【技术领域】
本发明涉及一种溶栓酶的制备方法及豆类发酵制品的深加工领域，尤其是一种紫芝黑豆溶栓酶的制备方法。
背景技术：
紫芝，真菌的一种。似灵芝。应用范围非常广泛，无论心、肺、肝、脾、肾脏虚弱，均可服用。紫芝所治病种涉及呼吸、循环、消化、神经、内分泌及免疫等各个系统；涵盖内、外、妇、儿、五官各科疾病。紫芝化学成分为子实体及菌丝体，含蛋白质、氨基酸、糖类、香豆素、甾体及三萜化合物。子实体并含油脂、蜡、挥发性及升华性物质。性淡、温，味稍苦，能补中强智、宁心益胃，用于神经衰弱、失眠、胃痛、消化不良、解菌毒，有一定的抗癌作用。
黑豆为豆科植物大豆(学名：glycinemax(l.)merr)的黑色种子。黑豆又名橹豆、黑大豆等。黑豆具有高蛋白、低热量的特性，外皮黑，里面黄色或绿色。黑豆性喜温暖，耐高温，生育适温18～30度，播种法繁殖以颗粒大而饱满、色泽乌黑发亮者为佳。根据中国科学家的一项研究发现，黑豆防老抗衰，药食俱佳，它与黄豆同属大豆类，黑豆皮提取物能够提高机体对铁元素的吸收，带皮食用黑豆能够改善贫血症状。
目前，血栓栓塞性疾病，如脑血栓、心肌梗塞、冠心病、肢体血管栓塞等的发病率呈上升趋势，其致残率和死亡率都很高，是危害人类健康和生命的主要疾病之一。造成血栓栓塞性疾病的主要原因之一是由于血管内形成血栓。
治疗血栓栓塞性疾病的主要方法有手术、服用抗凝剂、注射溶栓剂等三种方法。目前，临床上所用的溶栓剂主要是链激酶和尿激酶，但这两种药物都具有局限性：链激酶。人体内易产生链激酶抗体，因此存在拮抗作用，不但用量不好控制，而且还有副作用；尿激酶虽然无明显的抗原性，但因尿激酶不稳定、活性难以控制，容易引起大出血或者因失活而起不到溶解血栓的作用。
技术实现要素：
本发明提供一种应用于治疗血栓栓塞性疾病的紫芝黑豆溶栓酶的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供的紫芝黑豆溶栓酶的制备方法，包括以下步骤：
包含紫芝黑豆的固态发酵过程和酶的分离纯化过程；
其中，紫芝黑豆的固态发酵过程包括：
①菌种活化
将紫芝菌丝体均匀涂布在斜面培养基表面培养；
②种子培养
将黑豆匀浆加水煮沸，制成种子培养基，将步骤①中获得的活化紫芝菌种接种至种子培养基摇瓶培养；
③将黑豆制成固体发酵培养基；
④发酵产酶
将步骤②获得的种子培养基接种至步骤③获得的固体发酵培养基获得固体发酵物料；
酶的分离纯化过程包括：
i、酶的分离
取紫芝黑豆的固态发酵过程中获得的固体发酵物料，加入0.1～0.2mol/l、ph7～8的磷酸钠缓冲液从发酵物料中提取酶，其液比是1∶3～6，搅拌2～4小时后，离心、取上清液为粗酶液；
ii、酶的纯化
将步骤i获得的粗酶液进行sephadexg-50柱层析和cmc离子交换柱层析，用离子强度ph线性梯度洗脱，收集具有溶栓酶活性的洗脱液部分，获得纯化的紫芝黑豆溶栓酶。
进一步地，所述紫芝黑豆的固态发酵过程步骤①中的菌种活化斜面培养基由下列物质按重量份组成：马铃薯200重量份，胡萝卜200重量份，琼脂20重量份，蛋白胨1.2重量份，葡萄糖21重量份，磷酸二氢钾0.4重量份，硫酸镁0.18重量份，维生素b1少许。
进一步地，所述紫芝黑豆的固态发酵过程步骤②中的种子培养基由下列物质按重量份组成：黑豆50重量份，小米10重量份，蔗糖20重量份，硫酸镁0.5重量份，蛋白胨5重量份，葡萄糖10重量份，磷酸二氢钾1.5重量份，氯化钙0.22重量份。
进一步地，所述紫芝黑豆的固态发酵过程步骤③中的固体发酵培养基由下列物质按重量份组成：黑豆100重量份，小米30重量份，蔗糖2.8重量份，葡萄糖2.8重量份，氯化钙0.5重量份，磷酸二氢钾1.5重量份，硫酸镁0.5重量份，蛋白胨0.3重量份，酵母膏0.5重量份。
进一步地，所述紫芝黑豆的固态发酵过程步骤①接种后菌种活化培养时间为7-8天。
进一步地，所述紫芝黑豆的固态发酵过程步骤②在种子培养基阶段，先将黑豆、小米加少许水匀浆，再配以其他料加水至1000ml，煮沸，接种后摇瓶发酵培养8天。
进一步地，所述紫芝黑豆的固态发酵过程步骤③中采用的黑豆经去皮、沥干的过程获得。
进一步地，所述黑豆的泡涨条件为：夏季在温度25-35℃的条件下浸泡5～7小时，冬季在温度20-25℃的条件下浸泡7～9小时。
进一步地，所述紫芝黑豆的固态发酵过程步骤④中发酵产酶时，在26～28℃和相对湿度为≤75％的前提条件下，发酵培养13～15天，产酶量最高。
本发明的优点：
本发明使用的发酵设备简单，易操作；以紫芝为生产菌株，以黑豆为培养基，采用固态发酵的方法，其紫芝溶栓酶有强烈的溶血栓活性，活性中心存在丝氨酸残基，为丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶属，是一种新发现的溶栓酶，具有提高免疫力的功效，并适用于免疫力低及其引起的症状。
应用于食品行业中，对于中度或者重度的免疫力低下患者，通过食疗药膳的方法解决所存在的症状，易于被接受，不需要影响生活习惯，且可以长期使用无副作用，解决了因治疗过程麻烦而导致难以坚持的问题。取材经济，所涉及的原料都寻常材料，价格也便宜，即方便广大工薪阶级人士自制使用，且选用无副作用的原料，可以坚持食用。特别适合一些中老年人饮用，对于其他人群也非常适用。
经酶学性质研究和溶血实验验证，本发明紫芝黑豆溶栓酶具有强烈的溶血栓活性，为丝氨酸蛋白酶，属胰蛋白酶类。该酶液在40℃、15min、ph6～8活性基本不变，最适温度40～45℃、最适ph6～8，该酶活性受二价锰离子、铜离子抑制，二价铁离子对酶活性有激活作用，二价钙离子、镁离子对酶活性无明显影响。
【具体实施方式】
本发明的紫芝黑豆溶栓酶的制备方法，以紫芝为生产菌种，以黑豆为培养基，采用固态发酵的方法，从紫芝黑豆中制备溶栓酶。
本发明的紫芝黑豆溶栓酶制备方法，包括紫芝黑豆的固态发酵过程和溶栓酶的分离纯化过程。
实施例1
紫芝黑豆的固态发酵过程
1)、菌种活化：
菌种活化培养基(g/l)：马铃薯为200，胡萝卜200，琼脂20，蛋白胨1.2，葡萄糖21，磷酸二氢钾0.4，硫酸镁0.18，在121℃灭菌30分钟后制成斜面，接种紫芝后在26℃温度下培养为7-8天；
2)、种子培养基制备：
种子培养基(g/l)：黑豆50，小米10，蔗糖22，硫酸镁0.5，蛋白胨5，葡萄糖10，磷酸二氢钾1.5，氯化钙0.22；先将黑豆、小米加少许水匀浆，再配以其他料加水至1000ml，煮沸，接种斜面后在26℃温度下摇瓶发酵培养8天；
3)、发酵培养：
发酵培养基(g)：黑豆100，小米30，蔗糖2.8，葡萄糖2.8，氯化钙0.5，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.5，蛋白胨0.3，酵母膏0.5，发酵产酶时，以泡胀、去皮、沥干的精选黑豆为培养基，接种种子培养基，在26～28℃、相对湿度为≤75％发酵培养13～15天，产酶量最高；
溶栓酶的分离纯化过程
采用0.1～0.2mol/l、ph7～8的磷酸钠缓冲液从发酵物料中提取酶，其液比是1∶3～5，搅拌2～3小时后离心取上清液为粗酶制剂，该粗酶制剂经sephadexg-50柱层析、cmc离子交换柱层析用离子强度ph线性梯度洗脱，洗脱液为部分纯化酶液，该酶液在40℃、15min、ph6～8活性基本不变，最适温度40～45℃、最适ph6～8，该酶活性受二价锰离子、铜离子抑制，二价铁离子对酶活性有激活作用，二价钙离子、镁离子对酶活性无明显影响。
其中，在步骤3)中，将发酵后的固体发酵物料在45℃以下热风干燥，磨碎，过80目的筛；同时，将发酵后物料匀浆、离心、喷雾干燥，瞬时高温130℃～150℃，受热时间5～7秒，喷雾压力0.15pa，出口温度80～90℃，制得喷雾干燥粉。
实施例2
实施例2与实施例1不同的地方在于：所述紫芝黑豆的固态发酵过程步骤1)中菌种活化培养基还包括添加了维生素b1少许。
本发明以紫芝为生产菌株，以黑豆为培养基，采用固态发酵的方法，其紫芝溶栓酶有强烈的溶血栓活性，活性中心存在丝氨酸残基，为丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶属，是一种新发现的溶栓酶，具有提高免疫力的功效，并适用于免疫力低及其引起的症状。本饮品无任何添加剂，保留了黑豆的营养成分，特备是黑豆蛋白质，又增加了一定的增强肠道功能和解毒作用。
以上所述实施例只是为本发明的较佳实施例，并非以此限制本发明的实施范围，除了具体实施例中列举的情况外；凡依本发明之原理所作的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围内。