一种分子标记检测东方百合特定群体雄性不育的方法与流程

本发明涉及一种分子标记检测东方百合特定群体雄性不育的方法，属于植物的分子标记检测技术领域。

背景技术：

东方百合是世界，也是中国最为流行的切花。由于其花粉量大，往往在运用时容易污染衣物和环境，因此，培育雄性不育的无花粉百合一直是百合育种的重点方向，东方百合作为最为流行的切花百合类型，能够选育出观赏性状优良，且无花粉的品种一直是百合育种的目标，目前通过特定的杂交选育能够得到雄性不育的无花粉东方百合，但常规的杂交都会出现有花粉和无花粉的性状分离现象。

通常情况下，杂交得到的东方百合种子田间种植3-4年后能够开花，人工鉴别花粉有无后，再进行下一步的优良性状选育工作，由于杂交种子量大，在田间栽培过程中往往耗费大量的人力物力，常常由于工作量大，管理不到位，致使很多具有市场开发潜力的优良的雄性不育无花粉东方百合株系流失。所以开发一种能够在早期鉴定花粉有无的技术势在必行。

技术实现要素：

为开发一种能够在特定东方百合群体苗期鉴别花粉有无的分子标记技术，本发明提供一种分子标记检测东方百合特定群体雄性不育的方法，通过大量的分子标记筛选，最终成功确定能够实现上述目的的分子标记，运用该分子标记，结合东方百合田间栽培技术，能够大大降低无花粉东方百合选育成本，提高育种效率，缩短相关的繁育周期。

本发明通过下列技术方案实现：一种分子标记检测东方百合特定群体雄性不育的方法，经过下列各步骤：

a、选取的百合亲本进行杂交，在7月百合盛花期，选取父本百合花药粒，在不高于25℃的温室大棚中，对母本百合进行人工授粉，授粉后包裹柱头，防止其他非父本花粉污染母本柱头；

b、授粉后待百合果实自然成熟，蒴果即将开裂时采集果实，收集成熟的种子，自然风干后，种子穴盘种植，种植深度2cm；

c、翌年3月种子发芽后，移栽到田间，田间土壤按腐殖质：红土的质量比为1：10配置，当年自然越冬；

d、第三年夏季当植株长出5片叶以上时，采集顶端幼嫩叶片做dna提取使用；

e、采用常规ctab法提取百合叶片dna；

f、分子标记筛选：根据相关无花粉东方百合转录组测序电子拼接结果，设计数对可能与雄性不育相关引物作为标记，最终确定一对引物atp6（1）f、atp6(1)r为有效标记，序列见表1：

表1分子标记序列

pcr扩增体系为：总体积为25μl，其中含mg²⁺的10×buffer，2ul；2.5mmdntp，1ul；10umprimer1，1ul；10umprimer2，1ul；dna模板（100ng/ul），2ul；taq酶（25u），0.5ul；ddh2o，17.5ul；

pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，tm值55.5℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温，整个反应过程持续时间约4h；

取5μlpcr产物于1.5%琼脂糖凝胶(含eb0.05％)电泳，于紫外透射反射分析仪观察、凝胶成像系统拍照记录；

通过不同分子标记（引物）与种子苗dna模板配组，筛选出在种子苗中有明显区别的分子标记，分析差异电泳条带，电泳结果中有条带的判定为有花粉百合，无条带的判定为无花粉百合。

所述步骤a的百合亲本是选取东方百合亲本希伯伦为母本，东方百合马可波罗为父本。

验证：种子苗继续田间栽培，第四年待种子苗开花后，人工观察验证东方百合花粉育性，即可对本发明的分子标记法结果进行验证。

本发明通过东方百合叶片dna提取，分子标记，经人工观察验证，该方法有效且准确，可见，通过检测东方百合苗期叶片即可分辨花粉有无，从而淘汰有花粉东方百合植株，大大减少工作量。本发明能大大降低了选育无花粉东方百合成本，常规育种周期为7-9年，本发明能缩短到5年，即使用本发明的方法能有效缩短无花粉百合的育种周期，提高育种效率，同时也为大规模开展无花粉百合的商业化运用奠定了一定的技术基础。

本发明具有下列优点和效果：

1、创新的开发出了适用与东方百合特定群体的早期鉴定花粉有无的分子标记，解决了现有技术的无花粉百合须在开花时才能鉴定花粉有无的问题。

2、利用该分子标记能够大大降低无花粉东方百合选育成本，按云南省农业科学院花卉所常规无花粉百合育种方法计算，一个品种的育种成本在8万左右，通过运用本发明可降低成本至5万元左右。

3、通过本发明的方法能提高育种效率，缩短相关的繁育周期，提高了育种效率，同时也为大规模开展无花粉百合的商业化运用奠定了一定的基础。

附图说明

图1为实施例1的凝胶成像拍照记录；

图2为实施例1的人工观察检测雄性不育无花粉（阴性）东方百合植株个体；

图3为实施例1的人工观察检测雄性不育无花粉（阳性）东方百合植株个体。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，下面给出本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于此。

实施例1

a、选取东方百合亲本希伯伦为母本，东方百合马可波罗为父本进行杂交，在2013年7月百合盛花期，选取父本百合花药粒，在不高于25℃的温室大棚中，对母本百合进行人工授粉，授粉后用锡箔纸包裹柱头，防止其他非父本花粉污染母本柱头；

b、当年11月（授粉后约4个月左右），待百合果实自然成熟，蒴果即将开裂时采集果实，收集成熟的种子，自然风干后（约30天），2013年12月种子穴盘种植，种植深度2cm；

c、2014年3月种子发芽后，小心移栽到田间，田间土壤按腐殖质：红土的质量比=1：10配置，当年自然越冬；

d、2015年夏季当植株长出5片叶以上时，采集顶端幼嫩叶片做dna提取使用；本例采集了40棵种子苗的顶端幼嫩叶片；

e、对上述叶子分别采用常规ctab法提取百合叶片dna；

f、采用筛选出的分子标记atp6（1）f、atp6(1)r对后代种子苗进行pcr反应扩增：

atp6(1)f：5’-gaacctggtaaaggaaca-3’

atp6(1)r：5’-atatagctacacctaattccagacc-3’

pcr扩增体系为：总体积为25μl，其中10×buffer（含mg²⁺），2ul；2.5mmdntp，1ul；10umatp6(1)f，1ul；10umatp6(1)r，1ul；dna模板（100ng/ul），2ul；taq酶(25u)，0.5ul；ddh2o，17.5ul；

pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，tm值55.5℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。整个反应过程持续时间约4h；

取5μlpcr产物于1.5％琼脂糖凝胶(含eb0.05％)电泳，于紫外透射反射分析仪观察、凝胶成像系统拍照记录；40棵种子苗的拍照记录如图1所示；

通过不同分子标记（引物）与种子苗dna模板配组，筛选出在种子苗中有明显区别的分子标记，分析差异电泳条带，电泳结果中有条带的判定为有花粉百合，无条带的判定为无花粉百合。从图1中即可得到以下结果：1-15检测阳性，21-40检测阳性，16-20检测阴性；即16-20的种子苗为无花粉百合，其余种子苗为有花粉百合。

验证：种子苗继续田间栽培，2017年7月待种子苗开花后，人工观察验证东方百合花粉育性，如图2和3所示，人工观察结果为：16-20的种子苗为无花粉百合，其余种子苗为有花粉百合；与实施例1的分子标记检测法结果完全相符。

可见，本发明的分子标记检测法有效且准确，即通过检测东方百合特定群体苗期叶片即可分辨花粉有无，从而淘汰有花粉东方百合植株，大大减少工作量。

序列表

<110>云南省农业科学院花卉研究所

<120>一种分子标记检测东方百合特定群体雄性不育的方法

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gaacctggtaaaggaaca18

<210>2

<211>25

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<400>2

atatagctacacctaattccagacc25

序列表

<110>云南省农业科学院花卉研究所

<120>一种分子标记检测东方百合特定群体雄性不育的方法

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