适冷纤维素酶产生菌的制作方法

本发明涉及纤维素酶产生菌，具体地，涉及适冷纤维素酶产生菌与适冷纤维素酶及其制备方法。

背景技术：

纤维素酶包括内切葡聚糖酶(ec3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(ec3.2.1.91)，和β-葡萄糖苷(ec3.2.1.21)三种类型，通过协同作用可以将纤维素完全水解为葡萄糖。其中内切葡聚糖酶主要作用于纤维素的非结晶区，随机切开β-1,4-糖苷键，水解纤维素。外切葡聚糖酶在无定型的纤维素中水解β-1,4-糖苷键，形成可溶的纤维糊精和纤维二糖。β-葡萄糖苷酶可水解非还原末端水解葡萄糖残基，将纤维二糖和纤维素糊精分解成葡萄糖。

目前，大部分研究产纤维素酶的菌株通常取自常规环境，一般是营养较丰富，生态结构较复杂的地方，而获得的产酶菌株往往耐受性不高，易退化。某些独特的极端生态环境地区往往能够孕育具有独特的生理活性的菌株，如果能够在其中筛选到具有特殊性质纤维素酶的菌株，这将有利于大大降低成本，节省资源，同时也将更适合应用于工业生产。

我国青藏高原地区属高原温带，海拔高，气候寒冷干燥，年均降水量为140mm，年平均气温1℃，日夜温差较大。该地区的气候环境比较极端，但其内部分布的山峰、冰川、高山湖泊和高山沼泽等各类生境依然孕育着丰富而奇特的生物资源，近年来该地区逐渐成为科学考察和生态研究的胜地。青藏高原独特的地理环境和气候条件造就了该地区微生物的群落结构及生理特性与其他地区有极大差异，因而对于该地区的产纤维素酶菌株筛选，具有重要的生态效益、经济效益和社会效益，所获得的新型菌株将在食品、饲料和制药等领域有着潜在的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种适冷纤维素酶产生菌与适冷纤维素酶及其制备方法，该适冷纤维素酶产生菌生产的纤维素酶具有适低温、耐酸碱性的特点，有望被应用于生物能源、洗衣纺织、食品发酵、饲料等多个工业领域。

为了实现上述目的，本发明提供了一种适冷纤维素酶产生菌，所述适冷纤维素酶产生菌在中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)的保藏编号为14938，保藏日期为2017年11月20日。

本发明还提供一种适冷纤维素酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)将权利要求1所述的适冷纤维素酶产生菌接种于液体lb(luria-bertani)中培养；(2)将培养所得菌液转接至发酵培养基中进行发酵；(3)将发酵后的菌液进行离心，取上清液。

本发明还提供一种根据前文所述的制备方法制备得到的适冷纤维素酶。

通过上述技术方案，本发明提供的适冷纤维素酶产生菌其分类命名为耐盐刘志恒菌(zhihengliuellahalotolerans)la12，菌株的16srdna基因序列如seqidno1所述，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为：14938。本发明所述的适冷纤维素酶产生菌具有生产纤维素酶的能力，该纤维素酶具有适冷性、耐酸碱的特性，具有广泛的应用前景。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明提供的适冷纤维素酶产生菌的水解纤维素照片；

图2是检测例2中温度对本发明提供的纤维素酶活性的影响；

图3是检测例3中ph对本发明提供的纤维素酶活性的影响；

图4是检测例4中金属离子对本发明提供的纤维素酶活性的影响。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供了一种适冷纤维素酶产生菌，所述适冷纤维素酶产生菌在中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)的保藏编号为14938，保藏日期为2017年11月20日。

本发明提供的适冷纤维素酶产生菌其分类命名为耐盐刘志恒菌(zhihengliuellahalotolerans)la12，菌株的16srdna基因序列如seqidno1所述，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为：14938。

该适冷纤维素酶产生菌通过以下方法筛选得到：(1)选取青藏高原3000-5000米海拔处植被地表以下3-20厘米处土壤，经水溶解、稀释；(2)将稀释后的土壤溶液涂布于纤维素富集培养基上进行培养，以长出菌落点；(3)挑取菌落点于纤维素筛选培养基上培养以长出菌落；(4)对长出菌落的纤维素筛选培养基进行染色、脱色、查验透明圈；(5)筛选出具有水解圈的纤维素筛选培养基上的菌种。在后文的将具体进行说明。

本发明还提供一种适冷纤维素酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)将权利要求1所述的适冷纤维素酶产生菌接种于液体lb(luria-bertani)中培养；(2)将培养所得菌液转接至发酵培养基中进行发酵；(3)将发酵后的菌液进行离心，取上清液。

本发明所述的适冷纤维素酶产生菌具有生产纤维素酶的能力，该纤维素酶具有适冷性、耐酸碱的特性，按照上述技术方案培养发酵前文所述的适冷纤维素酶产生菌即可制备得到适冷纤维素酶，制备方法简单，易于实施。

在本发明一种优选的实施方式中，为了提高适冷纤维素酶产生菌的产量，优选地，液体lb的配方为：相对于1000ml的水，酵母粉4-6g，氯化钠8-12g，蛋白胨8-11g，ph为7.2-7.6。

在本发明一种优选的实施方式中，为了提高适冷纤维素酶产生菌的产量，优选地，步骤(1)中培养条件为：于24-30℃转速为100-300rpm的条件下培养18-36小时。

在本发明一种优选的实施方式中，为了提高适冷纤维素酶产生菌的产量，提高发酵效率，优选地，步骤(2)中菌液与发酵培养基的体积比为2-3:100。

在本发明一种优选的实施方式中，为了提高适冷纤维素酶产生菌的产量，提高发酵效率，优选地，发酵培养基的配方为：相对于1000ml的水，酵母粉4-6g，氯化钠8-12g，蛋白胨8-11g，羧甲基纤维素钠0.4-0.6g，ph为7.2-7.6。

在本发明一种优选的实施方式中，为了提高适冷纤维素酶产生菌的产量，提高发酵效率，优选地，步骤(2)中发酵条件为：于24-30℃转速为100-300rpm的条件下培养40-50小时。

在本发明一种优选的实施方式中，为了提高适冷纤维素酶的提取率，优选地，步骤(3)中离心的条件包括：于2-6℃条件下以3000-5000rmp转速离心20-30min。

本发明还提供一种根据前文所述的制备方法制备得到的适冷纤维素酶。

该适冷纤维素酶具有适冷性、耐酸碱的特性，具有广泛的应用前景。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

1、适冷纤维素酶产生菌的筛选

选取青藏高原4000米海拔处植被周围样点，采集地表以下5至10厘米处土壤。称取土壤样品1g，添加到一个盛有99ml的无菌水、并且带有玻璃珠的三角瓶中，将土壤样品充分溶解、混匀，从而成10^-2稀释液，然后再按10倍稀释法依次添加无菌水稀释成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的稀释液。取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的稀释液各0.1ml涂布于纤维素富集培养基平板上，置入25℃恒温培养箱中倒置培养2天。纤维素富集培养基：cacl20.1g，mgso40.1g，(nh4)2so42.0g，kh2po40.5g，k2hpo42.0g，nacl6g，琼脂1.5％，羧甲基纤维素钠0.5％，蒸馏水1000ml，ph调节至7.0，于121℃，0.11mpa下灭菌30分钟备用。

灭菌牙签挑取生长良好的菌落点于纤维素筛选培养基平板上，置于25℃恒温培养箱中培养3天。待长出菌落后，向平板中加入适量1mg/ml的刚果红染液，染色10分钟，倒去染液，再加入适量1mol/l的nacl溶液，浸泡5分钟进行脱色处理，依据透明圈有无和大小来判断和选择，结果见图1。

2、适冷纤维素酶产生菌的分子鉴定

采用天根生化科技(北京)有限公司的tianampbacteriadnakit提取细菌基因组dna，取5ml菌液，于10000rpm下离心收集菌体，弃去上清。将200μl缓冲液ga、20μlproteinasek溶液、220μl缓冲液gb、500μl缓冲液gd、600μl漂洗液pw、50μl的蒸馏水按照要求依次加入，获得菌株la1基因组dna。

以待测菌株的基因组dna为模板，进行16srdna扩增(94℃变性3分钟，94℃解链30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，重复2-4步骤反应30个循环，72℃延伸8分钟。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，使用tiangen琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收pcr产物，送至金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定。将获得的16srdna序列提交blast程序在genbank中进行序列比对，分析该菌株的分子生物学分类地位。结果发现，菌株的16srdna基因序列如seqidno.1所述，该适冷纤维素酶产生菌分类命名为耐盐刘志恒菌(zhihengliuellahalotolerans)la1。

实施例1

利用接种环将la1菌株(本发明的适冷纤维素酶产生菌)接种于20ml液体lb(酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，蒸馏水1l，ph调节至7.4)中，于28℃180rpm摇床中培养24小时。将所得菌液按2％接种量转接至装有发酵培养基(酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，羧甲基纤维素钠0.5g，蒸馏水1l，ph调节至7.4)的三角瓶中，于28℃180rpm摇床中培养48小时。发酵结束后，取发酵液于4℃条件下4000rmp转速离心30分钟，收集上清作为酶液备用。

实施例2

利用接种环将la1菌株(本发明的适冷纤维素酶产生菌)接种于20ml液体lb(酵母粉4g，氯化钠8g，蛋白胨8g，蒸馏水1l，ph调节至7.2)中，于30℃300rpm摇床中培养36小时。将所得菌液按3％接种量转接至装有发酵培养基(酵母粉4g，氯化钠8g，蛋白胨8g，羧甲基纤维素钠0.4g，蒸馏水1l，ph调节至7.6)的三角瓶中，于30℃300rpm摇床中培养50小时。发酵结束后，取发酵液于6℃条件下5000rmp转速离心20分钟，收集上清作为酶液备用。

实施例3

利用接种环将la1菌株(本发明的适冷纤维素酶产生菌)接种于20ml液体lb(酵母粉6g，氯化钠12g，蛋白胨11g，蒸馏水1l，ph调节至7.6)中，于24℃100rpm摇床中培养18小时。将所得菌液按2％接种量转接至装有发酵培养基(酵母粉6g，氯化钠12g，蛋白胨11g，羧甲基纤维素钠0.6g，蒸馏水1l，ph调节至7.6)的三角瓶中，于24℃100rpm摇床中培养40小时。发酵结束后，取发酵液于2℃条件下3000rmp转速离心25分钟，收集上清作为酶液备用。

检测例1

适冷纤维素酶的活性测定

1、葡萄糖浓度标准曲线的制定

分别取不同体积的1mg/ml的葡萄糖溶液，加入蒸馏水至总体积为1ml，得到一系列不同浓度的葡萄糖溶液。将1mldns溶液分装至各管中，混匀，煮沸5min后置于冷水中数分钟，向各管反应液中加入蒸馏水至10ml。于540nm下测吸光值。利用所得数据，绘制葡萄糖标准曲线。

2、标准条件酶活测定

分别取0.5mlph5.0的1.0％的羧甲基纤维素钠溶液和实施例1-3中得到的酶液，30℃水浴反应60min。反应结束后加入1mldns。沸水浴5min后进行冷却，再加入8ml蒸馏水稀释反应液，于540nm测定吸光值。对照组不加酶液，反应结束后加入0.5ml酶液和100mldns试剂，之后重复之前的步骤。以葡萄糖作标准溶液，以每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量作为一个酶活单位，再计算出该纤维素酶的酶活力。

结果该菌株产酶活力为0.3u/ml，可见本发明的适冷纤维素酶具有一定的水解纤维素活力。

检测例2

参照检测例1中酶活测定方法测定酶的最适温度，分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下添加酶液测定酶活，计算各反应体系相对酶活力。结果见图2，由图2可见，该酶的最适反应温度为35℃。

检测例3

参照检测例1酶活测定方法测定酶的最适ph，用ph2-11的不同缓冲液稀释酶液，并测定其活力，计算各反应体系相对酶活力，结果见图3。由图3可见，该酶的最适反应ph为5.0。

检测例4

参照检测例1酶活测定方法测定各种金属离子对酶活力的影响，向酶液中分别加入不同的离子，包括k⁺、li⁺、nh4⁺、cu²⁺、co²⁺、rb²⁺、mg²⁺、ca²⁺、zn²⁺、mn²⁺、sds、t-100、edta，使其终浓度为1mmol/l，同时以未处理的酶液作为对照，在酶反应的最适温度和最适ph值条件下测定各离子对酶活力的影响，计算各反应体系相对酶活力，结果见图4。由图4可见，该酶对大部分金属离子和化学试剂具有耐受性。

上述检测结果表明，本发明适冷纤维素酶产生菌所生产的纤维素酶具有适冷性、耐酸碱的特性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110>安徽师范大学

<120>适冷纤维素酶产生菌

<130>05760

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1512

<212>dna

<400>1

agagtttgatcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaac60

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