苗期鉴别辣椒雄性不育两用系中单株育性的分子标记方法与流程

本发明属于辣椒育种领域，涉及一种植物分子标记方法，尤其涉及一种苗期鉴别辣椒雄性不育两用系中单株育性的分子标记辅助育种的方法。

背景技术：

辣椒(capsicumannuuml.)是常异花授粉蔬菜作物，在生长势、抗病性、适应性及种子活力等方面都表现出较强的杂种优势，辣椒杂种一代比常规品种增产可达40％～60％。杂交种子在生产上虽然增产潜力很大，但其制种时必须人工去雄，费工费时，难以保证种子纯度，成本较高。辣椒雄性不育性状的利用，解决了杂种优势制种需人工去雄这一难题，降低了生产成本，成为杂交种选育的有效途径。

辣椒雄性不育可划分为三种类型：细胞核雄性不育、质核互作雄性不育和功能型雄性不育。辣椒细胞核雄性不育由隐性单基因决定，用显性杂合型可育株做父本与雄性不育植株进行兄妹交，后代可以保持雄性不育性状。细胞核雄性不育遗传简单稳定，转育方便，在育种实践中可以选育获得雄性不育两用系或ab系。然而辣椒雄性不育两用系在生产上的应用仍然受到很多不利因素的限制。首先，雄性不育两用系中不育株与可育株各占50％，因此用两用系制种时，母本的播种量、播种面积、定植面积和定植株数等均比人工去雄制种增加1倍。其次，为了保证辣椒杂种一代的种子纯度，必须在初花期对雄性不育两用系母本逐株进行育性鉴定和筛选，人工拔除50％可育植株，筛选后的不育株在田间会产生疏密不均的现象。再者，此时辣椒母本补苗困难，会造成花期不遇从而影响杂种一代种子产量。还有可能因鉴别疏忽晚拔，甚至漏拔雄性不育两用系母本中的可育株，产出大量假杂种，降低杂种一代的纯度。因此利用雄性不育两用系制种时，不但会增加劳动强度，提高人力成本，还会降低杂种一代种子纯度，已成为辣椒大面积利用雄性不育两用系制种的重要限制因子。

开展辣椒生物技术的研究，使之与常规育种技术更加紧密地结合。辣椒雄性不育两用系在制种过程中母本播种量大，花期人工鉴别及拔除可育株效率低，杂交种产量较低，如果能找到与育性基因紧密连锁的分子标记，必将有助于雄性不育两用系在大面积开展辣椒杂种一代的制种中的应用。近年来发展起来的dna分子标记具有量大、中性、可在任何时期分析、不受植株生长发育环境条件的影响等优点，为利用分子标记辅助技术高效、稳定地鉴别并筛选辣椒雄性不育两用系中的不育单株提供了可能。

以下是相关的参考文献：

巩振辉,cecchini,milnerjj.以pcr鉴定转基因植株的微量dna提取方法[j].西北农业大学学报.1997,25(1):45-48。

fanyq,liuy,yanlb,xingrg.transferandutilizationoftherecessivemalesterilegeneinsweetpepper[j].journalofplantgeneticresources.2004,5:333-337。

kims,parkm,yeomsi,kimym,etal.genomesequenceofthehotpepperprovidesinsightsintotheevolutionofpungencyincapsicumspecies[j].natgenet.2014,46(3):270-8。

技术实现要素：

针对上述背景技术中存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，首次提供一种苗期鉴别辣椒雄性不育两用系中单株育性的分子标记方法，该方法步骤简单快速、稳定可靠，鉴别结果与田间花器官育性鉴定结果准确一致、重复性好，特别适用于辣椒细胞核雄性不育分子标记辅助育种，能够很好地提高选择效率，加速育种进程，进而提高辣椒杂种一代种子产量，降低种子生产成本。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：一种苗期鉴别辣椒雄性不育两用系中单株育性的分子标记方法，包括以下步骤：

1)辣椒基因组dna的提取；

2)以人工设计合成的一对核苷酸分子为引物，对上述辣椒基因组dna进行pcr扩增；

引物的碱基组成的特定序列：

正向引物：5’-ggttatgatgttggtgctggt-3’；

反向引物：5’-gacaatcccataacagcaacc-3’；

3)pcr扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录。在辣椒雄性不育两用系中，雄蕊可育植株会出现一条557bp的特异条带，而雄性不育植株不会出现这一特异条带。

所述的pcr扩增反应条件是：

1)20μlpcr反应体系：10倍pcrbuffer2.0μl、25mmol·l^-1mgcl21.2μl、5u·μl^-1taqdna聚合酶0.16μl、5mmol·l^-1dntps0.4μl、20μmol·l^-1正向引物0.6μl、20μmol·l^-1反向引物0.6μl、40ng·μl^-1基因组dna2.0μl以及ddh2o13.04μl；

2)pcr扩增反应在pcr仪上进行，反应条件是：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行32个循环；最后72℃延伸10min；于4℃保存备用。

本发明的苗期鉴别辣椒雄性不育两用系中单株育性的分子标记方法，采用人工设计合成特异核苷酸分子，以辣椒雄性不育两用系各单株基因组dna为模板扩增，创建和优化辣椒细胞核雄性不育性状与可育性状的分子标记技术体系，开发出与辣椒细胞核雄性不育紧密连锁的分子标记。这一方法步骤简单快速、稳定可靠，能够在辣椒杂交制种过程中有效地提高雄性不育两用系的株选效率，进而提高辣椒杂种一代种子产量，降低种子生产成本。

附图说明

图1是本发明所用不同通用核苷酸引物对辣椒雄性不育两用系中不育株与可育株基因组dna进行扩增多态性page凝胶电泳分析示意图。m：dm2000dnamarker泳道；f：辣椒雄性不育两用系中雄蕊可育单株dnapcr扩增产物泳道；s：辣椒雄性不育两用系中雄性不育单株dnapcr扩增产物泳道。

图2是本发明获得的260bp差异条带在雄蕊可育型辣椒第1～12染色体上的同源性分析及分布示意图。

图3是本发明所用雄性不育株dna缺失区段的12对特异引物及其计算机算法检测的分子标记多态性及特异性分析示意图。

图4是本发明所提供的第一实施例中辣椒雄性不育两用系中不同单株基因组dnapcr扩增产物0.8％琼脂糖凝胶电泳分析示意图。m：dm2000dnamarker泳道；1～7：辣椒雄性不育两用系hw58ab中7个不同单株基因组dnapcr扩增产物泳道。

图5是本发明所提供的第二实施例中辣椒雄性不育两用系中不同单株基因组dnapcr扩增产物0.8％琼脂糖凝胶电泳分析示意图。m：dm2000dnamarker泳道；1～7：辣椒雄性不育两用系hw59ab中7个不同单株基因组dnapcr扩增产物泳道。

图6是本发明所提供的第三实施例中辣椒雄性不育两用系中不同单株基因组dnapcr扩增产物0.8％琼脂糖凝胶电泳分析示意图。m：dm2000dnamarker泳道；1～7：辣椒雄性不育两用系hw63ab中7个不同单株基因组dnapcr扩增产物泳道。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

发明人给出以下的实施例，这些实施例仅是用于理解本发明，本发明不限于这些实施例。

本发明首先利用195对通用核苷酸序列作为引物，对辣椒雄性不育两用系中不育株与可育株的基因组dna进行扩增多态性分析，在可育株中发现一条260bp差异条带，而不育株中无此条带，参见图1。将此差异条带测序后进行辣椒基因组比对分析(kims,parkm,yeomsi,kimym,etal.genomesequenceofthehotpepperprovidesinsightsintotheevolutionofpungencyincapsicumspecies[j].natgenet.2014,46(3):270-8)，发现雄蕊可育型辣椒第1～12染色体上均能够呈现此序列多拷贝现象，参见图2。为了探究该差异条带与辣椒雄蕊育性紧密连锁的特性，本发明基于辣椒基因组序列(http://peppergenome.snu.ac.kr/)，利用雄性不育株dna缺失区段分别设计12对特异引物，并且首次提出了一种用于有效检测这些特异引物开发分子标记的计算机算法，其代码实现如下所示：

利用该算法检测的分子标记多态性位点及其特异性参见图3。其中第8对引物(正向引物：5’-ggttatgatgttggtgctggt-3’；反向引物：5’-gacaatcccataacagcaacc-3’；)扩增特异性最优，其与辣椒雄蕊育性紧密连锁的分子标记能够在苗期准确、快速鉴别辣椒雄性不育两用系中的单株育性。

基于上述研发基础，本发明创制了一种苗期鉴别辣椒雄性不育两用系中单株育性的分子标记方法，该方法利用与辣椒雄蕊育性紧密连锁的分子标记与常规育种方法相结合的技术，在苗期准确、快速鉴别辣椒雄性不育两用系中的单株育性。

实施例1：

1.人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，其中：

正向引物：5’-ggttatgatgttggtgctggt-3’；

反向引物：5’-gacaatcccataacagcaacc-3’；

2.辣椒基因组dna提取：在幼苗期采用改良sds方法提取辣椒雄性不育两用系hw58ab单株基因组dna(巩振辉等，以pcr鉴定转基因植株的微量dna提取方法[j].西北农业大学学报,1997,25(1):45-48)。

3.以步骤1所述核苷酸分子为引物，对步骤2辣椒基因组dna进行pcr扩增，pcr扩增体系如下：

(1)反应液体积为20μl，所用物品的组成及含量为：

10倍pcrbuffer2.0μl、25mmol·l^-1mgcl21.2μl、5u·μl^-1taqdna聚合酶0.16μl、5mmol·l^-1dntps0.4μl、20μmol·l^-1正向引物0.6μl、20μmol·l^-1反向引物0.6μl、40ng·μl^-1基因组dna2.0μl以及ddh2o13.04μl。

(2)pcr扩增反应条件为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行32个循环；最后72℃延伸10min；于4℃保存备用。

4.pcr扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录，参见图4。结果表明，第1、4、7号单株可出现一条557bp的特异条带，鉴别为雄蕊可育植株；而第2、3、5、6号单株没有出现这一特异条带，鉴别为雄性不育植株。

上述不同单株材料在田间花器官育性鉴别(fanyq,liuy,yanlb,xingrg.transferandutilizationoftherecessivemalesterilegeneinsweetpepper[j].journalofplantgeneticresources.2004,5:333-337)结果表明，第1、4、7号单株均为雄蕊可育植株，而第2、3、5、6号单株均为雄性不育植株。因此，利用本发明创制的苗期鉴别辣椒雄性不育两用系中单株育性的分子标记方法与田间花期植株真实性状相一致，适用于辣椒细胞核雄性不育分子标记辅助育种，进而提高辣椒杂种一代种子产量，降低种子生产成本。

实施例2：

1.人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，其中：

正向引物：5’-ggttatgatgttggtgctggt-3’；

反向引物：5’-gacaatcccataacagcaacc-3’；

2.辣椒基因组dna提取：在幼苗期采用改良sds方法提取辣椒雄性不育两用系hw59ab单株基因组dna(巩振辉等，以pcr鉴定转基因植株的微量dna提取方法[j].西北农业大学学报,1997,25(1):45-48)。

3.以步骤1所述核苷酸分子为引物，对步骤2辣椒基因组dna进行pcr扩增，pcr扩增体系如下：

(1)反应液体积为20μl，所用物品的组成及含量为：

10倍pcrbuffer2.0μl、25mmol·l^-1mgcl21.2μl、5u·μl^-1taqdna聚合酶0.16μl、5mmol·l^-1dntps0.4μl、20μmol·l^-1正向引物0.6μl、20μmol·l^-1反向引物0.6μl、40ng·μl^-1基因组dna2.0μl以及ddh2o13.04μl。

(2)pcr扩增反应条件为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行32个循环；最后72℃延伸10min；于4℃保存备用。

4.pcr扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录，参见图5。结果表明，第1、3、6号单株可出现一条557bp的特异条带，鉴别为雄蕊可育植株；而第2、4、5、7号单株没有出现这一特异条带，鉴别为雄性不育植株。

上述不同单株材料在田间花器官育性鉴别(fanyq,liuy,yanlb,xingrg.transferandutilizationoftherecessivemalesterilegeneinsweetpepper[j].journalofplantgeneticresources.2004,5:333-337)结果表明，第1、3、6号单株均为雄蕊可育植株，而第2、4、5、7号单株均为雄性不育植株。因此，利用本发明创制的苗期鉴别辣椒雄性不育两用系中单株育性的分子标记方法与田间花期植株真实性状相一致，适用于辣椒细胞核雄性不育分子标记辅助育种，进而提高辣椒杂种一代种子产量，降低种子生产成本。

实施例3：

1.人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，其中：

正向引物：5’-ggttatgatgttggtgctggt-3’；

反向引物：5’-gacaatcccataacagcaacc-3’；

2.辣椒基因组dna提取：在幼苗期采用改良sds方法提取辣椒雄性不育两用系hw63ab单株基因组dna(巩振辉等，以pcr鉴定转基因植株的微量dna提取方法[j].西北农业大学学报,1997,25(1):45-48)。

3.以步骤1所述核苷酸分子为引物，对步骤2辣椒基因组dna进行pcr扩增，pcr扩增体系如下：

(1)反应液体积为20μl，所用物品的组成及含量为：

10倍pcrbuffer2.0μl、25mmol·l^-1mgcl21.2μl、5u·μl^-1taqdna聚合酶0.16μl、5mmol·l^-1dntps0.4μl、20μmol·l^-1正向引物0.6μl、20μmol·l^-1反向引物0.6μl、40ng·μl^-1基因组dna2.0μl以及ddh2o13.04μl。

(2)pcr扩增反应条件为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行32个循环；最后72℃延伸10min；于4℃保存备用。

4.pcr扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录，参见图6。结果表明，第2、3、6号单株可出现一条557bp的特异条带，鉴别为雄蕊可育植株；而第1、4、5、7号单株没有出现这一特异条带，鉴别为雄性不育植株。

上述不同单株材料在田间花器官育性鉴别(fanyq,liuy,yanlb,xingrg.transferandutilizationoftherecessivemalesterilegeneinsweetpepper[j].journalofplantgeneticresources.2004,5:333-337)结果表明，第2、3、6号单株均为雄蕊可育植株，而第1、4、5、7号单株均为雄性不育植株。因此，利用本发明创制的苗期鉴别辣椒雄性不育两用系中单株育性的分子标记方法与田间花期植株真实性状相一致，适用于辣椒细胞核雄性不育分子标记辅助育种，进而提高辣椒杂种一代种子产量，降低种子生产成本。