一种黄瓜黑星病菌LAMP检测引物及检测方法与流程

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种黄瓜黑星病菌lamp检测引物及检测方法，可用于黄瓜黑星病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于黄瓜黑星病菌所引起病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术：

由瓜疮痂枝孢霉菌(cladosporiumcucumerinum，又称瓜黑星病菌)侵染引起的黄瓜黑星病是黄瓜生产上常见的一种毁灭性病害。该病在美洲（美国、加拿大）、欧洲（苏联、法国、英国、波兰）和亚洲（日本、朝鲜、印度）等黄瓜生产区均有分布，国内主要分布于辽宁、吉林、黑龙江、山东、河北、内蒙、安徽、江苏和浙江等省份。黄瓜黑星病菌在黄瓜整个生育期均可侵染发病，主要危害黄瓜叶片、茎、卷须、瓜条和生长点等，以植株幼嫩部分如嫩叶、嫩茎和幼果受害最重，一旦病害发生，就会严重影响黄瓜的品质和产量，甚至绝收。近年来，随着我国保护地生产的发展，黄瓜黑星病在我国部分地区发生危害日趋严重，一般年份黄瓜受害率为60-70%，严重者达90%以上，甚至完全绝收。由于黄瓜黑星病危害严重，难以防治，我国已将其列为全国植物检疫性有害生物。因此建立黄瓜黑星病菌的快速、准确检测技术，可为该病害的预测预报、及时采取有效的防治方法、控制病原菌的传播和减少瓜农损失具有重要的意义。

病原微生物传统的检测鉴定方法主要通过对分离物形态学特征、生物学、致病性和生理生化特征指标作为依据，对照已有的研究资料确定其分类地位。这种传统检测鉴定方法不仅存在着检测时间太长、程序繁琐、灵敏度低和经验性强等不足，而且还存在着难以从发病初期的植株中分离鉴定出病原菌、难以对病害的早期做出准确诊断、也难以给病害防治提供有效防治时期等缺点。

近年来，随着分子生物学技术在植物病理学中的不断发展，一种名为环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)的核酸体外扩增技术以其操作简单、特异性高、成本低、快速、高效和经济等优点在植物病原微生物分子检测鉴定中得到了广泛的应用。但目前国内外尚未应用lamp方法检测黄瓜黑星病菌的报道。本发明根据黄瓜黑星病菌its保守序列设计特异性引物，优化反应体系，建立了快速、灵敏和可视化的lamp检测体系，为黄瓜黑星病菌的检测鉴定提供理论基础和技术方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种黄瓜黑星病菌lamp检测引物及检测方法，针对现有技术中对黄瓜黑星病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有pcr分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了黄瓜黑星病菌的分子检测方法，对黄瓜黑星病菌进行lamp检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1.黄瓜黑星病菌lamp检测特异性引物的设计：

通过测定黄瓜黑星病菌（cladosporiumcucumerinum）和其它病原菌的核糖体转录间隔区（its）基因，对黄瓜黑星病菌同属不同种间its基因序列进行比对分析，利用在线lamp引物设计软件primersoftwareexplorerv4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;eikenchemicalco.,japan)设计一套黄瓜黑星病菌特异性lamp引物组，由f3、b3、fip和bip组成，引物序列如下：f3:5’-tctcttggttctggcatcga-3’，b3:5’-cagccggacgatttgagg-3’，fip:5’-ggcgcaatgtgcgttcaaagat-gaacgcagcgaaatgcgata-3’，bip:5’-ctggtattccggggggcatg-gttgcccaataccaagcga-3’。

2.黄瓜黑星病菌lamp检测方法的建立，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组dna。

用于检测病原菌纯培养物时，采用ctab法进行提取基因组dna，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5ml离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µl2%ctab（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%ctab；100mmol/ltris-hcl,ph8.0；20mmol/ledta，ph8.0；1.4mol/lnacl）和90µlsds（十二烷基苯磺酸钠）【注：ctab，sds需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（dna释放至缓冲液中），12000r·min^-1离心15min；取上清液700µl，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min^-1离心9min；取上清液500µl，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min^-1离心5min；取上清液350µl，加入上清液体积1/10的3mol·l^-1naac和上清液体积2倍的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min^-1离心5min；弃去上清液，加入700µl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干至无酒精味，加入30~60µlte（10mmol/ltris-hcl，0.1mmol/ledta，ph8.0）溶液进行溶解，得到dna溶液，用紫外分光光度计检测dna浓度并稀释至100ng/µl待用。

用于检测植物组织中存在黄瓜黑星病菌时，采用naoh快速裂解法提取dna，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µl0.5mol/lnaoh，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5ml离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5µl加入495µl0.1mol/ltris-hcl（ph=8.0）混合均匀，取1.0µl作为pcr模板进行扩增；

用于检测土壤样品中存在黄瓜黑星病菌时，采用土壤dna提取试剂盒，提取dna。

（2）lamp反应体系的建立：以步骤（1）提取的dna为模板，在pcr管中配制25μl反应体系，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2wt.%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；

（3）lamp反应条件：将配制好的pcr管于63℃水浴锅中恒温反应60min，之后在80℃下灭活5min结束反应；

（4）反应结果的测定：待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，常光显色结果观察到绿色荧光的为阳性，即样品含黄瓜黑星病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不含黄瓜黑星病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含黄瓜黑星病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含黄瓜黑星病菌。

本发明的有益效果：本发明建立了黄瓜黑星病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的lamp检测技术体系，可用于黄瓜黑星病菌纯培养物或带菌植株组织和土壤中黄瓜黑星病菌的检测，或用于黄瓜黑星病菌引起病害的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

与现有技术相比，本发明的进步在于：引物特异性强、灵敏度高；检测方法简单、快速，检测结果准确；检测仪器简单，只需要简单的水浴锅，无需pcr仪、凝胶成像系统等昂贵仪器设备；检测结果可以直接肉眼判断，无需电泳等pcr的处理，大大降低了污染的可能性；适用于基层农业部门及相关检测部门田间现场检测。

附图说明

图1为环介导恒温扩增（lamp）引物在靶标基因its中的位点及序列(引物fip由f2和f1c组成，引物bip由引物b2和b1c组成)。

图2为本发明黄瓜黑星病菌的lamp特异性检测。a为lamp扩增后的常光照射可视化显色，b为lamp扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1-3为黄瓜黑星病菌，4-7分别番茄叶霉病菌（cladosporiumfulvum）、枝状枝孢菌（cladosporiumcladosporioides）、梨黑星病菌菌（venturiapirina）和香蕉黑星病菌（macrophomamusae），8为阴性对照，1-3显示绿色荧光。

图3为本发明黄瓜黑星病菌lamp检测灵敏性。a为lamp扩增后的常光照射可视化显色，b为lamp扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1-9模板dna浓度分别为1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、10ag，10为阴性对照，1-6显示绿色荧光。

图4为本发明检测方法对发病果实中黄瓜黑星病菌的检测。a为lamp扩增后的常光照射可视化显色，b为lamp扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1为阳性对照，2-3、6、8-9为黄瓜黑星病发病果实，4-5、7、10为健康黄瓜果实，11为阴性对照，1-3、6、8-9显示绿色荧光。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例1：黄瓜黑星病菌环介导恒温扩增（lamp）检测特异性引物的设计及引物特异性验证

1.供试菌株基因组dna的提取

采用ctab法提取供试菌株基因组dna，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5ml离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µl2%ctab（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%ctab；100mmol/ltris-hcl,ph8.0；20mmol/ledta，ph8.0；1.4mol/lnacl）和90µlsds（十二烷基苯磺酸钠）【注：ctab，sds需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（dna释放至缓冲液中），12000r.min^-1离心15min；取上清液700µl，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（酚、氯仿、异戊醇体积比25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min^-1离心9min；取上清液500µl，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min^-1离心5min；取上清液350µl，加入上清液体积1/10的3mol·l^-1naac和上清液体积2倍的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min^-1离心5min；弃去上清液，加入700µl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干至无酒精味，加入30~60µlte（10mmol/ltris-hcl，0.1mmol/ledta，ph8.0）溶液进行溶解，得到dna溶液，用紫外分光光度计检测dna浓度并稀释至100ng/µl待用。

2.黄瓜黑星病菌lamp检测特异性引物的设计：

通过测定黄瓜黑星病菌（cladosporiumcucumerinum）和其它病原菌的核糖体转录间隔区（its）基因，对黄瓜黑星病菌同属不同种间its基因序列进行比对分析，利用在线lamp引物设计软件primersoftwareexplorerv4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;eikenchemicalco.,japan)设计一套黄瓜黑星病菌特异性lamp引物组，由f3、b3、fip和bip组成，引物序列如下：f3:5’-tctcttggttctggcatcga-3’，b3:5’-cagccggacgatttgagg-3’，fip:5’-ggcgcaatgtgcgttcaaagat-gaacgcagcgaaatgcgata-3’，bip:5’-ctggtattccggggggcatg-gttgcccaataccaagcga-3’。引物在靶标基因its中的位点及序列如图1所示。

3.黄瓜黑星病菌lamp检测方法的建立及引物特异性验证

以黄瓜黑星病菌（cladosporiumcucumerinum）、番茄叶霉病菌（cladosporiumfulvum）、枝状枝孢菌（cladosporiumcladosporioides）、梨黑星病菌菌（venturiapirina）、苹果黑星病菌（venturiainaequalis）、香蕉黑星病菌（macrophomamusae）、柑橘黑星病菌（guignaridacitricarpa）、黄瓜靶斑病菌（corynesporacassiicola）、黄瓜炭疽病菌（colletotrichumorbiculare）、黄瓜多主棒孢菌（corynesporacassiicola）、黄瓜灰葡萄孢菌（botrytiscinerea）、尖镰孢黄瓜专化型（fusariumoxysporumsp.cucumebrium）和黄瓜疫霉菌（phytophthoramelonis）等供试菌株的dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：63℃温育60min，之后在80℃下灭活5min结束反应；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品含黄瓜黑星病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不含黄瓜黑星病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含黄瓜黑星病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含黄瓜黑星病菌。

4.引物特异性验证结果

lamp扩增结果表明，供试的菌株中只有黄瓜黑星病菌菌显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀，其它病原真菌显色结果为橙色、澄清透明状（图2），说明所设计的黄瓜黑星病菌f3、b3、fip和bip可以将黄瓜黑星病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于黄瓜黑星病菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：黄瓜疫霉菌环介导恒温扩增（lamp）检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组dna的制备

用无菌超纯水对黄瓜黑星病菌基因组dna进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；

2.lamp检测方法灵敏度测定及结果观察

以不同浓度的黄瓜黑星病菌基因组dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2wt.%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：63℃温育60min，之后在80℃下灭活5min结束反应；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，静置5min，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品含黄瓜黑星病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不含黄瓜黑星病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含黄瓜黑星病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含黄瓜黑星病菌。

3.lamp扩增灵敏度检测结果

lamp扩增灵敏度检测结果表明，1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg/μl浓度的黄瓜黑星病菌基因组dna显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀，其余浓度及阴性对照显色结果为橙色、透明状，说明所设计的黄瓜黑星病菌引物f3、b3、fip和bip通过lamp扩增，对黄瓜黑星病菌的检测灵敏度可达10fg/μl（图3）。

实施例3：发病组织中黄瓜黑星病菌的lamp检测

样品采集：从福建福州和三明采集黄瓜黑星病发病症状典型的果实及健康果实带回实验室备用；

植物组织dna的提取：采用naoh快速裂解法提取dna，具体过程如下：用灭菌手术刀片切取发病组织，向每毫克植物组织中加入10µl0.5mol/lnaoh，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5ml离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5µl加入495µl0.1mol/ltris-hcl（ph=8.0）混合均匀，取1.0µl作为pcr模板进行扩增。

lamp扩增检测及观察：以上述提取的dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2wt.%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：63℃温育60min，之后在80℃下灭活5min结束反应；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，静置5min，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品含黄瓜黑星病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不含黄瓜黑星病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品含黄瓜黑星病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不含黄瓜黑星病菌。

检测结果：检测结果（图4）表明，黄瓜黑星病发病的果实通过lamp扩增，显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀，说明存在黄瓜黑星病菌，而健康叶片及阴性对照显色结果为橙色、透明状，说明不存在黄瓜黑星病菌，该套技术能用于植物组织中黄瓜黑星病菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>一种黄瓜黑星病菌lamp检测引物及检测方法

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