一种与非小细胞肺癌相关的血浆环状RNA标志物检测方法与流程

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种与非小细胞肺癌相关的血浆环状rna标志物检测方法。

背景技术：

肺癌是目前全球受累人数最多的恶性肿瘤，5年生存率常低于15％。由于持续增长的烟草消费和日益加剧的环境污染，我国的肺癌发病和死亡形势日趋严峻，如不及时采取有效控制措施，预计到2025年，我国肺癌病人将达到100万，成为世界第一肺癌大国。研究表明，早期肺癌(i期)患者术后5年生存率可达到50％以上。因此，在肺癌早期予以确诊，并实施有效的治疗，是延长肺癌患者生存期以及生活质量的关键。

但截止目前，大部分肺癌确诊方法均有不同程度的缺点。作为诊断金标准的病理检查多为手术或穿刺获取靶组织检测，对患者生理和心理创伤均较大。而常用的肿瘤标志物如cea,ca125,ca19-9和cyfra21-1等则缺乏足够的灵敏度和特异度。此外，基于质谱技术的蛋白血清标志物为肿瘤早期诊断提供了一个新的探索方向，然而该技术难度大，成本高，并且血清蛋白作为标志物常受到其稳定性的限制。环状rna是国际上新发现的一类非编码rna，具有组织特异性、表达特异性及良好稳定性，被证明参与机体重要的生理和病理过程，有望成为新的生物标志物。

目前现有技术中急需一种血浆环状rna(circrna)标志物检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与非小细胞肺癌相关的血浆环状rna标志物检测方法。该方法可应用于检测非小细胞肺癌发病相关的血浆环状rna标志物，对于该肿瘤的诊断具有重要辅助作用。首次采用线虫circrna作为内参，解决了当前无法较好定量circrna的技术瓶颈。

其具体技术方案为：

一种与非小细胞肺癌相关的血浆环状rna标志物检测方法，包括以下步骤：

步骤1、提取外周血血浆：每个研究对象均采用真空抗凝edta采血管采集晨起空腹静脉血5ml，按标准方法在12小时内离心，分离血浆至1.5ml离心管中，保存两份，-80℃冷冻保存备用；

步骤2、血浆rna的提取：12000rpm4℃离心10min对200ul血浆进行预处理。参照invitrogen公司trizolls试剂、qiagen公司试剂盒rneasyplusminikit操作流程提取血浆rna，然后加入100ng线虫总rna作为质控和内参标准，通过离心柱纯化血浆rna，洗脱后-80℃保存备用，rna的纯度和浓度采用nanodropnd-2000仪器检测；

步骤3、real-timertpcr检测circrna：设计circrna特异性反向引物，采用takara公司生产的逆转录试剂盒进行rna逆转录，然后采用sybr-green染料法检测血浆circrna表达水平，反应体系和条件参照试剂盒说明书进行，每个样本进行三次平行实验，以线虫circrna为内参进行标化，采用δct定量方法，2-δct代表circrna的相对表达值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)circrna在血浆中含量丰富、性质稳定、可定量检测；2)检测指标微创价廉，可应用于人群筛查和临床检测，易于推广应用；3)本发明也为其他疾病生物标志物的研究提供了技术指导。4)本发明结合了基础与临床、理论和应用，有望提高早期肺癌的临床诊断率，改善患者治疗效果及生存质量。

附图说明

图1是本发明与非小细胞肺癌相关的血浆环状rna标志物检测方法的流程示意图；

图2是实施例的结果，其中，图2a是应用real-timertpcr检测肺癌相关circfarsa获得的溶解曲线，单一峰表明引物特异，结果稳定；图2b是同时应用real-timertpcr检测线虫circrnacel-9获得的溶解曲线，单一峰表明引物特异，结果稳定；

图3是应用上述实验条件检测并比较50例肺癌患者和50例健康对照的血浆circfarsa相对表达水平，结果表明circfarsa在肺癌患者中表达水平显著升高；

图4是反映应用血浆circfarsa区分肺癌患者和健康对照的灵敏度和特异度，曲线下面积0.71，表明该生物标志物用于鉴别肺癌的表现良好。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

如图1所示：

①提取外周血血浆：每个研究对象均采用真空抗凝(edta)采血管采集晨起空腹静脉血5ml(患者为手术及放化疗前的血标本)，按标准方法在12小时内离心，分离血浆至1.5ml离心管中(保存两份)，-80℃冷冻保存备用。

②血浆rna的提取：参照invitrogen公司trizolls试剂、qiagen公司试剂盒(rneasyplusminikit)操作流程提取血浆rna，提取前12000rpm4℃离心10min对血浆进行预处理，然后加入100ng线虫总rna作为质控和内参标准，通过离心柱纯化血浆rna，洗脱后-80℃保存备用。rna的纯度和浓度采用nanodropnd-2000仪器检测。

③real-timertpcr检测circrna：设计circrna特异性反向引物，采用takara公司生产的逆转录试剂盒进行rna逆转录，然后采用sybr-green染料法(real-timeqpcrmastermix,takara,japan)检测血浆circrna表达水平，反应体系和条件参照试剂盒说明书进行，每个样本进行三次平行实验，以线虫circrna为内参进行标化。采用δct定量方法，2-δct代表circrna的相对表达值。

实施例：以circfarsa为例，其特异性反向引物：5’-gctccttctggaactttgac-3’，5’-ttgctcacccagtaggtctt-3’；

线虫内参cel_9内参：5’-ttgcagctctcatagaaggaaccg-3’,5’-gtttcagccgagactagactttgagc-3’。

主要结果如图2-图4所示。

采用real-timertpcr检测circfarsa和线虫内参cel_9内参，溶解曲线峰值单一，表明引物特异，结果稳定可靠。

非小细胞肺癌(nsclc)病例血浆中circfarsa的表达水平显著高于健康对照组(p<0.001)，提示可作为诊断标志物。

血浆中circfarsa的受试者工作特征曲线(roc)下面积(auc)为0.71，表明circfarsa对于诊断非小细胞肺癌准确性较好。

仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>南京医科大学

<120>一种与非小细胞肺癌相关的血浆环状rna标志物检测方法

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