本发明涉及生物技术及农牧生产领域，具体而言，涉及草原红牛肉质相关的分子标记及其在肉质鉴定中的应用。
背景技术：
中国草原红牛肉用新品系是由吉林省农业科学院畜牧科学分院肉牛研究团队经过多年选育而成中国草原红牛肉用新品系选育成功，给我国肉牛产业发展注入了新的活力，国内外肉牛育种专家对屠宰性状的研究没有像生长性状研究的那么广泛和深入，因为这些屠宰性状数据获得相对较难，尤其对于大家畜动物来说难度系数就更大，从而在一定程度上限制了屠宰性状遗传标记的研究"但是在人们生活水平不断提高的今天，人们对牛肉品质的要求也越来越高，这就要求肉牛育种专家不断地努力培育出更好的肉牛品种来满足人们的需求"鉴于以上考虑，国内外肉牛育种专家利用标记辅助选择技术加大了对肉牛屠宰性状遗传标记的研究力度，从而能为直接利用基因型进行早期选择，缩短世代间隔，加快遗传进展奠定了基础。
迄今为止，在中国草原红牛肉用新品系群体中对整个基因的多态性及其与屠宰性状的关系研究在国内外尚未见报道。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供草原红牛肉质相关的分子标记，该分子标记与草原红牛的肉质特征密切相关，通过草原红牛肉质相关的分子标记在畜牧养殖中具有较大的应用空间。
本发明的第二目的在于提供述草原红牛肉质相关的分子标记在草原红牛肉质鉴定中的应用。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
草原红牛肉质相关的分子标记，草原红牛肉质相关的分子标记包括草原红牛的净肉率分子标记、草原红牛的失水率分子标记、草原红牛的大理石花纹分子标记、草原红牛的剪切力分子标记和草原红牛的ph值分子标记。
上述草原红牛肉质相关的分子标记在草原红牛肉质鉴定中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的草原红牛肉质相关的分子标记与草原红牛的肉质密切相关，将草原红牛肉质相关的分子标记应用到草原红牛的肉质鉴定中，能较好的区别和筛选出较优质的肉质，因此草原红牛肉质相关的分子标记可以更好的指导农牧业尤其是畜牧业的生产，具有较大的使用价值和社会价值。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的草原红牛肉质相关的分子标记及其在肉质鉴定中的应用进行具体说明。
草原红牛肉质相关的分子标记，草原红牛肉质相关的分子标记包括草原红牛的净肉率分子标记、草原红牛的失水率分子标记、草原红牛的大理石花纹分子标记、草原红牛的剪切力分子标记和草原红牛的ph值分子标记。
进一步地，本发明的较佳实施例中，草原红牛的精肉率分子标记包括hnrnpa0基因变异位点、phactr2基因变异位点、ralyl基因变异位点和myo18b基因变异位点，草原红牛的失水率分子标记包括riok2基因变异位点，草原红牛的大理石花纹分子标记包括cd109基因变异位点和csmd1基因变异位点，草原红牛的剪切力分子标记包括lyst基因变异位点，草原红牛的肉色分子标记包括ltn1基因变异位点，草原红牛的ph分子标记包括loc104974390基因变异位点、shank2基因变异位点和trim25基因变异位点。
上述草原红牛肉质相关的分子标记在草原红牛肉质鉴定中的应用。
进一步地，本发明的较佳实施例中，包括草原红牛肉质相关的分子标记的获得，具有以下步骤：
提取草原红牛的基因组dna，并用第一酶液消化处理，得到纯化基因组dna；
取500-750ng的纯化基因组dna变性处理，得到变性基因组dna；
变性基因组dna进行扩增，得到基因组扩增产物；基因组扩增产物经第二酶液处理，得到样本dna片段；
样本dna片段单碱基延伸后与dna芯片反应，并荧光扫描和分析，得到与草原红牛肉质相关的分子标记。
进一步地，本发明的较佳实施例中，基因组dna的a260/a280值为1.8-2.1。
如果a260/a280值小于1.8表示样品中存在蛋白质、酚等物质污染的问题，如果a260/a280值大于2.1表明可能存在rna污染的问题。
进一步地，本发明的较佳实施例中，基因组dna的浓度为650ng/μl-2500ng/μl。
进一步地，本发明的较佳实施例中，第一酶液为rnase或蛋白酶中的至少一种。
根据基因组dna的a260/a280值选用不同的酶消化处理，如果a260/a280值较大，可以选用rnase作为第一酶液处理，如果a260/a280值小，可以选用蛋白酶作为第一酶液；当然也可以同时用rnase和蛋白酶依次处理。
进一步地，本发明的较佳实施例中，变性处理的变性剂为naoh溶液。
进一步地，本发明的较佳实施例中，第二酶液包括限制性核酸内切酶。
通过限制性核酸内切酶将基因组切成合适的短片段，短片段就能够很好的与芯片上序列杂交反应。
进一步地，本发明的较佳实施例中，限制性核酸内切酶处理基因组扩增产物后还包括沉淀和重悬，沉淀的反应试剂为乙醇溶液。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种草原红牛肉质相关的分子标记，草原红牛肉质相关的分子标记包括草原红牛的净肉率分子标记、草原红牛的失水率分子标记、草原红牛的大理石花纹分子标记、草原红牛的剪切力分子标记和草原红牛的ph值分子标记。
草原红牛的精肉率分子标记包括hnrnpa0基因变异位点、phactr2基因变异位点、ralyl基因变异位点和myo18b基因变异位点，草原红牛的失水率分子标记包括riok2基因变异位点，草原红牛的大理石花纹分子标记包括cd109基因变异位点和csmd1基因变异位点，草原红牛的剪切力分子标记包括lyst基因变异位点，草原红牛的肉色分子标记包括ltn1基因变异位点，草原红牛的ph分子标记包括loc104974390基因变异位点、loc104974390基因变异位点、shank2基因变异位点和trim25基因变异位点。
实施例2
本实施例提供一种草原红牛肉质相关的分子标记的获得，具体步骤如下：
取样：随机选取草原红牛肉用新品系48头，颈静脉采血，颈静脉采血放入加有edta抗凝剂的离心管中，然后摇匀迅速放入冰盒，-80℃保存待用；
草原红牛胴体重、净肉重、进行现场测定和对屠宰率、净肉率的数据的获得。
宰杀选取的草原红牛，按照中华人民共和国农业行业标准ny/t676-2003《牛肉质量分级》对胴体重、净肉重、进行现场测定和对屠宰率、净肉率进行计算；
1.1胴体重：指去头、皮、尾、蹄、生殖器官及周围脂肪、内脏(保留肾脏和周围脂肪)的重量。净肉重：胴体剔除骨后的全部重量，包括肾脏及周围脂肪。屠宰率(％)＝(胴体重/宰前活重)×100％，净肉率(％)＝(净肉重/宰前活重)×100％。同时测得净肉重。
1.2失水率：于宰后2h取背最长肌1.0cm厚肉片样本，用直径2.532cm圆形取样器切下面积5cm2，厚1cm的圆形肉样称重后备用。先将土壤允许膨胀仪钢环加压至最大值三次后减压至千分表回零。然后将圆形肉样夹在两层纱布中间，上下各垫18层新华定性中速滤纸，再夹于两层硬塑料间，置于土壤允许膨胀压缩仪平台上加压至35kg保持5min。撤除压力后立即从纱布中剥下肉样称重。
失水率＝((压前肉样重-压后肉样重)/压前肉样重)×100％
1.3常规养分的测定：取12-13胸椎处背最长肌，绞碎后，按照常规方法进行水分、肌内脂肪、粗灰分、粗蛋白的测定。测定结果以鲜肉样中常规养分的含量表示。
1.4肉色：按5级分制肉色标准评分图目测评分。两分之间允许设0.5分值。
1.5大理石花纹：按照《中国肉牛等级标准》中大理石花纹等级图谱(其中大理石纹等级图给出的是每级中花纹的最低标准)确定眼肌横切面处大理石花纹等级。大理石花纹等级共分为5个等级:1级、2级、3级、4级、5级。大理石花纹丰富为5级；较丰富为4级，一般为3级，少量为2级，几乎没有为1级。
1.6肌肉嫩度，用剪切力表示，取第13-16胸椎部按与肌纤维呈垂直方向截取厚度约为2.5cm的背最长肌，将试样肉表面附着的脂肪除去，装入塑料薄膜袋中包扎好，放在15℃-16℃条件下24小时进行尸僵前处理。然后将肉样置于冰箱冷藏层，在4℃条件下熟化24小时。取出熟化完成的肉样，在室温下放置1小时。然后，打开塑料薄膜包装袋，用温度计插入肌肉中心部，再包扎好肉样，保持袋口向上，放入80℃恒温水浴锅中，加盖后持续加热，直至肌肉中心温度达到70℃为止。取出肉样，放置于室温下使肌肉冷却至20℃备用。再用1.27cm直径的圆形取样器顺肌纤维方向钻取肉柱(尽可能多地取样，同时要注意避开筋柱)，然后用c-lm3型数显式肌肉嫩度仪(东北农业大学工程学)测定每个肉柱的剪切力值，每个样品测10-15次，选取剪切力相接近的6-8个值取其平均值，即为所取肉柱剪切力值。单位用牛顿(n)或公斤(kg)表示。
草原红牛肉质相关的分子标记的获取方法，具体步骤如下：
2.1用试剂盒从冻存血样中提取基因组dna，并检测基因组dna的a260/a280值；
2.2测得基因组dna的浓度为650ng/μl，并先用rnase处理基因组dna，再用蛋白酶处理基因组dna溶液，得到纯化基因组dna，控制a260/a280在1.8；
2.3取550ng的纯化基因组dna样品，利用naoh溶液进行变性处理，得到变性基因组dna；
2.4对纯化基因组dna样品进行扩增，得到基因组扩增产物；
2.5采用kpni和bamhi作为第二酶液随机酶切基因组扩增产物，得到样本dna片段；
2.6对样本dna片段进行单碱基延伸反应，进行双色荧光染料标记，然后与红牛dna芯片bovinehighdensitychip进行杂交反应；
2.7清洗芯片后，扫描芯片的荧光数据；
2.8通过分析得到，获得草原红牛肉质相关的分子标记包括净肉率分子标记、失水率分子标记、肉色分子标记、大理石花纹分子标记、剪切力分子标记和ph值分子标记。
实施例2
本实施例提供本实施例提供一种草原红牛肉质相关的分子标记的获的，具体步骤如下：
取样：随机选取草原红牛肉用新品系48头，颈静脉采血，颈静脉采血放入加有edta抗凝剂的离心管中，然后摇匀迅速放入冰盒，-80℃保存待用；
草原红牛胴体重、净肉重、进行现场测定和对屠宰率、净肉率的数据的获得。
宰杀选取的草原红牛，按照中华人民共和国农业行业标准ny/t676-2003《牛肉质量分级》对胴体重、净肉重、进行现场测定和对屠宰率、净肉率进行计算；
1.1胴体重：指去头、皮、尾、蹄、生殖器官及周围脂肪、内脏(保留肾脏和周围脂肪)的重量。净肉重：胴体剔除骨后的全部重量，包括肾脏及周围脂肪。屠宰率(％)＝(胴体重/宰前活重)×100％，净肉率(％)＝(净肉重/宰前活重)×100％。同时测定净肉重。
1.2失水率：于宰后2h取背最长肌1.0cm厚肉片样本，用直径2.532cm圆形取样器切下面积5cm2，厚1cm的圆形肉样称重后备用。先将土壤允许膨胀仪钢环加压至最大值三次后减压至千分表回零。然后将圆形肉样夹在两层纱布中间，上下各垫18层新华定性中速滤纸，再夹于两层硬塑料间，置于土壤允许膨胀压缩仪平台上加压至35kg保持5min。撤除压力后立即从纱布中剥下肉样称重。
失水率＝((压前肉样重-压后肉样重)/压前肉样重)×100％
1.3常规养分的测定：取12-13胸椎处背最长肌，绞碎后，按照常规方法进行水分、肌内脂肪、粗灰分、粗蛋白的测定。测定结果以鲜肉样中常规养分的含量表示。
1.4肉色：按5级分制肉色标准评分图目测评分。两分之间允许设0.5分值。
1.5大理石花纹：按照《中国肉牛等级标准》中大理石花纹等级图谱(其中大理石纹等级图给出的是每级中花纹的最低标准)确定眼肌横切面处大理石花纹等级。大理石花纹等级共分为5个等级:1级、2级、3级、4级、5级。大理石花纹丰富为5级；较丰富为4级，一般为3级，少量为2级，几乎没有为1级。
1.6肌肉嫩度，用剪切力表示，取第13-16胸椎部按与肌纤维呈垂直方向截取厚度约为2.5cm的背最长肌，将试样肉表面附着的脂肪除去，装入塑料薄膜袋中包扎好，放在15℃-16℃条件下24小时进行尸僵前处理。然后将肉样置于冰箱冷藏层，在4℃条件下熟化24小时。取出熟化完成的肉样，在室温下放置1小时。然后，打开塑料薄膜包装袋，用温度计插入肌肉中心部，再包扎好肉样，保持袋口向上，放入80℃恒温水浴锅中，加盖后持续加热，直至肌肉中心温度达到70℃为止。取出肉样，放置于室温下使肌肉冷却至20℃备用。再用1.27cm直径的圆形取样器顺肌纤维方向钻取肉柱(尽可能多地取样，同时要注意避开筋柱)，然后用c-lm3型数显式肌肉嫩度仪(东北农业大学工程学)测定每个肉柱的剪切力值，每个样品测10-15次，选取剪切力相接近的6-8个值取其平均值，即为所取肉柱剪切力值。单位用牛顿(n)或公斤(kg)表示。
草原红牛肉质相关的分子标记的获取方法，具体步骤如下：
2.1用试剂盒从冻存血样中提取基因组dna，并检测基因组dna的a260/a280值；
2.2测得基因组dna的浓度为2500ng/μl，并先用rnase处理基因组dna，再用蛋白酶处理基因组dna溶液，得到纯化基因组dna，控制a260/a280在2.1左右范围内；
2.3取800ng的纯化基因组dna样品，利用naoh溶液进行变性处理，得到变性基因组dna；
2.4对纯化基因组dna样品进行扩增，得到基因组扩增产物；
2.5采用ecori和hindiii作为第二酶液随机酶切基因组扩增产物，得到样本dna片段；
2.6对样本dna片段进行单碱基延伸反应，进行双色荧光染料标记，然后与红牛dna芯片bovinehighdensitychip进行杂交反应；
2.7清洗芯片后，扫描芯片的荧光数据；
2.8通过分析得到，获得草原红牛肉质相关的分子标记包括净肉率分子标记、失水率分子标记、肉色分子标记、大理石花纹分子标记、剪切力分子标记和ph值分子标记。
实施例3
本实施例提供本实施例提供一种草原红牛肉质相关的分子标记的获得，具体步骤如下：
取样：随机选取草原红牛肉用新品系48头，颈静脉采血，颈静脉采血放入加有edta抗凝剂的离心管中，然后摇匀迅速放入冰盒，-80℃保存待用；
草原红牛胴体重、净肉重、进行现场测定和对屠宰率、净肉率的数据的获得。
宰杀选取的草原红牛，按照中华人民共和国农业行业标准ny/t676-2003《牛肉质量分级》对胴体重、净肉重、进行现场测定和对屠宰率、净肉率进行计算；
1.1胴体重：指去头、皮、尾、蹄、生殖器官及周围脂肪、内脏(保留肾脏和周围脂肪)的重量。净肉重：胴体剔除骨后的全部重量，包括肾脏及周围脂肪。屠宰率(％)＝(胴体重/宰前活重)×100％，净肉率(％)＝(净肉重/宰前活重)×100％。同时测定净肉重。
1.2失水率：于宰后2h取背最长肌1.0cm厚肉片样本，用直径2.532cm圆形取样器切下面积5cm2，厚1cm的圆形肉样称重后备用。先将土壤允许膨胀仪钢环加压至最大值三次后减压至千分表回零。然后将圆形肉样夹在两层纱布中间，上下各垫18层新华定性中速滤纸，再夹于两层硬塑料间，置于土壤允许膨胀压缩仪平台上加压至35kg保持5min。撤除压力后立即从纱布中剥下肉样称重。
失水率＝((压前肉样重-压后肉样重)/压前肉样重)×100％
1.3常规养分的测定：取12-13胸椎处背最长肌，绞碎后，按照常规方法进行水分、肌内脂肪、粗灰分、粗蛋白的测定。测定结果以鲜肉样中常规养分的含量表示。
1.4肉色：按5级分制肉色标准评分图目测评分。两分之间允许设0.5分值。
1.5大理石花纹：按照《中国肉牛等级标准》中大理石花纹等级图谱(其中大理石纹等级图给出的是每级中花纹的最低标准)确定眼肌横切面处大理石花纹等级。大理石花纹等级共分为5个等级:1级、2级、3级、4级、5级。大理石花纹丰富为5级；较丰富为4级，一般为3级，少量为2级，几乎没有为1级。
1.6肌肉嫩度，用剪切力表示，取第13-16胸椎部按与肌纤维呈垂直方向截取厚度约为2.5cm的背最长肌，将试样肉表面附着的脂肪除去，装入塑料薄膜袋中包扎好，放在15℃-16℃条件下24小时进行尸僵前处理。然后将肉样置于冰箱冷藏层，在4℃条件下熟化24小时。取出熟化完成的肉样，在室温下放置1小时。然后，打开塑料薄膜包装袋，用温度计插入肌肉中心部，再包扎好肉样，保持袋口向上，放入80℃恒温水浴锅中，加盖后持续加热，直至肌肉中心温度达到70℃为止。取出肉样，放置于室温下使肌肉冷却至20℃备用。再用1.27cm直径的圆形取样器顺肌纤维方向钻取肉柱(尽可能多地取样，同时要注意避开筋柱)，然后用c-lm3型数显式肌肉嫩度仪(东北农业大学工程学)测定每个肉柱的剪切力值，每个样品测10-15次，选取剪切力相接近的6-8个值取其平均值，即为所取肉柱剪切力值。单位用牛顿(n)或公斤(kg)表示。
草原红牛肉质相关的分子标记的获取方法，具体步骤如下：
2.1用试剂盒从冻存血样中提取基因组dna，并检测基因组dna的a260/a280值；
2.2测得基因组dna的浓度为1500ng/μl，并先用rnase处理基因组dna，再用蛋白酶处理基因组dna溶液，得到纯化基因组dna，控制a260/a280在2.1左右范围内；
2.3取600ng的纯化基因组dna样品，利用naoh溶液进行变性处理，得到变性基因组dna；
2.4对纯化基因组dna样品进行扩增，得到基因组扩增产物；
2.5采用psti和saci作为第二酶液随机酶切基因组扩增产物，得到样本dna片段；
2.6对样本dna片段进行单碱基延伸反应，进行双色荧光染料标记，然后与红牛dna芯片bovinehighdensitychip进行杂交反应；
2.7清洗芯片后，扫描芯片的荧光数据；
2.8通过分析得到，获得草原红牛肉质相关的分子标记包括净肉率分子标记、失水率分子标记、肉色分子标记、大理石花纹分子标记、剪切力分子标记和ph值分子标记。
实验例1
本实验例提供对实施例1提供的草原红牛肉质相关的分子标记的获取方法，并分析草原红牛肉质相关的分子标记与肉质相关指标的相关性。
通过实施例1提供的方法获得草原红牛的净肉率分子标记、草原红牛的失水率分子标记、草原红牛的大理石花纹分子标记、草原红牛的剪切力分子标记、草原红牛的肉色分子标记和草原红牛的ph值分子标记，具体实验结果如表1-表6所示。
表1草原红牛的净肉率显著相关的snp结果
表2草原红牛的失水率显著相关的snp结果
表3草原红牛的肉色显著相关的snp结果
表4草原红牛的大理石花纹显著相关的snp结果
表5草原红牛的剪切力显著相关的snp结果
表6草原红牛的ph显著相关的snp结果
从表1到表6的数据可以看出，草原红牛的精肉率分子标记包括hnrnpa0基因变异位点、phactr2基因变异位点、ralyl基因变异位点和myo18b基因变异位点，草原红牛的失水率分子标记包括riok2基因变异位点，草原红牛的大理石花纹分子标记包括cd109基因变异位点和csmd1基因变异位点，草原红牛的剪切力分子标记包括lyst基因变异位点，草原红牛的肉色分子标记包括ltn1基因变异位点，草原红牛的ph分子标记包括loc104974390基因变异位点、loc104974390基因变异位点、shank2基因变异位点和trim25基因变异位点分别与草原红牛的净肉率分子标记、草原红牛的失水率分子标记、草原红牛的大理石花纹分子标记、草原红牛的剪切力分子标记、草原红牛的肉色分子标记和草原红牛的ph值分子标记密切相关，可以应用到草原红牛肉质鉴定中。
综上所述，本发明实施例提供的草原红牛肉质相关的分子标记包括草原红牛的净肉率分子标记、草原红牛的失水率分子标记、草原红牛的大理石花纹分子标记、草原红牛的剪切力分子标记、草原红牛的肉色分子标记和草原红牛的ph值分子标记，能较好的应用到草原红牛肉质鉴定中。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。