个优越的实施方案，克隆培养和鉴定步骤中使用的PML基因引物序列为：

PML基因探针:

RP11-8P11

上游引物:CCTCCGAGTCCCACATTTAA

下游引物:AGGAATGCTTTGGGGACAC

RP11-243B22

上游引物:GACAGCACAGTCTGGAACAAAGA

下游引物:CGGAAGGCAGTGGAGAGTATAAA

RP11-161C1

上游引物:AGGGATGAGTGCTGGAGCTA

下游引物:AGGAAGTGGGGAACACTGTG

本发明一个优越的实施方案，克隆培养和鉴定步骤中使用的RARα基因引物序列为：

RARα基因探针:

RP11-58E20

上游引物:TGATAACCATGCTCAGCAATG

下游引物:CGTTGATAACATTACTCAAGTCACA

RP11-48O10

上游引物:AAGCTCAGACTTGCCAGG

下游引物:AGGCACATTCAGTCCACTC

RP11-465J4

上游引物:TTGGACCTTTAAGAAACATATACCA

下游引物:GATAACCTTAGTAAAGCCTTGGAGC

多聚酶链式反应扩增条件为：95℃预变性5分钟；(“95℃变性1分钟；60℃退火30秒， 72℃复性30秒”)循环35次；72℃延伸反应7分钟。

本发明的一个优选方法：基因探针制备过程中用EoR1酶对目的DNA进行酶切，EoR1酶的浓度为0.1单位/微升；50微升切口平移体系中脱氧核糖核酸聚合酶I的使用量为10个单位，脱氧核糖核酸酶I使用量为50纳克。

本发明一个优选方案，在将标记好荧光素的DNA进行沉淀时，加入三种人类未标记的竞争性CotDNA、ssDNA和tRNA重复序列脱氧核糖核酸，以降低杂交反应时产生的荧光背景，其中CotDNA、ssDNA和tRNA沉淀时的使用浓度均为1毫克/毫升,沉淀的体系为300微升。

本发明一个优选方案，基因探针浓缩方法为乙醇(-20℃)沉淀浓缩，最后使用杂交缓冲液溶解沉淀。

本发明一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括50％的去离子甲酰胺，2×SSC和0.1 克/毫升的硫酸葡聚糖。

本发明的另一目的是提供了一种急性早幼粒细胞白血病原位杂交检测试剂盒，包括上述基因探针组合物。

优选地，所述的试剂盒还包括杂交缓冲液。更优选地，所述基因探针组合物溶解在杂交缓冲液中，即荧光标记探针组杂交混合液，更优选地，所述PML基因探针的浓度为： 4ng/μl，RARα基因探针的浓度为:4ng/μl。

更优选地，所述杂交缓冲液的组分包括50％的去离子甲酰胺，2×SSC和0.1克/毫升的硫酸葡聚糖。

优选地，所述试剂盒还包括DAPI复染液。

优选地，所述试剂盒还包括20X SSPE洗涤液。

优选地，所述试剂盒还包括包装试剂管的塑料包装盒。

下列通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1：PML/RARα基因探针组合物的制备方法，包括如下步骤

1.克隆筛选：

通过检索UCSC genome browser，NCBI Clone Registry，Ensembl Genome Browser 等数据库分别含有PML/RARα基因的所有克隆。筛选出包含有该基因的最优克隆，PML 编号依次为：RP11-8P11、RP11-243B22、RP11-161C1；RARα编号依次为RP11-58E20、 RP11-48010、RP11-465J4。(如表1所示)

表1 PML,RaRα基因检测试剂盒基因片段标记

克隆培养和鉴定：按照克隆编号购买克隆(美国Invitrogen公司),取8微升克隆菌液加到5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇活化培养12小时；然后将菌液全部加入至450毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震摇培养12小时后收集菌液。对各个基因探针对应的菌液通过引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳验证。

扩增引物序列为：

PML基因探针:

RP11-8P11

上游引物:CCTCCGAGTCCCACATTTAA SEQ ID NO.1

下游引物:AGGAATGCTTTGGGGACAC SEQ ID NO.2

RP11-243B22

上游引物:GACAGCACAGTCTGGAACAAAGA SEQ ID NO.3

下游引物:CGGAAGGCAGTGGAGAGTATAAA SEQ ID NO.4

RP11-161C1

上游引物:AGGGATGAGTGCTGGAGCTA SEQ ID NO.5

下游引物:AGGAAGTGGGGAACACTGTG SEQ ID NO.6

RaRα基因探针:

RP11-58E20

上游引物:TGATAACCATGCTCAGCAATG SEQ ID NO.7

下游引物:CGTTGATAACATTACTCAAGTCACA SEQ ID NO.8

RP11-48O10

上游引物:AAGCTCAGACTTGCCAGG SEQ ID NO.9

下游引物:AGGCACATTCAGTCCACTC SEQ ID NO.10

RP11-465J4

上游引物:TTGGACCTTTAAGAAACATATACCA SEQ ID NO.11

下游引物:GATAACCTTAGTAAAGCCTTGGAGC SEQ ID NO.12。

扩增条件为：95℃预变性5分钟；(“95℃变性1分钟；60℃退火30秒，72℃复性30 秒”)循环35次；72℃延伸反应7分钟。

3.基因探针制备：

(1)使用Qiagen公司的质粒提取试剂盒，按照说明书要求进行BAC克隆质粒的提取和纯化。用ND-1000超微量分光光度计对质粒DNA进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定。用 EcoR1酶对目的DNA进行酶切，方法如下：

37℃孵育1小时，加入1微升的0.5M的EDTA(PH7.5)终止反应，混匀，瞬时离心。

(2)沉淀DNA：加入步骤(1)总液体量1/10体积的3M乙酸钠。

(3)再加入步骤(2)总液体量2倍体积100％乙醇(-20℃)，混匀，瞬时离心，-70℃，沉淀约2小时，离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入100微升70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，干燥沉淀10分钟，用10微升的10mM的Tris-HCl(pH8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时，转速 800rpm，将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。

(4)连接反应:采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记，对PML、RARα基因分别采用PromoFluor-555-aadUTP，Green dUTP两种荧光素(表2)标记，对PF555-PML (红色),Green-RARα(绿色)，探针分别标记如表1，方法如下：

表2荧光素标记的dUTP

取避光的EP管，先加入水，最后加入DNaseⅠ(10纳克/微升)和DNA polymeraseⅠ(10 单位/微升，酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液：

混匀，瞬时离心，14℃孵育过夜(9-12小时)，次日加入5微升的0.5M的EDTA(PH7.5)终止反应，混匀，瞬时离心，连接好的DNA放在-20℃避光保存。

(5)沉淀DNA:

按照以下反应体系对目的标记好的DNA进行沉淀：

再加入15微升的3M的乙酸钠，630微升的100％乙醇(-20℃)混匀，瞬时离心，-20℃，沉淀过夜。次日离心14000rpm，4℃，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100微升的70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟。加入10微升的含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针组合物，转速800rpm，将溶解好的探针组合物放入 56℃中孵育1小时，室温离心14000rpm，20分钟，将离心好的探针组合物转移至一个新的避光EP管中，4℃中保存，若长期不用探针组合物应保存于-20℃。

4.PF555-PML,Green-RARα基因探针组合物验证：

(1)细胞准备：

用Ficoll液进行密度梯度离心提取正常人外周血单个核细胞，PBS洗涤后进行细胞甩片，细胞甩片，转速1000rpm，3分钟；晾干，放入甲醇中室温固定过夜；次日放入1-2％的甲醛溶液中室温固定5分钟，PBS中洗涤后放入70％的乙醇中-20℃保存；将保存在70％的乙醇中的标本拿出，放入梯度乙醇(70％，85％，2×100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，脱水后晾干，加入制作好的探针组合物，2微升/片，加上12×12mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。

(2)杂交：

将玻片放入杂交仪中，78℃变性5分钟，37℃杂交过夜。

(3)洗涤：

将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟；梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度；放入己烷：异丙醇(60:40)混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100％的乙醇中5分钟；空气中干燥片子约10分钟后加入8微升的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。

(4)图像采集与分析：

采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型荧光显微镜，滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100),Spectrum Green^TM(MF101)和Cy3^TMv1(PromoFluor-555)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device，电荷耦合原件) 相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission：450-490nm),Spectrum Green(Emission： 512-542nm),Cy3v1(Emission：559.5-574.5nm)三个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得获得清晰、稳定，理想的多色图像。拍摄3个区域共计200个细胞，记录PML基因，RARα基因的荧光信号数目。

(5)结果判断：

荧光原位杂交结果显示，同一细胞核中，每种探针得到两个清晰的荧光信号，2种探针一共获得4个相应的荧光信号点。从获得的Green-RARα(绿色)，PF555-PML(红色) (图1)中可以看出，同时检测的2个不同基因的荧光信号均较强，图像清晰，信噪比高。方法可靠稳定。

实施例2：一种急性早幼粒细胞白血病荧光原位杂交检测试剂盒(50人份)，组成如下：

1)荧光标记探针组杂交混合液100微升； 1管

2)DAPI复染液500微升； 1管

3)20XSSPE洗涤液20毫升； 1瓶

4)说明书 1份

其中荧光标记探针组杂交混合液中PML基因探针浓度为：4ng/μl，RARα基因探针浓度为:4ng/μl。

实施例3：急性早幼粒细胞白血病荧光原位杂交检测试剂盒的使用方法

收集临床血液病门诊样本37例，使用实施例3中所述急性早幼粒细胞白血病荧光原位杂交检测试剂盒进行检测，方法如下：

1.标本处理和制片：

取骨髓标本离心获得骨髓细胞。PBS液洗涤后，用0.075摩尔/升的KCl低渗液去除骨髓细胞中的红细胞，进行细胞甩片(800rpm，5分钟)，用甲醇溶液室温固定过夜，2％甲醛固定5分钟后储存于-20℃的70％乙醇中，梯度乙醇(70％，85％，2×100％乙醇)中脱水， 3分钟/梯度，晾干后用钻石笔标记细胞位置，FISH检测备用。

2.杂交反应：

将要检测的标本处理好后，加入实施例2试剂盒中的荧光标记探针组杂交混合液，2 微升/片，加上规格为12×12mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20 分钟。将玻片放入杂交仪中，78℃变性5分钟，37℃杂交过夜。

3.洗片：

将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟；梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度；放入己烷：异丙醇(60:40)混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100％的乙醇中5分钟；空气中干燥片子约10分钟后加入10微升的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。

4.图像采集与分析：

采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型荧光显微镜，滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100),Spectrum Green(MF101)和Cy3^TMv1(PromoFluor-555)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission：450-490nm),Spectrum Green(Emission：512-542nm),Cy3v1(Emission：559.5-574.5nm)三个滤光片通路中采集荧光信息，调整焦距，在核的不同层次找到信号点，记录观察每个细胞中的各探针的数目，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描5层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像。每片拍摄10个区域共计数200个肿瘤细胞。记录PML基因和RARα基因的荧光信号数目。

5.结果判断：

通过记录PML基因和RARα基因的荧光信号数目。发现已知白血病患者骨髓细胞的染色体发生易位(图2)结果显示自制探针(图2)检出一个独立的红色信号和一个独立的绿色信号，以及1个红色和绿色融合信号(黄色)。结果提示，该病人含有一个正常的PML 基因拷贝和一个正常的Rara基因拷贝，另一个拷贝的PML基因和RARa发生了重组，形成了 PML/RARa融合基因。

从获得的Green-Rara(绿色)，PF555-PML(红色)多色图像(图2)中可以看出，同时检测的2个不同基因的荧光信号均较强，图像清晰，信噪比高，方法可靠稳定。

目前国内公司尚无注册的可应用于临床的对于急性早幼粒细胞白血病的FISH检测试剂盒，本发明试剂盒填补了该项空白。通过本发明试剂盒可以更好得进行分子病理分型，了解克隆构成，研究和跟踪基因组异常在疾病发生和发展过程中在急性早幼粒细胞白血病细胞中不断积累的过程，更好的判断预后，指导个性化治疗，判断疗效和监测病程。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，但本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

序列表

<110> 协和干细胞基因工程有限公司

<120> 一种检测急性早幼粒细胞白血病的基因探针组合物及试剂盒和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA