本发明涉及一种提高嗜热链球菌抗逆性的方法及在菌粉制备中的应用，属于食品技术领域。
背景技术：
嗜热链球菌是典型的乳品发酵剂菌种，主要用于酸奶生产。嗜热链球菌通过发酵牛乳产生乳酸、胞外多糖以及特征性风味物质，赋予了酸奶产品独特的质地和风味。
嗜热链球菌菌粉制备通常采用真空冷冻干燥技术，通过优化保护剂配方可以提高冷冻干燥的菌株存活率，同时冷冻干燥存在着生产设备要求高、干燥过程中耗能高、产量低等缺点，这些问题极大地提升了嗜热链球菌菌粉的制备成本。真空干燥、喷雾干燥相比冷冻干燥具有操作简便、设备要求低，生产成本低等优点，但是真空干燥和喷雾也拥有无法制备高存活率菌粉的缺点，因此提升嗜热链球菌干燥存活率显得尤为重要，如何最大程度的提高嗜热链球菌干燥存活率是嗜热链球菌发酵剂制备的关键限制因素。
专利CN201610048481.2、CN201410171384.3、CN201310228122.1等提高嗜热链球菌干燥存活率的方法多集中于保护剂配方的研究，通过糖、蛋白质、盐等物质的筛选来优化干燥保护剂配方从而提高干燥存活率。干燥保护剂配方的优化、干燥工艺条件的改良、微胶囊化技术的应用尽管能一定程度上提高嗜热链球菌干燥存活率，但上述方法的提高程度有限，且操作步骤繁琐，不适于大规模的工业化应用。相比保护剂配方的研究，提升乳杆菌自身抗逆性才是提高嗜热链球菌干燥存活率的根本途径。
研究表明，植物乳杆菌生物膜状态的菌体较浮游状态对各种有机酸、乙醇、次氯酸钠的抵抗力明显提升，即使生物膜被打散重悬，这种提升依旧存在；德氏乳杆菌在形成生物膜后，耐乳酸能力提升，产乳酸能力明显增强，这说明形成生物膜后可显著提高菌体的胁迫耐受性。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服嗜热链球菌干燥存活率低，提供一种高活性、强抗逆性嗜热链球菌菌粉生产工艺，能显著提高嗜热链球菌的干燥存活率和贮藏稳定性，提供一种合适的嗜热链球菌菌粉制备策略。
本发明的第一个目的是提供一种嗜热链球菌菌粉的制备方法，是先制备嗜热链球菌生物膜，再对嗜热链球菌生物膜进行冷冻干燥、真空干燥或者喷雾干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述生物膜是嗜热链球菌菌体细胞形成的有组织的细菌群。
在本发明的一种实施方式中，所述嗜热链球菌菌膜是在含有非水溶性膳食纤维的培养基中培养获得。
在本发明的一种实施方式中，所述非水溶性膳食纤维为纤维素、木质素或半纤维。
在本发明的一种实施方式中，所述非水溶性膳食纤维包括谷物粉、豆粉、果蔬粉、菌菇粉和膳食同源粉剂的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述非水溶性膳食纤维包括燕麦麸皮粉，麦麸粉，玉米糠粉，核桃壳粉，葛根粉，猴头菇粉，木耳粉，菊芋粉的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述非水溶性膳食纤维的含量为10～30g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基含有：酵母粉5～8g/L，牛肉膏5～8g/L，乳糖10～15g/L，胰蛋白胨5～8g/L，大豆蛋白胨5～8g/L，硫酸镁0.2～0.3g/L，甘油磷酸钠15～25g/L，抗坏血酸0.5～1.0g/L，非水溶性膳食纤维10～30g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：(1)将嗜热链球菌接种至含非水溶性膳食纤维的培养基中；(2)于pH5.8～6.2、35～40℃培养18～36h；(3)离心收集菌体；(4)按菌泥：干燥保护剂为1:1～3的质量比向菌泥中添加干燥保护剂，混匀；(5)将步骤(4)的混合物冷冻干燥、真空干燥或者喷雾干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的培养基含有：酵母粉5g/L，牛肉膏5g/L，乳糖10g/L，胰蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨5g/L，硫酸镁0.2g/L，甘油磷酸钠20g/L，抗坏血酸0.5g/L，黄豆粉10g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)将嗜热链球菌活化3代，按照体积比3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，37度恒定pH(pH＝6.5)培养24小时。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)在4℃下对嗜热链球菌生物膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到嗜热链球菌菌泥。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中干燥保护剂配方为：所述保护剂剂配方为：80～120g/L脱脂乳粉、酪蛋白酸钠、大豆蛋白中的至少一种，20～40g/L海藻糖、蔗糖中的至少一种，0～0.5g/L半胱氨酸盐酸盐、维生素C中的至少一种，pH为6.5。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)是将将步骤(4)所得乳化液平铺在平板上，在-38～-40℃预冻3～4h，最后在4～6Pa下冷冻干燥25～35h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)是将步骤(4)所得乳化液平铺在平板上，于室温条件下在-0.1MPa下真空干燥18-24h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)是将将步骤(4)所得菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为130-160℃，出口温度为70-90℃。
本发明的第二个目的是提供应用所述方法制备的菌粉。
本发明的第三个目的是提供所述菌粉在食品领域的应用，所述应用包括嗜热链球菌生物膜菌粉用于发酵生产乳制品。
有益效果：本发明将生物菌膜技术应用于嗜热链球菌的发酵生产中，以非水溶性膳食纤维作为固形界面，使其在固相界面形成菌膜，达到提高自身抗逆性的效果，从而显著提高嗜热链球菌干燥存活率，冷冻干燥存活率可达85％以上，真空干燥存活率最高可达30％以上，喷雾干燥存活率达到35％以上，菌粉活菌数可达到5×1010cfu/g以上。解决了在开发高活性嗜热链球菌菌粉中的关键技术问题。本发明制备的高活性、强抗逆性嗜热链球菌菌粉可用于固体饮料、发酵剂等产品中。
具体实施方式
1、活菌数测定方法：待测样品梯度稀释后，取100微升涂布在固体平板，培养36小时后，计算活菌数，单位cfu/mL。
2、干燥存活率计算方法：，在干燥前测定活菌数为初始菌浓，干燥后，将菌粉用无菌蒸馏水复溶至干燥前体积，测定活菌数为终浓度菌浓，计算干燥存活率。
存活率＝100％×终浓度/初始菌浓
3、菌粉于25℃下存放12周，存活率计算方法：真空干燥后，将菌粉用无菌蒸馏水复溶至真空干燥前体积，测定活菌数为初始度菌浓；菌粉于25℃下存放12周，将菌粉用无菌蒸馏水复溶至真空干燥前体积，测定活菌数为终浓度菌浓。
存活率＝100％×终浓度/初始菌浓
实施例1：嗜热链球菌的冷冻干燥
(1)嗜热链球菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉5g/L，牛肉膏5g/L，乳糖10g/L，胰蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨5g/L，硫酸镁0.2g/L，甘油磷酸钠20g/L，抗坏血酸0.5g/L，非水溶性纤维添加量如表1所示。
(2)嗜热链球菌菌膜的发酵制备：将嗜热链球菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，调整转速，37度恒定pH(pH＝6.5)培养24小时。
(3)嗜热链球菌菌膜的收集：在4℃下对嗜热链球菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到嗜热链球菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/L脱脂乳粉、30g/L海藻糖、30g/L蔗糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。
(5)冷冻干燥：将步骤(4)所得菌悬液在-38～-40℃预冻3～4h，最后在4～6Pa下冷冻干燥25～35h。冷冻干燥后即可获得嗜热链球菌菌粉。
表1非水溶性纤维对嗜热链球菌的冷冻干燥存活率的影响
根据表1可知，黄豆粉添加量对嗜热链球菌的冷冻干燥存活率有很大的影响，黄豆粉添加量在10-30g/L时，嗜热链球菌的冷冻干燥存活率较高在85％以上，25℃下存放12周存活率60％以上，不添加黄豆粉，或黄豆粉添加量较少时，嗜热链球菌的冷冻干燥存活率较低。
实施例2
按照实施例1相同步骤进行操作，区别在于，以葛根粉和核桃壳粉取代黄豆粉和燕麦麸皮粉，进行菌膜发酵，冷冻干燥结果显示，以葛根粉和核桃壳粉为固体介质形成的菌膜冷冻干燥存活率为87％，菌粉活菌数为7×1010cfu/g。将菌粉于25度下存放12周，存活率为60％。
实施例3
按照实施例1相同步骤进行操作，区别在于，将冷冻干燥保护剂替换为：120g/L脱脂乳粉、20g/L海藻糖、20g/L蔗糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。菌膜化嗜热链球菌的冷冻干燥存活率是83％，显著高于非菌膜状态的菌体冷冻干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为56％。
实施例4：嗜热链球菌的真空干燥
(1)嗜热链球菌菌膜发酵培养基制备：
酵母粉5g/L，牛肉膏8g/L，乳糖10g/L，胰蛋白胨4g/L，大豆蛋白胨6g/L，硫酸镁0.25g/L，甘油磷酸钠25g/L，抗坏血酸0.5g/L，黄豆粉10g/L，燕麦麸皮粉10g/L。
(2)嗜热链球菌菌膜的发酵制备：将嗜热链球菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，调整转速，37度恒定pH(pH＝6)培养24小时。
(3)嗜热链球菌菌膜的收集：在4℃下对嗜热链球菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到嗜热链球菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：120g/L脱脂乳粉、30g/L海藻糖、0.5g/L维生素C，pH为6.5。
(5)真空干燥：将步骤(4)所得乳化液进行真空干燥，真空干燥条件为：所得乳化液平铺在平板上，于室温条件下在-0.1MPa下真空干燥18-24h。真空干燥后即可获得嗜热链球菌菌粉。
经检测，菌膜化嗜热链球菌的真空干燥存活率是37％，菌粉活菌数为4×1010cfu/g。将菌粉于25度下存放12周，存活率为49％。
实施例5
按实施例4相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉和燕麦麸皮粉，其余条件与实施例4相同。发酵过程未形成菌膜，经检测，对照组真空干燥存活率小于4％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为29％。
实施例6
按照实施例4相同步骤进行操作，区别在于，以木耳粉取代黄豆粉和燕麦麸皮粉，进行菌膜发酵，真空干燥结果显示，以木耳粉为固体介质形成的菌膜真空干燥存活率为48％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为58％。
实施例7
按照实施例4相同步骤进行操作，区别在于，将真空干燥保护剂替换为：100g/L酪蛋白酸钠、20g/L海藻糖、20g/L蔗糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。菌膜化嗜热链球菌的真空干燥存活率是49％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为61％。
实施例8：嗜热链球菌的喷雾干燥
(1)嗜热链球菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉6g/L，牛肉膏7g/L，乳糖10g/L，胰蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨5g/L，硫酸镁0.3g/L，甘油磷酸钠20g/L，抗坏血酸0.5g/L，黄豆粉10g/L。
(2)嗜热链球菌菌膜的发酵制备：将嗜热链球菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10L发酵罐中，调整转速，37度恒定pH(pH＝6)培养24小时。
(3)嗜热链球菌菌膜的收集：在4℃下对嗜热链球菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到嗜热链球菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/L大豆蛋白、30g/L海藻糖、30g/L蔗糖、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐，pH为6.5。
(5)喷雾干燥：将步骤(3)所得乳化液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：菌悬液以5ml/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，进口温度为150℃，出口温度为80℃。喷雾干燥后即可获得嗜热链球菌菌粉。
经检测，菌膜化嗜热链球菌的喷雾干燥存活率是39％，菌粉活菌数为4×1010cfu/g。将菌粉于25度下存放12周，存活率为61％。
实施例8
按实施例7相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例7相同。结果显示，发酵过程未形成生物膜，喷雾干燥后嗜热链球菌的存活率小于3％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为27％。
实施例9
按照实施例7，以玉米糠粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，喷雾干燥结果显示，以玉米糠粉为固体介质形成的菌膜喷雾干燥存活率为35％，显著高于非菌膜状态的菌体喷雾干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为55％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。