铜绿丽金龟内参基因及应用的制作方法

文档序号：14827970发布日期：2018-06-30 09:14阅读：289来源：国知局

本发明属于分子生物学中昆虫体内稳定表达的内参基因技术领域，具体涉及一种在铜绿丽金龟不同发育时期及不同组织部位稳定表达的内参基因及其应用。

背景技术：

铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)属节肢动物门，昆虫纲，鞘翅目，丽金龟科，为我国金龟子的第三大优势种，是重要的农林业害虫。成虫喜食苹果、梨、桃等果树、林木的叶片，也取食花生、豆类等作物的叶片。幼虫取食花生荚果及根系，薯类块根块茎，麦类、豆类、玉米、蔬菜、树苗的地下部分，在虫量过大时还可环食根或茎韧皮部分。铜绿丽金龟一年发生一代，一生经历卵期、幼虫期、蛹期、成虫期四个发育阶段。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是目前被广泛用于基因表达模式分析的技术，具有快捷、准确、灵敏的优点。在利用此技术分析目的基因表达水平时，为了消除样品间因提取效率、RNA质量、反转录效率等不同造成的误差，常选择稳定表达的基因作为内参基因来归一化数据。因此内参基因的可信性对qRT-PCR结果的准确性和可靠性至关重要，如果内参基因在不同组织、不同发育阶段或不同实验条件下的表达有明显变化，则会影响试验结论的可靠性，甚至得出截然相反的结论。持家基因由于其对于生物体的重要意义，表达水平通常是稳定的，故常被选作内参基因，如肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)等。但近年来越来越多研究表明这些持家基因的表达量在不同情况下会发生明显改变，因此，需要对这些基因在研究材料中的表达稳定性进行评估来确定在特定条件下其是否可以作为合适的内参基因。但目前国内外尚未见基于qRT-PCR技术筛选铜绿丽金龟内参基因并分析其表达稳定性的研究报道。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明旨在提供一种铜绿丽金龟内参基因，并提供了利用该内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物。

本发明选择肌动蛋白1(actin-1)、肌动蛋白2(actin-2)、转录因子E2F2(E2F2)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)、核糖体蛋白L23(RPL23)、核糖体蛋白L3(RPL3)、核糖体蛋白L49(RPL49)、核糖体蛋白S14(RPS14)、ADP核糖基化因子6(ARF6)这10个基因作为候选内参基因，以铜绿丽金龟的卵、1龄、2龄、3龄幼虫、蛹、雄性成虫和雌性成虫总RNA，雌雄成虫的触角、头、胸、腹部、腿部RNA为材料分析上述候选内参基因的表达稳定性，以筛选可靠的内参基因。

一种铜绿丽金龟内参基因，所述内参基因为核糖体蛋白L23(RPL23)、ADP核糖基化因子6(ARF6)和核糖体蛋白L3(RPL3)；其中RPL23的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示，ARF6的核苷酸序列表如SEQ ID NO:2所示，RPL3的核苷酸序列表如SEQ ID NO:3所示。

RPL23的序列：CTAAGAGAGGACGTGGTGGTTCCGCTGGAGCCAAGTTCAGGATATCATTGGGTTTGCCAGTTGGAGCTGTTATTAATTGTGCAGATAACACAGGAGCCAAAAATTTATATGTTATCGCAGTGCAAGGTATCGGCGGGCGATTGAATCGTCTACCAGCGGCAGGTTCTGGTGACATGATTGTAGCAACGGTGAAAAAAGGCAAACCAGAACTACGGAAAAAAGTTATGCCAGCAGTTGTTATAAGGCAACGAAAACCTTTCCGTAGGAAGGATGGAGTATTTATATACTTTGAAGATAATGCTGGAGTTATCGTAAATAATAAAGGTGAAATGAAGGGTTCTGCAATTACTGGACCCGTTGCGAAAGAGTGTGCAGATCTTTGGCCGAGAATCGCATCCAATGCAAGCAGCATTGCGTAAATTGTTAATTTCACTATTTATAAAAACTGAAAAATAAAGATTGAATTTCTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAACAAAAAAAAAAAAAAAACAAAAATAAAAAAAAAAAAAAAAACAAAAATGGGGGACTTTTGCGTAAC；

ARF6的序列：CGATCTTGTACAAATTGAAACTTGGCCAGTCGGTGACAACCATACCTACGGTGGGGTTCAACGTTGAAACAGTGACTTATAAAAATGTGAAGTTTAACGTGTGGGATGTCGGCGGGCAGGATAAAATAAGACCGTTGTGGCGCCATTATTACACAGGTACGCAGGGGTTAATATTCGTTGTGGACTGTGCTGATCGCGATCGGATAGATGAGGCGCGCCAGGAACTACACCGTATAATAAACGATCGTGAAATGCGAGACGCTATCATATTAATATTCGCTAATAAACAAGATCTACCCGAGGCGATGAAGCCGCACGAAATCCAGGAGAAACTAGGTCTTACGCGGATTCGTGACCGGAATTGGTATGTGCAACCGGCCTGTGCTAC；

RPL3的序列：CATGGGATTTTATCCCAAGAAGAGATCCCAGCGACATCGTGGAAAAGTTAAGGCATTTCCCAAAGATGATCCCAGTAAACCAGTACATCTGACTGCGTTTATAGGATACAAGGCTGGCATGACCCATGTTTTACGCGAGGCAGACAGACCTGGTTCAAAGATAAATAAGAAAGAAATTGTAGAAGCTGTTACAATTTTGGAGACACCTCCAATGGTAATTGTAGGAGTTGTTGGATATATTGAAACGCCACATGGTCTTCGCGCACTAGCTACCATTTGGGCCGAACATTTATCTGAAGATTGCCGCAGGAGATTCTACAAGAATTGGTACAAGAGTAAGAAGAAGGCCTTCACTAAAGCCTCCAAGAAATGGCAAGATGATCTGGGAAGGAAGTCGATCGAACGCGACTTCAAGAAAATTATCAAATATTGCAAAGTCGTCAGAGTAATTGCACATACTCAGATGAAACTGTTGAAACAACGCCAGAAGAAGGC。

进一步地，所述内参基因序列由转录组测序获得，并进行验证，验证方法如下：以铜绿丽金龟成虫全身总RNA反转录获得的cDNA为模板，以如下引物对进行PCR扩增并测序；

内参基因RPL23对应的引物对为：正向引物5'-CTAAGAGAGGACGTGGTGGT-3'，反向引物5'-GTTACGCAAAAGTCCCCCA-3'；

内参基因ARF6对应的引物对为：正向引物5'-ACCATCTCCAGTTGTAGCAC-3'，反向引物5'-GGCAACAAGGAGATGAGGAT-3'；

内参基因RPL3对应的引物对为：正向引物5'-CCATAATATGAGCCTTCTTC-3'，反向引物5'-TGTCTCATCGTAAATTCAGC-3'。

进一步地，PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃下延伸8min。

本发明还提供上述铜绿丽金龟内参基因的应用，即RPL23、ARF6和RPL3在分析不同组织部位及不同发育时期基因表达模式的实时荧光定量PCR实验中作为内参基因。

本发明还提供一种实时荧光定量PCR引物，以权利要求1所述的内参基因核苷酸序列为基础，利用PrimerPremier5.0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；

内参基因RPL23的实时荧光定量PCR引物为：正向引物5'-GGTTCCGCTGGAGCCAAGTTC-3'，反向引物5'-CCTGCCGCTGGTAGACGATTC-3'；

内参基因ARF6的实时荧光定量PCR引物为：正向引物5'-ATATTCGTTGTGGACTGTGCTG-3'，反向引物5'-GCTTCATCGCCTCGGGTAG-3'；

内参基因RPL3的实时荧光定量PCR引物为：正向引物5'-AAGAAGAGATCCCAGCGACATC-3'，反向引物5'-TGCCAGCCTTGTATCCTATAAACG-3'。

本发明从多达10个候选内参基因中筛选出表达最稳定的铜绿丽金龟内参基因，以及基于内参基因序列设计的实时荧光定量PCR引物，解决了现有铜绿丽金龟荧光定量PCR实验中没有可靠内参基因的现状。筛选出的内参基因适用于分析功能基因在铜绿丽金龟不同发育阶段或不同组织部位的表达水平，能够提高检测数据的可靠性、稳定性和重复性。

附图说明

图1为实时定量PCR实验中各候选基因的表达水平；图中1为actin-1；2为actin-2；3为ARF6；4为RPL23；5为GAPDH；6为GPDH；7为RPL3；8为RPL49；9为RPS14；10为E2F2。

图2为RefFinder软件对持家基因稳定性分析的结果。

具体实施方式

以下结合实施例及附图对本发明做进一步说明。这些实施例仅是示例性的，且不用于限制本发明的范围，这些实施例仅用于对本发明进行说明。

实施例1铜绿丽金龟内参基因序列的获得

铜绿丽金龟内参基因序列的获得方法，包括如下步骤：

(1)铜绿丽金龟采集及饲养：成虫采集于山东省花生研究所莱西试验田，在覆有20-30cm土壤的饲养箱中饲养，饲养箱置于人工气候箱中，饲养条件是26±1℃，光周期为16L：8D，土壤含水量18％～20％。

(2)获得候选内参基因序列：actin-1(SEQ ID NO:4)、actin-2(SEQ ID NO:5)、GAPDH(SEQ ID NO:6)、GPDH(SEQ ID NO:7)、RPL3(SEQ ID NO:3)、RPL23(SEQ ID NO:1)、RPL49(SEQ ID NO:8)、RPS14(SEQ ID NO:9)、E2F2(SEQ ID NO:10)、ARF6(SEQ ID NO:2)的序列由转录组测序获得，具体过程为利用lluminaHiSeq 2000测序平台，对铜绿丽金龟成虫触角组织总RNA进行高通量测序，使用Trinity软件进行序列拼接，根据注释结果查找获得上述unigene的序列，并与数据库中的序列Blast比对，确定了unigene的全部或部分序列；并利用RT-PCR技术对上述来自转录组的持家基因序列进行了验证，具体方法为：基于上述持家基因的核苷酸序列，利用Primer Premier5.0软件设计合成了RT-PCR引物(表1)，提取铜绿丽金龟成虫全身总RNA，并按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)试剂盒的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA；之后以所得cDNA为模板，上述引物进行PCR扩增，反应体系及反应程序如下：

PCR反应体系：反应体系的总体积为25μL，含25ng模板、2.5mMdNTP、10mM正向引物、10mM反向引物、25mM MgCl2、1U Ex-Taq DNA聚合酶(Takara)。

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃下延伸8min。

所获得序列进行克隆并测序，将获得序列与NCBI数据库进行Blast比对，以确定候选内参基因序列，见SEQ ID NO：1-10。

表1 RT-PCR引物序列

实施例2内参基因的筛选

在铜绿丽金龟不同发育时期及不同组织部位稳定表达的内参基因的筛选，具体步骤如下：

按照Trizol试剂(Invitrogen)说明书对铜绿丽金龟的卵、1龄、2龄、3龄幼虫、蛹、雄性成虫和雌性成虫以及雌雄成虫的触角、头、胸、腹部、腿部样品提取总RNA，并按照PrimeScript RT reagent kit with gDNAEraser试剂盒的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA。

以实施例1获得的各条内参基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1-10)为基础，利用Primer Premier5.0软件分别设计合成一对特异性扩增的荧光定量特异引物(表2)，通过溶解曲线的单一峰以及1％琼脂糖凝胶电泳检测条带的单一性来确定引物的特异性；通过绘制标准曲线得到上述引物的扩增效率在96.3％～103.5％。利用上述cDNA为模板、以上述引物进行荧光定量PCR实验，每个样品重复4次，每组3个技术重复。反应体系与反应程序如下：

反应体系：总体积为20μL，含上述cDNA模板1μL、10μM上下游引物各0.8μL、10μLSYBR Premix Ex Taq II(Takara)。

反应程序：95℃预变性3min；95℃10s，58℃30s，共40个循环；58℃到95℃，每个循环上升0.5℃。反应结果后确认荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线。

利用内参基因稳定性分析软件RefFinder来分析实验结果得到的各候选基因的Ct值(图1)。RefFinder可以综合评价△Ct、BestKeeper、NormFinder和geNorm四种方法的分析结果来对候选内参基因作出最终的稳定性排序。最终筛选出在最稳定的内参基因为RPL23，次稳定的内参基因为ARF6，稳定性排名第三的内参基因为RPL3(表3；图2)。

表2荧光定量PCR引物序列

表3各分析方法对候选内参基因稳定性的排名

序列表

<110> 山东省花生研究所

<120> 铜绿丽金龟内参基因及其应用

<160> 50

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 561

<212> DNA

<213> 铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)

<400> 1

ctaagagagg acgtggtggt tccgctggag ccaagttcag gatatcattg ggtttgccag 60

ttggagctgt tattaattgt gcagataaca caggagccaa aaatttatat gttatcgcag 120

tgcaaggtat cggcgggcga ttgaatcgtc taccagcggc aggttctggt gacatgattg 180

tagcaacggt gaaaaaaggc aaaccagaac tacggaaaaa agttatgcca gcagttgtta 240

taaggcaacg aaaacctttc cgtaggaagg atggagtatt tatatacttt gaagataatg 300

ctggagttat cgtaaataat aaaggtgaaa tgaagggttc tgcaattact ggacccgttg 360

cgaaagagtg tgcagatctt tggccgagaa tcgcatccaa tgcaagcagc attgcgtaaa 420

ttgttaattt cactatttat aaaaactgaa aaataaagat tgaatttctt taaaaaaaaa 480

aaaaaaaaga aaaaacaaaa aaaaaaaaaa aacaaaaata aaaaaaaaaa aaaaaacaaa 540

aatgggggac ttttgcgtaa c 561

<210> 2

<211> 388

<212> DNA

<213> 铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)

<400> 2

cgatcttgta caaattgaaa cttggccagt cggtgacaac catacctacg gtggggttca 60

acgttgaaac agtgacttat aaaaatgtga agtttaacgt gtgggatgtc ggcgggcagg 120

ataaaataag accgttgtgg cgccattatt acacaggtac gcaggggtta atattcgttg 180

tggactgtgc tgatcgcgat cggatagatg aggcgcgcca ggaactacac cgtataataa 240

acgatcgtga aatgcgagac gctatcatat taatattcgc taataaacaa gatctacccg 300

aggcgatgaa gccgcacgaa atccaggaga aactaggtct tacgcggatt cgtgaccgga 360

attggtatgt gcaaccggcc tgtgctac 388

<210> 3

<211> 495

<212> DNA

<213> 铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)

<400> 3

catgggattt tatcccaaga agagatccca gcgacatcgt ggaaaagtta aggcatttcc 60

caaagatgat cccagtaaac cagtacatct gactgcgttt ataggataca aggctggcat 120

gacccatgtt ttacgcgagg cagacagacc tggttcaaag ataaataaga aagaaattgt 180

agaagctgtt acaattttgg agacacctcc aatggtaatt gtaggagttg ttggatatat 240

tgaaacgcca catggtcttc gcgcactagc taccatttgg gccgaacatt tatctgaaga 300

ttgccgcagg agattctaca agaattggta caagagtaag aagaaggcct tcactaaagc 360

ctccaagaaa tggcaagatg atctgggaag gaagtcgatc gaacgcgact tcaagaaaat 420

tatcaaatat tgcaaagtcg tcagagtaat tgcacatact cagatgaaac tgttgaaaca 480

acgccagaag aaggc 495

<210> 4

<211> 588

<212> DNA

<213> 铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)

<400> 4

ctacgttatt ggtagctgta ttaagcacat ccctatagct ggtagaaata ttacctattt 60

tatccaatca cttctacgtg aacgtgaaat tggtattcct ccggaacaat ctttagaaac 120

agcgaaagct attaaagaac gttactgtta tatttgccca gacattgcaa aggaattcgc 180

caagtacgat gcagatccgg caaaatgtat aaaaaaatat gaagggatga actcggtaac 240

aaagcagccc ttcacggtag atgttggtta cgagagattt ctcggaccgg aaatattttt 300

ccatccagaa ttttcgaatc ctgattttac cattcctctt tctgaaattg tcgacgatgt 360

aattcaaaat tgccctatag atgttcgtcg acctctttat aataatatag ttctatcggg 420

aggttctacc atgttcaaag attttgatag aaggttgcaa cgggatttga agagaacagt 480

ggatgctaga ttgaaactta gcgagagttt aggaggtggt cgaattaagc caaaaccgat 540

taatgtcaat gtagtaacgc atcacatgca aagatacgct gtttggtt 588

<210> 5

<211> 559

<212> DNA

<213> 铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)

<400> 5

aatcatccgt atgagcccag gctttcgcac cataccaact tgacaaagta caattcggca 60

acacactgac agcgctgaac gatttaaaag gtcttatcga tatcaaatcc gaatggactc 120

tctcctgtaa tccgggtaaa tttgccggcc ctcctgttaa aacaatatta gacgctaatc 180

ttaattgatc atcatcatta aataatgaca gcacgtaacc gatcacttcg gataaaccag 240

cttccgaact accaatcata taaggtttaa atatgagttc tggtgctcga tatctttcga 300

ctccaatatg gagttgatgt gcttcaccgg gaccgaaagt atcatcttct tcgctaggtt 360

catgtgttcg gataatttct tcgagttcta aaagtttctc attttcagtt tcactatctg 420

agtccgcacc atctctgcta attgttttgt atatatccca atcttcatcg cgtaaaccga 480

aatcatcatt tcctttctct ttccgagcta actgcgatat aatcctcatc ctttcttgcc 540

cagcagctgt tctccgttt 559

<210> 6

<211> 537

<212> DNA

<213> 铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)

<400> 6

gaattttttt tctgctcatc tgcagatgca cctatgtttg ttgttggcgt taacttggaa 60

tcttacgatc ctagctacaa ggttatttca aatgcttctt gcaccaccaa ctgcttggcc 120

ccacttgcta aagtaatcca tgataacttt ggcatcgttg aaggactgat gacaactgtt 180

cacgctatta ccgctactca aaagactgtt gatggaccat ctggcaaatt gtggcgcgat 240

ggtcgtggtg ctgcccagaa catcatccct gcttcgactg gtgctgctaa ggctgtcggc 300

aaagtaattc cagctcttaa tggaaagtta accggcatgg cattccgtgt accagttcca 360

aatgtatcag tcgtagatct tactgttcgt ctcgaaaaac ctgcaaaata tgatgagatc 420

aaggctaaag ttaaggcagc cgcagagggc ccattgaaag gaatcttggc ttacactgaa 480

gacagcgtcg tatcagccga ttttattggt gatagccatt ggcacagttt tcaggcc 537

<210> 7

<211> 483

<212> DNA

<213> 铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)

<400> 7

gtggggcagg ctggagctga tatgtcgtag aatcaaccgg tgttttcacc accatcgaaa 60

aagcttccgc tcatttagaa ggtggtgcta agaaagttat tatttctgct ccatctgcag 120

atgcacctat gtttgttgtt ggcgttaact tggaatctta cgatcctagc tacaaggtca 180

tttcaaatgc ttcttgcacc accaactgct tggccccact tgctaaagta atccatgata 240

actttggcat cgttgaagga ctgatgacaa ctgttcacgc tattaccgct actcaaaaga 300

ctgttgatgg accatctggc aaattgtggc gcgatggtcg tggtgctgcc cagaacatca 360

tccctgcttc gactggtgct gctaaggctg tcggcaaagt aattccagct cttaacggaa 420

agttaaccgg catggcattc cgtgtaccag ttccaaacgt atcagtcgta gatcttactt 480

ccc 483

<210> 8

<211> 274

<212> DNA

<213> 铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)

<400> 8

tttcatcagg atggaaaccg caagagaaat ccgctgaaga tttgccattt tatacaactc 60

gcacaaaaaa tcacatgatt cctgtctatt taaaaactag tcatagaggt acaaaacgtt 120

taacatatgt gaagaagatt caaggcgata tttggcaaat ggaaaaagaa ttgttgcaat 180

ttctgcaaga agaacaggtt cgtccaatta gatctcaagt taacgaatta gcaagacata 240

tttgtttcca tggggactat taaaatgcta taga 274

<210> 9

<211> 374

<212> DNA

<213> 铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)

<400> 9

cgcactttgt gctcccggtc cgggagtttt cgtcttatta ccacctgtag cccgtaattt 60

aatatgcaac gctgtaattc ctaacgactt acatttctcg gctacatctt gtgcagctaa 120

catagcagcg tacggtgagg cttcatctct gtcggctttt actttcatac caccggtgac 180

tctagaaata gtttcacgtc ccgacaaatc ggtaacatgc acgaatgtat cgttgaagct 240

ggcgaaaatg tgtgctactc cgaatacgat ttcaccttcc ctaacctgcg gtccaagcga 300

aacttggggt tcttctttct gaacttttcc tttcctcgga gccattattt atttctgttt 360

tgagaaagca ggaa 374

<210> 10

<211> 743

<212> DNA

<213> 铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)

<400> 10

agcttttggt ctgtatcttc ggttttaaaa ccgaatttat cccaactata gtcgttaatt 60

aataaattag aaaatcgatc tgaatttggc tggaacatgt ttataggcga taacgttatg 120

gtattaacag gattcatcaa cgcttcgttt gaacaactag acgaggcgcc gacattgctg 180

aaagtgattg attggcggac agattttgga gcacctacac tttcgaatac cggatctttg 240

aagtccttcg tgtctttcgg gaaagatatt tttctacatg tctgtgaaga tataggctta 300

tggtcagacg ttggactgtc aaactgaggc actggtggag ttgtaaaact aaagaggcca 360

ggactgctgg gataatcctt taataaagaa tccattggtg gtacattttt aattttgggc 420

ggtgaaacag tttctggaca cagaaagact tcgatttcac cagtattact tttcaaatgt 480

attttatatc cgtcatcaga ttcagctggc acgtttaagt ttgcgttagg tggagcacga 540

attgccatga cagttttatt cttaaattta ggtattgatc tcaaatcatg atacgttata 600

tatccatgtt tactattatt taagttatgt aaatcggaag tcaccatctt aattaaagcg 660

ttcaattcgt tttcttgatt atcaagagct tcgatatcgt tcttcaacgc ttttattgag 720

caactactct tactaccgcc ttc 743

<210> 11

<211> 20

<212> DNA